多光谱学与分子模拟技术表征甜菜苷与乳清蛋白的相互作用

为研究甜菜苷（Betanin）与乳清分离蛋白（Whey protein isolate, WPI）的相互作用及乳清分离蛋白对甜菜苷热稳定的影响，本文通过自组装法构建了WPI-Betanin复合物，利用紫外可见光谱验证了复合物的形成，并通过荧光光谱和圆二色谱探究了复合物形成的作用机制及蛋白质结构的变化，最后采用分子模拟技术将复合物相互作用可视化。结果表明，甜菜苷与乳清分离蛋白主要通过氢键与范德华力形成复合物，结合位点数约为1。复合物的形成导致蛋白的浊度增加，表面疏水性降低，内源荧光猝灭，且猝灭机制为静态猝灭，常温下的猝灭常数为1.78×103 L/mol。相互作用改变了乳清分离蛋白中色氨酸、酪氨酸的微环境和二级结构含量，使甜菜苷在80 ℃下加热1 h的保留率从6.17%提高到27.26%。本研究为功能性蛋白色素复合物的应用开发和甜菜苷的护色提供了理论基础。     

基于光谱和分子模拟研究半乳甘露聚糖和人血清白蛋白的相互作用

目的:研究半乳甘露聚糖对人血清白蛋白（HSA）光谱特性的影响及它们相互作用的机理。方法:本文利用光谱法判断半乳甘露聚糖和HSA的猝灭方式、结合位点数、结合作用力类型以及二级结构的变化,采用分子对接模拟技术得到结合作用力类型和长度,进一步研究半乳甘露聚糖和HSA相互作用的机制。结果:在半乳甘露聚糖的作用下,HSA内源荧光被有规律的猝灭,猝灭过程是自发进行的,机制为静态猝灭,结合位点数约为1,并且HSA的二级结构中α-螺旋含量减少了7.7%。分子对接结果表明,半乳甘露聚糖通过氢键和范德华力在HSA的亚结构域IIB中相互作用。结论:半乳甘露聚糖与HSA有较强的结合能力,并且结合是自发进行的。     

分子对接和荧光光谱法研究麦角甾醇与牛血清白蛋白的相互作用

用分子荧光光谱实验法和分子对接理论研究麦角甾醇与牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）的相互作用。荧光光谱实验结果表明：麦角甾醇能猝灭BSA的内源性荧光,其猝灭类型为静态猝灭;通过考察猝灭过程中热力学函数的变化初步推断麦角甾醇与BSA的结合是自发的熵增过程,驱动力主要为疏水相互作用。运用分子对接技术研究了麦角甾醇与BSA的相互作用,结果表明：麦角甾醇与BSA相结合,主要的作用力类型为疏水相互作用;并获得了麦角甾醇在BSA中的作用位点,麦角甾醇处在一个疏水性的结合口袋中,结合稳定性强。荧光光谱的实验结果与分子对接的理论结果总体上一致,说明结合过程是一个自发的过程,BSA可以携带和运输麦角甾醇,同时从分子对接中获得了麦角甾醇在BSA中详细的结合位点和结合模式。     

荧光光谱法结合分子对接探究pH对姜黄素与牛血清白蛋白结合的影响

目的 采用荧光光谱法结合分子对接探究姜黄素(curcumin, CUR)与牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)在不同pH条件下相互作用。方法 通过荧光光谱法计算结合常数和热力学参数分析CUR对BSA荧光猝灭作用和机理; 采用位点Marker和分子对接分析结合位点。结果 CUR与BSA结合形成了复合物, 产生内源性荧光猝灭作用, 属于静态猝灭。不同pH条件下的结合作用力不同, 但结合位点数目均为1。由同步荧光可知, 色氨酸残基附近疏水性增强, 说明与CUR结合后BSA构象出现了收缩, 结合位点靠近色氨酸。位点Marker实验证明pH影响CUR与BSA结合位点, 分子对接结果表明, pH 7.4时CUR与BSA的结合位点位于Sudlow’s site I附近。结论 本研究表明pH影响CUR与BSA的结合反应, 为CUR的活性保护及蛋白基递送载体研究提供理论支持。     

荧光光谱法探究pH值对叶黄素与牛血清白蛋白相互作用的影响

采用荧光光谱法研究不同pH值（3.0、5.2、7.4）条件下叶黄素与牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的相互作用，利用数学模型计算得到二者的猝灭常数和热力学参数等，分析叶黄素与BSA的荧光猝灭现象及蛋白构象的变化，最后通过位点竞争实验和分子模拟技术确定了二者的结合位点。荧光光谱表明，不同pH值条件下叶黄素对BSA均产生荧光猝灭效应，在298 K时，pH 7.4的猝灭常数最大，结合常数较大；热力学参数和分子对接结果表明，叶黄素与BSA间的作用力主要是疏水相互作用；同步荧光光谱表明BSA的构象在叶黄素与pH值的共同作用下发生改变；位点竞争性实验和分子对接实验表明，pH 7.4和pH 5.2时，二者的结合位点在亚结构域IIA和IIIA之间，但更接近于Sudlow’s site II；pH 3.0时，结合位点不在亚结构域IIA及IIIA附近。结果表明，pH值对叶黄素和BSA的相互作用有影响，这为蛋白质与生物活性成分的相互作用提供一定的理论依据。     

分子对接结合荧光光谱法探究单宁酸与血清蛋白结合的pH依赖性

探明单宁酸(TA)与牛血清蛋白(BSA)/人血清蛋白(HSA)之间的相互作用机制,对于开发蛋白基活性成分载体和递送机制研究具有重要意义。血清白蛋白(BSA/HSA)是常用可溶性载体蛋白,含有多个疏水腔作为活性成分结合位点。本文采用荧光发射光谱研究不同pH值(7.4,5.0,4.0)条件下TA对BSA/HSA荧光猝灭作用,并通过数学方程计算猝灭常数和热力学参数,分析荧光猝灭机理,最后通过位点Marker试验和分子对接技术确定结合位点。结果表明:在不同pH值条件下TA对BSA/HSA荧光均产生猝灭作用,当生理pH 7.4时,猝灭率最高。非线性拟合得到TA与血清蛋白的结合常数在105～107L/mol数量级,说明结合能力很强,pH值显著影响结合常数(P0.05),当生理pH 7.4时,结合常数最大。热力学参数与分子对接表明BSA/HSA与TA主要通过氢键和疏水相互作用结合。位点Marker试验和分子对接表明,在pH 7.4时,BSA/HSA与TA结合位点均位于结构域ⅡA和ⅢA之间的疏水腔内,Sudlow's site Ⅰ位点附近。试验证实TA与BSA/HSA的结合存在pH依赖性,对设计开发蛋白-TA载体提供了理论参考,对TA应用有指导意义。     

橙皮苷、柚皮苷与酪蛋白相互作用机制比较分析

采用荧光光谱、同步荧光光谱结合热力学参数分析及分子对接比较研究酪蛋白（casein,CA）与橙皮苷（hesperidin,HES）及柚皮苷（naringin,NAR）之间的相互作用及机制,结果表明：两种多酚对CA的猝灭均为静态猝灭,但HES对CA的荧光猝灭效果及结合亲和力较强,且CA与HES的结合位点数较多。热力学参数证明CA与HES、NAR的结合均为以疏水作用力为主的自发反应。同步荧光光谱显示,两种多酚的加入引起了CA氨基酸内部疏水环境的改变。分子对接进一步证实,两种多酚与CA的结合主要以疏水作用力为主,但HES与CA间存在更多的氢键作用,并使HES与CA之间结合得更为稳定。本研究可为多酚与蛋白质间的相互作用研究以及CA作为黄酮类多酚载体的可行性提供参考依据。     

基于多光谱技术分析绿原酸与肌原纤维蛋白相互作用的初步研究

本研究以高白鲑肌原纤维蛋白（Myofibrillar Protein,MP）为研究对象,探究不同浓度（6、30、150、300μmol/g）绿原酸（Chlorogenic Acid,CA）与MP相互作用的结构变化及结合性质。在25℃下孵育形成不同CA-MP复合物,通过测定复合物的理化性质（总巯基,表面疏水性）,二级,三级结构变化（傅里叶红外光谱、同步荧光、三维荧光）,结合性质（紫外光谱,荧光猝灭及热力学参数）分析CA-MP复合物相互作用情况。结果表明,在300μmol/g CA存在下,蛋白总巯基含量和表面疏水性分别骤降25.65%,40.26%(P<0.05);蛋白质二级结构随之展开,α-螺旋含量下降至11.73%,造成蛋白结构稳定性降低;同步荧光与三维荧光光谱表明CA对蛋白荧光具有猝灭作用,且色氨酸比酪氨酸的猝灭效果高7.90%。紫外光谱和荧光猝灭证实CA-MP形成复合物且二者的结合为静态猝灭,热力学参数进一步验证二者相互作用的主导力为疏水作用力。本研究旨在为多酚与高白鲑MP相互作用提供有价值的信息,为后续对不同结构多酚与高白鲑肌球蛋白的相互作用机制提供研究基础。     

花青素对牛血清白蛋白的光谱特性及构象的影响

为研究模拟生理条件下花青素（ACN）对牛血清白蛋白（BSA）的光谱特性及对BSA功能构象的影响,本文采用荧光光谱法判定ACN对BSA的猝灭方式、结合位点数、结合位点、结合作用力类型以及是否发生非辐射能量转移;利用紫外-可见吸收光谱法、圆二色谱法、傅利叶红外吸收光谱法进一步表征了BSA构象变化。结果表明,在ACN的作用下,BSA内源荧光被有规律的猝灭,猝灭机制主要为形成ACN-BSA复合物的静态猝灭和非辐射能量转移。猝灭过程是自发进行的,结合位点数约为1,结合位点位于BSA亚结构域的site I,并使得BSA二级结构中α-螺旋含量减少了3.1%。ACN对BSA有较强的结合能力,并能使BSA构象发生变化。     

超声处理对叶黄素与牛血清白蛋白结合行为的影响

为探究超声处理对叶黄素（LUT）与牛血清白蛋白（BSA）结合行为的影响,采用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱法分析不同超声频率（0 Hz/40 kHz/53 kHz）下LUT与BSA的相互作用,通过位点竞争试验和分子对接技术来确定结合位点。结果表明：不同超声频率下LUT对BSA造成荧光猝灭,当超声频率53 kHz时猝灭率最高（50.6%）,同时超声处理使BSA结构的疏水性增强,与紫外-可见吸收光谱测定结果一致。同步荧光表明,超声处理使BSA骨架变得疏松,且在超声频率53kHz时色氨酸荧光强度变化显著。分子对接结果显示：LUT与BSA结合位点位于亚结构域ⅢA和ⅢB之间,已得到位点竞争试验的验证。此外,热力学研究和分子对接结果表明：LUT主要通过氢键和疏水相互作用与BSA自发结合。当超声超声频率53 kHz时,对LUT与BSA的结合行为影响显著。结论：通过改变超声频率,可调控食品中蛋白与小分子相互作用。     

番茄碱的制备及其对乙酰胆碱酯酶的抑制作用

本实验采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR）氢谱、碳谱鉴定从番茄叶中提取并纯化的番茄碱;利用紫外光谱法、分子荧光光谱法和分子对接技术研究番茄碱对乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE）活性的影响,同时探究番茄碱与AChE的结合方式,为番茄碱的神经保护机制提供理论依据。结果表明,纯化产物经UPLC-QTOF-MS和1H?NMR、13C?NMR分析确定为番茄碱。利用紫外光谱法检测出番茄碱可部分抑制AChE的催化活性,并且番茄碱对AChE的抑制作用为竞争性抑制。分子荧光光谱显示,经番茄碱处理的AChE蛋白在340?nm波长处的发射荧光强度下降,并出现红移现象;Autodock分子对接技术分析结果显示,番茄碱与AChE蛋白中的Ser293、Phe295、Phe338、Phe297、Ser125、Gly121、Ser203、Glu202、Gly120、His447、Gly448、Ile451、Trp86、Tyr124、Tyr337、Tyr341、Ile294形成疏水相互作用并与其中的Trp86形成氢键,表明AChE的微环境发生了变化,竞争性地干扰了底物乙酰胆碱与AChE的结合。因此,番茄碱是通过形成氢键和疏水作用的方式抑制AChE活性。     

肌红蛋白血红素辅基与珠蛋白相互作用机制

通过紫外-可见光谱、荧光光谱和分子对接技术研究血红素辅基与珠蛋白相互作用的机制。紫外-可见光谱结果表明，血红素辅基对珠蛋白的二级结构产生了影响；荧光光谱分析表明，血红素辅基与珠蛋白结合生成复合物，产生静态荧光猝灭，288、298、308 K下的结合常数分别为1.497×109、3.818×109、1.327×1010 L/mol，结合位点数为1.87±0.12，血红素辅基对珠蛋白的结合作用力主要是疏水相互作用；同时通过分子对接技术确定了氢键对维持肌红蛋白空间结构的稳定性也极为重要；紫外-可见光谱、荧光光谱和分子对接结果均互相印证。     

分子动力学模拟抗坏血酸对木瓜蛋白酶活性的影响

为探究抗坏血酸对木瓜蛋白酶活性的影响，以实验结果为基础，利用分子对接和分子模拟技术对二者的结合机制进行分析。结果表明：3种浓度(0.1、0.2、0.3 mmol/L)的抗坏血酸均能促进木瓜蛋白酶酶活性，平均激活率分别为10%、21%、28%，抗坏血酸浓度越高，激活作用越明显；分子模拟结果表明，木瓜蛋白酶与抗坏血酸结合后均方根误差呈略微上升的趋势，木瓜蛋白酶内部的氢键数量降低，结合前氢键数量平均值为146，而加入抗坏血酸后为143，总可及表面积增加2.38 nm²，且3个活性位点(Asp158、His159、Cys25)的均方根波动程度均增大，发挥主要催化作用的25号位半胱氨酸与2个辅助氨基酸的间距缩小。因此，木瓜蛋白酶的激活可能是由于抗坏血酸的加入引起了蛋白活性中心结构的变化，从而使木瓜蛋白酶更有利于发挥催化作用。     

Investigation on the inactivation of trypsin by oenothein B: isothermal titration calorimetry and docking studies

The aim of this study was to investigate the inhibitory mechanism of oenothein B (OeB), a unique oligomer ellagitannin with a rigid structure, on porcine trypsin using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry (ITC), circular dichroism (CD) and molecular docking. Trypsin activity was strongly inhibited by OeB in a competitive way. Fluorescence quenching of trypsin by OeB was a static quenching. The CD spectra showed that binding of OeB to trypsin altered trypsin's conformation. The ITC and docking studies revealed that the inhibitory mechanism of OeB occurred via binding to the interior hydrophobic groups of trypsin and the formation of hydrogen bonds with trypsin through binding to the amino acid residues Asn97, His573, Ser195 and Gln192. This study provides a theoretical and computational basis for the precise control of trypsin in food industry. Based on the results, OeB may be used in food technology research as novel bioactive trypsin inhibitor.     

芹菜素-8-C-葡萄糖苷对淀粉消化酶抑制作用机制

采用酶活动力学、荧光光谱、圆二色谱和分子对接等技术系统探究芹菜素-8-C-葡萄糖苷对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性调控效果及机制。结果显示,芹菜素-8-C-葡萄糖苷对α-葡萄糖苷酶有良好的抑制效果,IC50值为293.5 mg/L,抑制类型为非竞争性抑制。但对α-淀粉酶无显著抑制效果。荧光光谱结果表明芹菜素-8-C-葡萄糖苷可作为猝灭剂分子与α-葡萄糖苷酶结合,发生静态猝灭,改变酶蛋白氨基酸疏水环境。圆二色谱则显示芹菜素-8-C-葡萄糖苷和α-葡萄糖苷酶之间的相互作用使酶分子的二级结构变得松散,α-螺旋和β-转角下降。分子对接结果进一步证实芹菜素-8-C-葡萄糖苷和α-葡萄糖苷酶之间作用力主要为氢键,最低结合能为-7.2 kcal/mol。本研究揭示了芹菜素-8-C-葡萄糖苷对淀粉消化酶尤其是α-葡萄糖苷酶的抑制作用机制,为未来将芹菜素-8-C-葡萄糖苷作为健康食品辅料或药物开发提供一定理论基础。     

黄曲霉毒素G_1与人血清白蛋白的结合机理及分子对接

在模拟人体血液p H 7.4的条件下,用分子对接及其荧光光谱、3D荧光、圆二色谱等方法研究黄曲霉毒素G1(aflatoxin G_1,AFG_1)与人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的相互作用。结果发现,根据双对数方程得出AFG1与HSA结合反应猝灭机制为静态猝灭,4个温度条件下结合常数数量级均为104,结合位点数近似为1。通过分子对接和热力学参数计算,AFG1结合在HSA的ⅠB疏水腔中,二者结合力主要为疏水作用和氢键。通过研究体内金属离子对AFG1-HSA反应的影响,Fe~(3+)、Mg~(~(2+))能增大AFG1对HSA的亲和力,而Zn~(2+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)离子则能大大降低AFG1与HSA的亲和力。基于F?rster’s能量转移,二者反应距离为3.26 nm。3D荧光结果显示,二者的结合反应使HSA生色团氨基酸残基疏水性增加,二级结构发生改变;圆二色谱结果表明,加入AFG1使得HSA的α-螺旋含量增加。