不同宿主来源的α-环糊精葡萄糖基转移酶分离纯化及化学修饰提高其热稳定性

研究了不同宿主来源的α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT)经化学修饰后的热稳定变化,首先通过阴离子交换和疏水色谱分离纯化了来源于Paenibacillus macerans的天然α-CGT酶以及来源于Escherichia coli和Bacillus subtilis的重组α-CGT酶,再将α-CGT酶置于50℃水浴30min测残酶活,发现α-CGT酶残酶活分别为28%,30%和25%。首次采用戊二醛交联的方法研究了化学修饰对提高重组α-CGT酶稳定性的影响,E.coli重组表达的α-CGT酶经戊二醛交联成大分子聚合物后,与对照相比50℃水浴30 min后酶的热稳定性明显提高,水浴后仍有78%的酶活,酶活保有率相对未交联的酶提高了2.9倍。     

磷脂酶的CC-mPEG化学修饰对其稳定性的影响

采用氰尿酰氯活化的单甲氧基聚乙二醇(CC-mPEG)为修饰剂,对磷脂酶A1(PLA1)进行化学修饰,以期提高其稳定性和催化效率。结果表明,当CC-mPEG与PLA1的摩尔比为10,修饰酶(MPLA1)的修饰率为14%时,MPLA1的热稳定性、p H稳定性、贮藏稳定性和催化效率较PLA1均有提高。     

草酸脱羧酶的修饰及其对草酸钙的吸附研究

为了提高草酸脱羧酶(OXDC)的适用性及其对草酸钙的吸附性能,本实验采用乙二胺四乙酸二酐(EDTAD)对草酸脱羧酶进行了化学修饰,通过高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS)测定其修饰位点,并研究和对比了酶在修饰前后对草酸钙的吸附差异,采用动力学和热力学吸附模型对吸附实验的结果进行拟合分析。实验结果表明,EDTAD成功修饰在草酸脱羧酶上,修饰位点位于肽N端的α-氨基上;且修饰酶(EDTAD-OXDC)对草酸钙的吸附作用,在酶初始浓度为5 mg/m L,p H为7.0,温度为37℃的条件下,比原酶(OXDC)提高了53.37%。结论:经EDTAD修饰后的草酸脱羧酶,其稳定性和吸附性能均有所提高。     

木聚糖酶热稳定性化学修饰研究

采用不同化学修饰剂对毕赤酵母工程菌所产的木聚糖酶进行化学修饰,结果发现用聚乙二醇(diamino-PEG)对酶进行的化学修饰,提高了酶的热稳定性。通过对化学修饰木聚糖酶条件的优化,最终确定了修饰反应体系中,木聚糖酶、diamino-PEG和偶联剂(EDAC/NHS试剂)的摩尔比为1∶1 000∶100。该修饰反应得到的修饰酶,在55℃保温10 min后,残余酶活力为61.6%,比原酶提高了29.1%,通过对酶学性质的分析,发现修饰酶只有pH稳定性、热稳定性发生了改变。     

玉米SOD的纯化与化学修饰

本文利用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤初步分离了玉米SOD,利用金属螯合亲和层析纯化了SOD。比活为8597,纯化倍数为307,回收率为29.4%,电泳后活性染色与蛋白染色均得到3个条带,达到了电泳纯。针对SOD稳定性较差的缺陷,进行了PEG修饰SOD研究。修饰率46%,SOD活性保持度为81%。修饰后的玉米SOD的温度稳定性、pH稳定性均明显提高,与天然SOD相比,PEG-SOD的胰蛋白酶酶切耐受性明显增强。结果表明,PEG修饰玉米SOD是可行的,PEG是一种较好的SOD化学修饰剂。     

沙棘SOD结构修饰及性质研究

研究沙棘SOD纯化和化学修饰的效果。用沙棘原果为材料,经透析膜进行纯化SOD,选用月桂酸对沙棘SOD进行化学修饰,最后分别对天然SOD和修饰后SOD做热稳定性、抗酶解性、抗酸碱性和金属离子影响的研究。研究结论表明:修饰后SOD的热稳定性与pH稳定性均明显提高。与天然SOD相比,修饰后的蛋白酶酶切耐受性明显增强,同时金属离子对修饰后的SOD影响也较天然SOD不同。     

多黏芽孢杆菌产ɑ-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性表达及其转化产物特异性研究

通过设计简并引物,从Paenibacillus macerans YLW菌株中克隆到其α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)基因,构建重组质粒α-CGTase-p ET28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),得到重组菌株α-CGTase-p ET28a/BL21(DE3)。在16℃,1m M IPTG条件下诱导15 h,实现了α-CGTase的可溶性表达,胞内酶活达到10046U/m L,是野生菌株胞外酶活的3.25倍。经镍柱一步法亲和纯化α-CGTase后,酶蛋白纯化了6.05倍,酶收率28.82%,通过SDS-PAGE检测获得表观电泳纯酶蛋白。酶催化转化实验表明:重组α-CGTase酶转化质量分数为5%的马铃薯淀粉15 h后,环糊精的总转化率可达40.7%,转化生成α-CD,β-CD,γ-CD比例分别为:43.6%、41.8%和14.6%。该重组酶对α-CD具有较好的转化专一性,通过转化条件的进一步优化将具有非常好的产业化开发前景。     

葡聚糖修饰米根霉脂肪酶条件优化及其稳定性研究

采用经高碘酸钠活化的葡聚糖修饰米根霉脂肪酶,以获得具有较高酸解催化活性的脂肪酶。研究反应时间、反应pH值、还原剂浓度及葡聚糖质量分数对化学修饰效果的影响,并利用Box-Behnken设计法及响应面优化法对米根霉脂肪酶的化学修饰条件进行优化,当反应pH值为7.63、反应时间为15.53 h、还原剂浓度为0.20 mol/L、葡聚糖质量分数为0.3%时,脂肪酶酸解率可达到最高值37.28%。在40 ℃最适温度条件下,修饰酶的活性是原酶的2.2 倍,且经化学修饰后脂肪酶的稳定性有显著提高。     

丁二酸酐修饰对枯草芽孢杆菌氨肽酶结构及酶学特性的影响

采用丁二酸酐(SA)对经硫酸铵盐析和截留相对分子质量30 000的超滤膜分离提取后的氨肽酶(AE)在优化条件下进行化学修饰,SA对AE的平均氨基修饰率为55.86%,酶活保留率为105.81%;修饰后的氨肽酶紫外吸收光谱发生一定红移,圆二色谱分析其二级结构中无规卷曲比例有一定的增加,α螺旋、β折叠以及β转角的含量有所下降,说明修饰后的氨肽酶空间构象有一定改变;修饰后的氨肽酶,70℃保温5 h后仍然能保留70%以上的活性,与修饰前同等条件下酶活残留35%相比,其热稳定性显著提高。修饰后的氨肽酶动力学参数Km从1.0 mmol/L降低到0.75 mmol/L,表明其对底物的亲和力有明显的提高。此外,修饰后的氨肽酶最适温度和最适pH值也有一定的变化。结果表明SA化学修饰是一种可明显提高枯草芽孢杆菌氨肽酶与底物的亲和力及其热稳定性的有效方法。     

单甲氧基聚乙二醇修饰中性蛋白酶的制备及特性研究

采用氰脲酰氯活化的单甲氧基聚乙二醇(mPEG5000)对中性蛋白酶进行化学修饰,研究其酶学性质及在非水相中的稳定性。结果表明,中性蛋白酶经mPEG5000修饰后,最适温度仍为50℃,与游离酶一致;其相对活性呈现出修饰率依赖性;修饰酶的热稳定性、底物亲和力均较游离酶有较大改善,且在多种有机溶剂体系中表现出更强的稳定性。表明mPEG5000修饰后的中性蛋白酶在多种不利条件下的耐受性得到提高,为其在非水相催化领域的应用提供了研究基础。     

一株深海来源苏云金芽孢杆菌SWJS07所产蛋白酶的分离纯化及性质研究

利用超滤、硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析、Sephadex G-75分子筛柱层析对一株南海深海来源菌苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)SWJS07所产蛋白酶进行分离纯化,纯化后经SDS-PAGE鉴定达到电泳纯,相对分子质量为37.0 k Da,酶的比活力提高了6.39倍,回收率为37.14%。研究其酶学性质表明,该蛋白酶最适催化温度为55℃,在30℃~45℃下稳定性较高,保温300 min残留酶活在80%以上;最适p H 6.5,在p H 6.0~9.0蛋白酶稳定,4℃放置24 h残留酶活在80%以上;2 m M Ca2+、Mn2+对蛋白酶有不同程度的激活作用,而Hg2+、Cd2+、Al3+则强烈地抑制蛋白酶活;当在蛋白酶中添加2 m M Ca2+、Mn2+时,其最适催化温度分别为60℃和55℃,蛋白酶活分别提高了32.86%和28.35%,60℃保温30 min相对酶活基本保持不变,与纯酶(相对酶活残留21.02%)相比蛋白酶的热稳定性显著提高;EDTA-Na2可强烈抑制蛋白酶活,推测该蛋白酶属于金属蛋白酶。     

聚乙烯醇和海藻酸钠固定化柚苷酶的制备及其性质

以聚乙烯醇、海藻酸钠为载体,固定化柚苷酶;以戊二醛为交联剂,考察固定化工艺条件对酶活的影响,研究固定化酶的部分酶学性质。用高效液相色谱法分析柚苷酶的α-L-鼠李糖苷酶和柚苷酶活力,结果表明:最佳载体组合为11%聚乙烯醇与0.5%海藻酸钠;当缓冲液p H 4、戊二醛含量1%、交联时间0.5 h、吸附时间3 h、加酶量141 U/m L、硼酸4%、Ca Cl21%时,固定化酶活力达到最大值。柚苷酶固定化后,α-L-鼠李糖苷酶和柚苷酶活力的最适温度提高5℃,最佳活性p H值提高1.0,p H稳定性基本不变,温度稳定性下降5℃。α-L-鼠李糖苷酶、柚苷酶的米氏常数(Km)固定化后都增大;α-L-鼠李糖苷酶的最大反应初速度(Vmax)经固定化后减小,柚苷酶的Vmax增大。将固定化柚苷酶重复使用7次后,它的α-L-鼠李糖苷酶和柚苷酶残余活力分别保持71%与80%。     

薤白多糖的酶法修饰及其抗氧化活性

为探讨薤白多糖酶法修饰的最佳条件,以及酶法修饰提高薤白多糖活性的可能性,采用α-淀粉酶对醇沉法得到的薤白多糖和柱层析纯化的3种分级薤白多糖进行酶法修饰,以O2-·清除率为响应值,应用响应面分析法对α-淀粉酶修饰薤白多糖的工艺进行优化,用邻苯三酚自氧化法测定修饰产物的抗氧化活性。结果表明,对修饰多糖抗氧化活性的影响因素从大到小依次为:加酶量、酶解温度、酶解p H;α-淀粉酶修饰薤白多糖的最优工艺条件为:加酶量263U/g,酶解温度45℃、酶解p H 5.8,在此条件下O2-·清除率预测值为80.13%,验证值为80.16%,结果重现性好,可用于实际预测。抗氧化试验表明,酶法修饰能提高薤白多糖的抗氧化活性。     

多聚赖氨酸对双亚基肌酸酶表面的修饰

利用多聚赖氨酸(poly-lysine)对同源二聚体肌酸酶进行化学修饰,研究该法对酶稳定性的影响。选用L_9(3~4)正交试验方案,研究不同修饰条件对修饰酶的催化效率和热稳定性的影响,确定多聚赖氨酸修饰肌酸酶(CRE)的最佳条件为CRE-COOH与poly-lysine-NH_2、EDC的摩尔比分别为1∶100和1∶10,pH为7.0。通过SDS-PAGE鉴定,探测多聚赖氨酸可在酶分子表面产生共价结合。修饰酶的催化动力学参数Km和kcat分别为4.75×10~(-2)mol/L和2.50×10~2S~(-1)。与游离酶相比,修饰酶的热稳定性和pH稳定性均明显提高。修饰酶比游离酶的Tm值高了2.07℃,当pH值为4.0和10.0时,修饰酶的酶活力仍保留在50%以上,而游离酶活性几乎丧失。进一步优化研究表明,多聚赖氨酸表面修饰法有可能成为有效提高肌酸酶稳定性的一种方法。     

聚乙二醇定点修饰β-乳球蛋白谷氨酰胺残基条件优化及其对蛋白抗原性的影响

采用谷氨酰胺转氨酶(TG酶)催化聚乙二醇(PEG)定点修饰技术对β-乳球蛋白(β-LG)的谷氨酰胺残基进行修饰,探究其对蛋白抗原性的影响。通过SDS-PAGE结合凝胶过滤色谱对修饰产物的修饰率进行分析,通过优化得最佳修饰条件为pH 7.0,温度25℃,β-LG与PEG摩尔比1:15,TG酶与β-LG质量比3:1,缓冲液中乙醇添加量25%(体积分数),该条件下修饰率为60.17%。采用阳离子交换色谱对修饰产物进行分离纯化,SDS-PAGE分析显示,纯化得到的修饰产物表观分子量在28kDa左右,为PEG单修饰产物。反相高效液相色谱分析结果表明,修饰产物均一,无其它位置异构体存在。间接竞争ELISA测定结果表明,经PEG修饰后β-LG的抗原性显著降低,降低率为59.04%。     

有机溶剂对多聚半乳糖醛酸酶催化动力学的影响

以水溶性低分子质量壳寡糖作为修饰剂对已纯化的多聚半乳糖醛酸酶进行化学修饰,得到化学修饰酶。再以有机溶剂甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃为效应物,果胶为反应底物,研究其在缓冲液和不同有机溶剂中多聚半乳糖醛酸酶(PG)及其化学修饰酶(COS-PG)的动力学性质。结果表明：修饰后,在缓冲液中COS-PG的Km值有所下降,Vmax上升。在2%的甲醇、乙醇处理后,PG和COS-PG的Km和Vmax均下降。在2%四氢呋喃处理后,PG和COS-PG的Km和Vmax均上升。在2%丙酮处理后,PG和COS-PG的Km上升,而Vmax下降。     

磷脂酶的CC-mPEG化学修饰条件优化及其酶学性质影响

以氰尿酰氯活化的单甲氧基聚乙二醇(CC-mPEG)为修饰剂,研究修饰条件对磷脂酶A1(PLA1)修饰率和酶活力的影响以及修饰前后酶学性质的变化。结果表明:当修饰条件为温度25℃、修饰时间2 h、摩尔比10时,修饰酶(MPLA1)的修饰率为14.3%,酶活力保留了90.4%,与修饰前的PLA1相比,MPLA1的热稳定性和贮藏稳定性均有所提高,催化效率提高了1.73倍。     

壳寡糖修饰多聚半乳糖醛酸酶优化条件研究

以水溶性低分子量壳寡糖作为修饰剂对已纯化的多聚半乳糖醛酸酶进行化学修饰,通过单因素试验和正交试验探讨pH值、温度、修饰时间、壳寡糖的用量等因素对修饰效果的影响和最佳修饰条件的优化筛选.结果表明,通过正交试验筛选出最佳修饰反应条件为:80 mg活化的多聚半乳糖醛酸酶,反应体系中pH为4.0,反应温度为3℃,反应时间为12h,壳寡糖用量为150 mg,修饰效果最佳.利用此条件对多聚半乳糖醛酸酶进行化学修饰具有显著的激活作用,修饰后酶的比活力是340.10 U/mg protein,比修饰前提高了153.42％.     

白地霉红枣果胶酶的分离纯化及酶学性质的研究

为了得到专用于红枣浓缩汁的果胶酶制剂,通过硫酸铵盐析、Sephadex G-75凝胶过滤层析、DEAE-Sephadex A-50阴离子交换层析技术对白地霉发酵产得果胶酶粗酶液分离纯化,得到电泳纯的果胶酶,并研究了其相关的酶学性质。结果表明:发酵上清液经三步分离纯化后比活力达到8036.34 U/mg,纯化倍数为3.12,回收率37.22%,SDS-PAGE电泳检测分子质量为59.62 ku。最适的作用温度为50℃,p H为6。在低于50℃保温2 h酶活剩余80%以上,60℃保温1 h酶活损失60%;p H稳定范围较窄,在p H(5~7)范围内稳定性较好。Ca~(2+)、Mg~(2+)、K~+对果胶酶有激活效应,尤以Ca~(2+)(180.29%)最为突出,Mn~(2+)、Ag~+、Fe~(3+)对果胶酶有抑制作用,其中Ag~+(44.52%)抑制效果显著。通过Lineweave-Burk作图法得到K_m=8.75 mg/m L,V_(max)=60.24μg/min·m L,表明果胶酶对底物具有较强的亲和力。     

米曲霉(Aspergillus oryzae FAFU)淀粉酶的分离纯化及其酶学性质研究

从米曲霉(Aspergillus oryzae FAFU)发酵产物中提取淀粉酶,通过硫酸铵盐析、透析、DEAE-Sepharose离子交换层析和Sephacryl S-200凝胶柱层析等纯化步骤,回收活性组分,结合十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行纯度鉴定,共分离纯化出3种酶:酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ。通过酶解淀粉实验,酶解产物经薄层层析(TLC)分析,鉴定出酶Ⅰ、酶Ⅱ为液化酶,酶Ⅲ为糖化酶,经SDS-PAGE电泳确定分子量大小分别为:48.6、49.7、93.5 k Da。对酶Ⅰ、酶Ⅱ的酶学性质进行初步的探究:酶Ⅰ的最适反应温度为50℃,温度在50℃以下稳定性好,55℃的半衰期是40 min,最适反应p H为6.0,在p H7.2~9.6范围内稳定性好;酶Ⅱ的最适反应温度为50℃,温度在45℃以下稳定性好,50℃的半衰期是30 min,最适反应p H为6.6,在p H8.6~10.0范围内稳定性好。