一株耐酸性拮抗细菌的筛选、鉴定及对茄雷尔氏菌的抑制作用

为解决酸化烟田青枯病防控难的问题，本研究通过生防菌快速筛选法获得一株耐酸性的拮抗细菌CLP-6，采用扫描电镜观察其拮抗活性，利用HPLC-MS技术确定胞外抑菌物质种类和含量，荧光定量PCR法检测筛选菌株对青枯菌的抑制效果。结果表明，该菌株胞外抑菌物质可降解青枯菌杆状菌体并致其死亡，pH 5.5条件最适宜该菌株生长，且胞外抑菌蛋白和抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚产量高。pH 5.5和pH 7.0土壤盆栽试验结果显示，在供试时间范围内，CLP-6能有效降低烟草根际土壤和茎基内青枯菌数量，且pH 5.5时抑菌效果更强，其中，接种192 h时，CLP-6处理烟草根际土壤青枯菌数量较CK处理分别减少98.12%和96.25%；接种144h时，pH5.5土壤条件下CLP-6处理烟草茎基内青枯菌数量最低，且显著低于CK处理。16Sr RNA,rpoD和rpoB多基因序列联合鉴定CLP-6为防卫假单胞菌（Pseudomonasprotegens）。新型耐酸性防卫假单胞菌CLP-6在减轻连作酸化土壤青枯菌侵染和提高烟草青枯病绿色防控效果具有重要开发前景。     

γ-聚谷氨酸高产菌株的筛选及改良酸化植烟土壤效果研究

为挖掘具有缓解植烟土壤酸化能力的微生物菌株,采用盆栽试验和大田试验相结合的方法,应用生物形态学和分子生物学筛选鉴定了γ-聚谷氨酸（γ-PGA）高产菌株并研究其对酸化植烟土壤的改良效果。结果表明：（1）从黄土高原干旱土壤中筛选得到一株谷氨酸非依赖型γ-PGA高产菌株副地衣芽孢杆菌285-3（Bacillus paralicheniformis）;（2）菌株285-3可有效缓解根系分泌物和复合肥料导致的土壤酸化,土壤pH平均提高0.3个单位以上;（3）菌株285-3配施有机肥,可显著降低酸化植烟土壤可交换酸度,对烟草青枯病的防效达到47.05%,同时提高烟叶产质量。综上所述,副地衣芽孢杆菌285-3对酸化植烟土壤有较好的改良效果,与有机肥合用具有控病和提高烟叶产质量的作用。     

外源橙皮素对烟草青枯病及根围土壤细菌群落的影响

为明确外源橙皮素对烟草青枯病的防效及对烟株根围土壤细菌群落的影响,基于盆栽试验和扩增子测序技术,连续两年监测了灌施不同浓度橙皮素（1、2和4 mmol/L）后烟草青枯病的发生情况,并分析了烟株根围土壤细菌群落结构。结果表明：（1）单施橙皮素对烟草青枯病的防效为40%左右。（2）灌施1 mmol/L和2 mmol/L橙皮素可以提升烟株根围土壤细菌群落OTU数量和Chao1、ACE等丰富度指数。（3）灌施1 mmol/L和2 mmol/L橙皮素可明显改变根围土壤细菌群落结构,提高土壤中Dongia、鞘脂菌属（Sphingobium）、赭黄嗜盐囊菌属（Haliangium）及拟杆菌属（Bacteroides）的相对丰度,而降低土壤中雷尔氏菌属（Ralstonia）的相对丰度。综合来看,1 mmol/L和2 mmol/L橙皮素是较适宜的灌施浓度。该研究结果为合理利用植物次级代谢产物提供了依据。     

根际土壤调控对连作烟田青枯病的控制作用

针对一些烟区土壤存在的板结、酸化严重、营养失调、微生态环境失衡等问题,设置了窝施碳化玉米秸秆、增施碱性肥料、生石灰水和微肥斯德考普灌根4项措施对烟株根际土壤进行改良。通过调查各处理青枯病的发病情况、烟草农艺性状等指标,探索不同调控措施对青枯病的防控作用及烤烟农艺性状的影响。结果表明:4个处理中,生石灰水灌根和微肥斯德考普灌根对烟草青枯病均有较好的防控作用,在对照区发病率达到高峰时,病情指数分别比对照低9.74、8.45,防效分别为50.52%、40.47%;4种处理措施对烟草农艺性状均有一定的促进作用,以增施碱性肥料效果相对最佳,其后依次为斯德考普灌根、石灰水灌根、窝施碳化玉米秸秆。     

生防菌使用方式对烟草青枯病的防效及根际土壤细菌群落的影响

采用大田试验和扩增子测序技术,探索了生防菌兑水灌根（GG）、生防菌拌土围根（WG）、米糠+生防菌拌土围根（MK+WG）对烟草青枯病的防效及调节土壤细菌群落的作用。结果表明:（1）不同施用方式对青枯病的防效表现为MK+WG（59.32%）> WG（55.93%）> GG（49.72%）。（2）WG和MK+WG均可显著提高烟株根际土壤细菌群落的多样性和丰富度,且MK+WG增幅最大。（3）WG和MK+WG提高了土壤中放线菌门的相对丰度,促使土壤中Gaiella、Gemmatimonas和Bradyrhizobium等一些有益微生物比例上升。综合来看,MK+WG更有利于恢复土壤健康、减轻青枯病对烟株的为害。      

一株枯草芽胞杆菌L249的分离鉴定及对烟草赤星病的盆栽防效

为筛选出对烟草赤星病具有生防潜力的拮抗细菌，以链格孢菌（Alteraria alternata）为靶标菌，采用5点取样法在赤星病发生严重地块采集健康烟株根际土壤，通过梯度稀释分离法和平板对峙法筛选得到一株具有生防作用的拮抗菌L249，对链格孢菌抑菌率达72.27%，经菌落形态、生理生化和分子生物学鉴定为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。该菌能产生蛋白酶、纤维素酶和硝酸还原酶等生防相关酶类。利用比浊法测定菌株L249的生长速率，结果表明该菌培养4 h后进入对数生长期，14 h后进入稳定生长期。盆栽试验结果表明，菌株L249发酵液能有效抑制烟草赤星病的发生，相对防效达60.66%，与10%苯醚甲环唑水分散粒剂的相对防效差异不显著。枯草芽胞杆菌L249可有效防治烟草赤星病，具有较好的生防潜力。     

烟草灰霉病复合生防细菌的筛选

采用平板对峙法和孢子萌发法,测定470株烟草内生细菌对烟草灰霉病菌的抑菌活性,初筛出抑菌作用较强的27株菌株;利用烟叶组织法进行复筛,获得防治效果超过50%的12株菌株,属于芽孢杆菌属或假单胞菌属;测试了7株生防菌之间的亲和性,除菌株Y98外,其他菌株之间均表现亲和;根据菌株亲和性及生防效果,选择5株生防菌株进行混配,测定其对烟草灰霉病的防治效果,发现芽孢杆菌菌株Y11与假单胞菌菌株Y141在其比例为2:1时的防效较好,且高于单菌株处理。      

抗青枯内生细菌的筛选及其对烟草青枯病的防治效果

烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的一种土传细菌性烟草病害,主要危害烟草的根茎,严重影响烟草的产量。从青枯病发病田健康烟株分离内生细菌55个,通过平板拮抗实验筛选,R-3、R-7、R-9菌株对青枯雷尔氏菌有明显的拮抗作用。gyr B基因序列分析表明,R-3、R-7、R-9均为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)。3个菌株的发酵液经115℃高温处理均能保持对青枯雷尔氏菌的抑制活性,说明3株贝莱斯芽胞杆菌可产生耐高温的抑菌物质。田间试验结果表明,R-3、R-7和R-9均可长期定殖于烟草根和茎中,对青枯病的防治效果分别为55.72%、48.34%和50.71%。     

烟草青枯病发病烟株根际土壤细菌群落分析

  目的  研究青枯病发生对根际土壤细菌群落组成的影响, 探明影响根际土壤细菌群落的环境因子。  方法  采用宏基因组学高通量测序技术, 比较发病烟株和健康烟株根际土壤细菌群落差异。  结果  (1) 健康烟株根际土壤细菌Ace指数、Chao指数和Shannon指数有高于发病烟株的趋势, 而Simpson指数有低于发病烟株的趋势; (2)发病烟株根际土壤中芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)等益生菌减少, 而劳尔氏菌属(Ralstonia)和Rudaea等病原菌增加; (3)土壤pH、有效磷(AP)、交换性钙(Ca)和有效铜(Cu)含量在发病烟株根际土壤中显著减少, 而速效钾(AK)含量显著增加。  结论  与健康烟株根际土壤相比, 发病烟株根际土壤细菌多样性、有益菌丰度、土壤pH和养分含量都较低; pH、P、K、Ca、Cu是对根际土壤细菌群落影响较大的土壤环境因子。      

荧光假单胞菌YG-1对烟草根黑腐病菌的体外拮抗

为丰富烟草根黑腐病菌高效拮抗菌资源,从玉溪烟草种植区根际土壤中分离烟草根黑腐病高效拮抗菌,结合生理生化特性和16S rDNA序列分析鉴定高效拮抗菌,测定菌株发酵液挥发性物质及发酵液粗提物对根黑腐病菌的拮抗活性。结果表明,筛选得到的12株拮抗菌中YG-1表现出最强的拮抗活性,经生理生化特性和16S rDNA序列分析鉴定为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluroescens）。菌株YG-1发酵液挥发性物质可有效抑制烟草根黑腐病菌的生长,使菌丝扭曲畸形,并且降低产孢量,经GC-TOF-MS测定,YG-1发酵液含有酸、醛、酯以及一些含硫化合物,其中酸类物质和含硫化合物抑菌效果强。菌株YG-1发酵液粗提物能破坏烟草根黑腐病菌孢子质膜,当粗提物质浓度为0.25 mg/mL时,孢子失膜率达55.42%,同时检测到有明显的离子和核酸渗漏。拮抗菌YG-1具备开发为生防菌剂的潜力。     

基于RAPD分子标记的烟草青枯病菌特异引物筛选及效果评价

为建立烟田土壤和烟株烟草青枯病菌的快速诊断方法,本研究采用RAPD方法筛选获得了6对可用于烟草青枯病菌PCR检测的特异性引物。经对6种细菌（烟草青枯病菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、节杆菌、荧光假单胞菌、野火病菌）和2个烟草品种（中烟100和云烟87）的检测验证,6对引物均具有良好的灵敏度、特异性和可靠性。对青枯菌菌液DNA的检测灵敏度可达0.42 pg/μL,对土壤青枯菌的最低检出率为6×102 cfu/g。应用特异引物A1T和S13T可对接种土壤和烟株样品的研磨悬浮液直接进行PCR快速检测,显著地缩短了检测时间,对烟叶产区烟草青枯病的预测预报及防控具有重要意义。      

豆浆灌根对土壤生物化学性状及烤烟质量的影响

近年来,烤烟豆浆（传统豆浆和酵解豆粕）灌根技术成为河南三门峡烟区的一项常规农艺措施。为揭示豆浆灌根对烟叶质量的影响及相关原因,采用盆栽和大田试验,分析了豆浆灌根对烤烟质量、烟株农艺性状、根系生长和土壤生物化学（酶活性、活性有机碳和土壤蛋白）指标的影响。结果表明,与对照相比,豆浆灌根对烤烟物理特性、化学成分、外观质量和感官品质等方面均有提升作用;豆浆灌根提高了中部叶长度和上部叶宽度,根表面积、根体积和根干重增加;豆浆灌根后土壤酶活性变化不大,土壤活性有机碳含量在灌根初期上升明显,土壤蛋白含量在灌根后较长时间内保持较高水平。因此,豆浆灌根后土壤蛋白和活性有机碳含量上升可能是烤烟根系干物质积累增加和烟叶品质提升的主要原因之一。     

海藻多糖与有机物料对烟草青枯病的防控效果

为探究海藻多糖与其他有机物料混合使用对烟草青枯病的防控效果,以烤烟品种NC102为试验材料进行田间试验,设置不同用量海藻多糖与微生物菌肥、草木灰、贝壳粉、生物炭等有机物料的组合处理,分析了不同处理对烟草农艺性状和经济性状、土壤理化性质、烤后烟叶化学成分的影响,以及土壤理化性质与烟草青枯病发病率和病情指数的相关性。结果表明,与对照相比,海藻多糖与有机物料的施用普遍促进了团棵期和旺长期的烟株生长发育,提高了土壤pH和有机质含量,降低了烟草青枯病的发病率和病情指数;烤后烟叶经济性状和主要化学成分也有不同程度的提升。Pearson相关性分析表明,土壤有机质含量和pH与青枯病发病率和病情指数之间存在极显著的负相关关系。500倍海藻多糖稀释液在50~100 mL/株的范围内,用量越高,效果越好;组合处理中草木灰+海藻多糖75 mL/株处理效果最好。通过增加海藻多糖和有机物料,调节土壤pH或增加土壤有机质含量有助于控制青枯病的发生。     

生物炭及海藻肥对烟草生长、土壤性状及青枯病发生的影响

为研究不同用量生物炭及海藻肥对烟草生长及青枯病的影响,以烟草NC102为试验材料,在常年青枯病发生较严重的地块采用完全随机设计,在常规施肥基础上,设置处理CK（空白对照）、BC1（9000 kg/hm²生物炭）、BC2（15 000 kg/hm²生物炭）、BC3（22 500 kg/hm²生物炭）、SW（2250 kg/hm²海藻肥）、BC2+SW（15 000 kg/hm²生物炭+2250 kg/hm²海藻肥）。结果发现,海藻肥和生物炭单一或混合施用均能促进烟草生长,最大量生物炭的处理虽然抑制烤烟团棵期生长,但可以促进烤烟旺长期的生长。生物炭和海藻肥单一或混合施用均显著提高了土壤pH及部分土壤养分含量,降低了烟草青枯病发病率及病情指数,有利于提高烤烟产量和中上等烟比例,协调烟叶化学成分,提升烤后烟叶内在品质。利用Pearson相关系数分析了不同处理土壤理化性质与烟草青枯病病情指数之间的关系,结果发现,适当提高土壤酸碱度可作为酸性土壤主产区防控烟草青枯病、提高烤烟产质量的重要策略。     

烟草青枯病拮抗菌在有机肥中的定殖效率及田间防治效果

为有效防治青枯病,采用多种拮抗菌复配菌剂添加至生物有机肥,施用于烟田,研究其对烟田土壤中有益微生物、病原微生物的影响及对青枯病的控制效果。结果显示,30%茶枯+70%烟草秸秆粉碎物（生物有机肥C）中添加的拮抗菌有较好的定殖率,枯草芽胞杆菌JK-4、解淀粉芽胞杆菌JK-10菌株在生物有机肥C中的定殖率分别达到了945.7%、1970%,链霉菌LC-7菌株在生物有机肥C中定殖率达到496.7%,同时其防治青枯病的效果最好,在烟草旺长期防治效果达到57.40%,在青枯病发病高峰期防治效果为37.11%。     

感染青枯病与黑胫病烟株的根际土壤、根及茎秆微生物代谢特征分析

为明确感染青枯病、黑胫病烟株的根际土壤、根及茎秆中微生物代谢特征,采用Biolog-ECO代谢表型技术研究了微生物群落对6类31种碳源的代谢情况。结果表明：(1)同一烟株的根际土壤、根、茎秆中微生物的碳源代谢能力依次减弱;烟株感病后根和根际土壤中微生物对6类碳源的利用率无显著变化,茎秆微生物对多聚物类、氨基酸类和酚类碳源的利用率提高。(2)感染青枯病、黑胫病烟株根和根际土壤微生物均能代谢31种碳源;感染青枯病烟株茎秆微生物对除2-羟基苯甲酸以外的30种碳源均能正常代谢;感染黑胫病烟株茎秆微生物不能代谢D-甘露醇、葡萄糖-1-磷酸盐、D-葡萄糖胺酸等10种碳源。(3)感染黑胫病烟株的根和根际土壤微生物的平均颜色变化率（Average well color development,AWCD）显著低于健康烟株,茎秆微生物AWCD值略高于健康烟株;感染青枯病烟株茎秆微生物的AWCD值显著高于健康烟株,根和根际土壤微生物AWCD值与健康烟株无显著差异。(4)感病烟株的根和根际土壤微生物的香农-威纳指数（Shannon-Wiener）、辛普森指数（Simpson）和皮诺（Pielou）指数较健康烟...     

垂直深旋耕配施改土物料改良酸性土壤并提高烟草种植效益研究

为实现酸性土壤改良与土壤培肥同步、表层土与表下层土壤改良同步的目的,运用垂直深旋耕与无机、有机、生物等多物料综合协同改良酸性土壤,采用双因素裂区设计,试验设垂直深旋耕和传统耕作方式,以及石灰、石灰+绿肥、石灰+绿肥+酸性生物有机肥、石灰+绿肥+碱性生物有机肥等改土物料组合,研究了耕作方式和改土物料及其互作对植烟土壤理化特性及烤烟根系生长、农艺性状、经济性状、化学成分的影响。土壤理化特性受耕作方式和改土物料的影响,也受其互作的影响;垂直深旋耕可降低土壤容重,提高土壤孔隙度和土壤碱解氮、有效磷、速效钾含量,提高改土物料调酸效果;石灰与绿肥、生物有机肥配施更有利于改善土壤物理特性、提高土壤pH和养分含量,施用碱性生物有机肥较酸性有机肥更有利于提高土壤pH。烤烟根系和地上部生长及经济性状主要受耕作方式的影响,烟叶化学成分主要受改土物料的影响;垂直深旋耕结合石灰、绿肥、生物有机肥改良酸性土壤,有利烤烟根系生长,改善烤烟农艺性状,提高烤烟产量和产值,协调烟叶化学成分。在山地烟区,采用垂直深旋耕结合无机、有机、生物等多物料综合协同改良酸性植烟土壤,可同步实现表层土壤酸度改良与肥力提升,还可同步实现表层与表下层酸性土壤改良,提高烤烟种植效益。