蜡样芽孢杆菌胶原蛋白酶基因的异源表达与活性分析

研究采用降解骨胶原蛋白的蜡样芽孢杆菌MBL13-U作为原菌种,并对蜡样芽孢杆菌MBL13-U进行全基因组测序,克隆获得胶原蛋白酶(ColM13)基因。将目的基因与大肠杆菌的表达载体pET30a进行连接,转入大肠杆菌宿主菌株BL21,获得降解骨胶原蛋白的工程菌pET30a-ColM13/BL21。通过SDS-PAGE测定异源表达的重组蛋白酶ColM13的分子质量,并测定不同诱导时间和诱导浓度对ColM13酶活性的影响,最终确定重组蛋白酶ColM13的酶活最适条件:6‰异丙基硫代半乳糖苷(IPTG,100 mmol/L),37℃诱导6 h,优化后酶活力最高为64.99 U/mL,较优化前提高4.24倍。通过水解圈试验、紫外光谱和扫描电子显微镜等方式验证,表明工程菌构建成功,这为我国畜禽骨骼资源的深度开发和综合利用提供了新的研究思路。     

Bacillus cereus胶原蛋白酶功能基因分析与结构预测

以一株降解骨胶原蛋白的菌种蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus) MBL13-U作为出发菌种,通过对菌全基因组测序,针对胶原蛋白酶功能基因进行了定位和结构预测。结果表明,从全基因组序列中得到胶原蛋白酶的功能基因序列长度为2 916 bp;该功能基因中α螺旋占总氨基酸的37. 1%,β转角占12. 8%,无规则卷曲占26. 0%,且该酶的三维结构预测为镊子状结构。将胶原蛋白酶基因转入大肠杆菌宿主菌株BL21,构建出工程菌p ET30aCol M13/BL21。对工程菌所产的重组蛋白酶Col M13酶解Ⅰ型骨胶原蛋白的结构进行分析表明,酶解作用使骨胶原蛋白产生多肽和大量游离氨基酸,其微观结构发生显著变化,表明Col M13在工程菌中已成功表达。     

牛骨胶原蛋白酶解工艺优化及结构特性分析

为研究前期纯化的特异性降解牛骨胶原蛋白的胶原蛋白酶(BSC)对牛骨胶原蛋白的酶解工艺,以水解度为响应值,在单因素试验基础上通过五元二次正交旋转组合试验,确定最佳酶解工艺为:反应温度46℃、牛骨胶原蛋白添加量5.14g/100mL、BSC添加量0.42g/100 mL、反应时间6h、pH 6.5,该工艺条件下水解度为34.98%。采用紫外光谱(UV)、荧光光谱(FS)、傅里叶红外光谱(FT-IR)、扫描电镜(SEM)对牛骨胶原蛋白及其产物进行结构特性分析。通过UV分析表明BSC酶的降解作用破坏了牛骨胶原蛋白的三股螺旋结构,游离出大量的氨基酸;FS分析表明牛骨胶原蛋白分子表面C═O、CONH_2、COOH逐步增多,胶原蛋白肽中生色基团分布也随之发生变化;FT-IR分析可知牛骨胶原蛋白经降解后的胶原蛋白肽的肽链上—NH_2~+—排斥作用逐渐减弱,主要以β-转角为主;SEM表明酶破坏了牛骨胶原蛋白的表面分子结构,使其变得疏松。     

梅奇酵母氨基甲酸乙酯酶分离纯化与酶学性质分析及其对葡萄酒香气的影响

为了研究梅奇酵母所产生氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate,EC）酶的性质,通过硫酸铵盐析、离子交换层析的方法对EC酶进行分离纯化,并对纯化后EC酶的酶学性质进行了分析。结果表明,纯化后EC酶对比纯化前的酶活提高了约1.2倍。纯化后EC酶最适反应温度为35 ℃,在25~45 ℃之间热稳定性较强;最适pH为5.5,在pH5~6时该酶稳定性强,即酸稳定性强,碱稳定性较差。当乙醇体积分数为12%~14%时,EC酶具有一定酶活。底物特异性结果表明,该EC酶对EC及其前体物质（尿素）具有较高的降解能力,且对于成品葡萄酒挥发性香气成分影响不显著。     

大鲵骨酸溶性和胃蛋白酶溶性胶原蛋白的提取与表征

大鲵为一种珍贵的两栖动物,营养丰富。为了充分且有效利用其加工副产物,分离并表征了来自大鲵骨的酸溶性胶原蛋白 (ASC) 和胃蛋白酶溶解性胶原蛋白 (PSC)。大鲵骨ASC和PSC的产率分别为10.71%和13.11%。通过傅里叶红外光谱揭示胶原蛋白稳定的三螺旋结构。SDS-PAGE电泳图显示两个样品均为I型胶原蛋白,同时具有高水平的亚氨基酸(179~187/1 000个残基)。样品在pH 6时溶解度最高。热变性温度(45.78~46.51 ℃)显著高于海洋和淡水鱼物种。在SEM下,胶原蛋白显示出致密的片状和不规则的孔洞状。这些结果表明大鲵骨胶原蛋白特性与哺乳动物胶原蛋白相似,具有成为其替代品的潜力,为其后续的研究和开发利用提供了基础数据。     

异甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

以pET-30(a)为表达载体,将来源于枯草芽孢杆菌K-6(Bacillus subtilis K-6)的异甘露聚糖酶基因(isoman K-6)在Escherichia coli BL21(DE3)中进行了表达。Isoman K-6登录号为HQ902141,基因全长为1083bp,共编码360个氨基酸,工程菌酶活为415.9U/mL,SDS-PAGE电泳表明,工程酶ISOMAN K-6分子量约为45000u,与预期分子量相符。经IDAHisBind树脂柱纯化的纯酶酶学性质研究表明,该重组酶为金属酶,Al3+和Ba2+对其有很强的激活作用,其最适反应温度为55℃、最适pH为6.0,且在pH4.5~7之间有着较好的稳定性,以槐豆胶为底物时,Vmax和Km分别为1.3U/mL和7.3mg/mL。     

重组水稻 α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

对重组水稻α- 半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质进行研究。结果表明：该重组酶分子质量约为59kD;最适酶反应温度为45℃,最适pH 值为5.0;酶活力在0～20℃,pH4.0～7.0 最为稳定;酶学动力学常数Km 为0.78mmol/L,Vmax 为10.16mmol/(mg·min)。多数的金属离子和有机离子对酶催化作用没有影响,Hg2+、Ag+及－ SH 基团抑制剂p-chloromercuribenzoic acid(pCMB)对酶活性有强烈抑制作用。     

蓝圆鲹骨骼肌脯氨酸内肽酶的分离纯化及其对胶原肽的作用

以蓝圆鲹为研究对象,探讨脯氨酸内肽酶(Prolyl endopeptidase,PEP)对鱼类肌肉胶原蛋白的作用及其机理。通过硫酸铵分级盐析,DEAE-Sephacel阴离子交换,Phenyl-Sepharose疏水层析和Q-Sepharose阴离子交换,从蓝圆鲹骨骼肌中分离纯化得到一种脯氨酸内肽酶。SDS-PAGE结果显示,PEP的分子量为82 ku,肽质量指纹图谱分析得到16个肽片段,共169个氨基酸残基。片段序列与墨西哥鲷鱼(Neolamprologus brichardi)PEP的同源性达98.8%,证明纯化得到的酶是PEP。PEP的最适温度为35℃,但热稳定性较差;最适p H为6.0,在p H 5.0~7.5之间有较好的稳定性。将PEP与合成的鱼胶原蛋白小肽反应,利用反相高效液相色谱对产物进行分离,电喷雾质谱分析结果显示PEP的水解位点在脯氨酸残基的羧基端。以上结果表明,鱼类肌肉中的PEP能够协同金属蛋白酶,通过切割脯氨酸残基进一步降解胶原小肽从而参与到鱼肌肉胶原蛋白的新陈代谢中,是鱼死后参与胶原蛋白降解的重要酶类。     

酶解鱼皮胶原蛋白制备抗氧化肽工艺研究

酶解鱼皮胶原蛋白制备小分子量的肽。分别研究酶用量、酶解时间、酶解温度及pH值对酶解产物分子量的影响。研究结果确定了最适酶解工艺:木瓜蛋白酶用量0.75‰(m/m),时间2h,温度50℃,pH为6。抗氧化活性试验表明,小分子量胶原蛋白清除自由基能力从原胶原蛋白的26%提高到74%。     

产胶原蛋白酶菌株的构建及性质分析北大核心

使用聚合酶链式反应(PCR)法扩增了解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens TCCC11319)的胶原蛋白酶基因col,并在枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtillis WB600)中进行表达。收集重组菌株的发酵酶液,以此来分析胶原蛋白酶性质。酶学性质研究表明:酶的最适反应温度为40℃,在30~40℃具有良好的温度稳定性;最适反应p H值为8.0,在pH值7.0~8.0的条件下稳定,表明是一种中性酶;金属离子Ca^(2+)、Mg^(2+)对酶有明显的激活作用,而Mn^(2+)、Cu^(2+)、Fe^(2+)对酶有明显的抑制作用,其中Cu^(2+)对酶的抑制作用最显著。酶学性质的研究结果对胶原蛋白酶在制革固体废弃物处理应用中具有很好的指导意义。     

凡纳滨对虾组织蛋白酶L性质分析及其对肌肉蛋白的降解

本研究从凡纳滨对虾肝胰腺中纯化获得一种组织蛋白酶L,其分子质量约为31 k D,肽质量指纹图谱分析得到8个片段共112个氨基酸残基,与报道的凡纳滨对虾组织蛋白酶L序列完全一致。该酶的最适温度和最适pH值分别为35℃和5.5,且在0~40℃以及pH 5.5~6.5之间酶活力稳定。该酶仅对底物Z-Phe-Arg-MCA特异分解。半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64和Leupeptin对其有明显的抑制作用,而金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸和乙二醇二乙醚二胺四乙酸对其有少量的激活作用。扫描电子显微镜观察结果显示,随着低温贮藏时间的延长,对虾肌肉纤维的断裂程度不断增加。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示,组织蛋白酶L可使肌肉蛋白发生分解,推测其可能参与对虾低温贮藏过程中肌肉的降解。     

普鲁兰酶的分离纯化及部分酶学性质

对盐球菌(Halococcus sp.)Z1、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)所产的普鲁兰酶粗酶液的耐热耐酸性进行了比较研究,并采用(NH4)2SO4盐析、透析、DEAE-Sephadex A25阴离子交换、Sephadex G-100凝胶过滤对Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶进行分离纯化,并测定了其部分酶学性质。结果表明Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶在低于65℃和pH4.0~7.5范围内有很好的稳定性,最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0~5.4,相对分子质量为8.17×104,Km值为0.24 mg/mL。     

Bacillus cereus MBL13-U胶原蛋白酶的分离纯化及其降解动力学分析

胶原蛋白酶是特异性水解天然胶原蛋白或明胶的酶类。为制备新型的骨胶原蛋白酶并探讨其降解胶原蛋白的能力,通过采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-100凝胶层析等分离纯化步骤,从Bacillus cereus MBL13-U菌株的粗酶液中分离纯化出一种特异性降解牛骨胶原蛋白的胶原蛋白酶(bone-specific collagenase,BSC),对该酶的分子质量、底物特异性和降解能力进行了分析,并构建出其降解牛骨胶原蛋白的动力学模型。结果表明:分离纯化的BSC比活力为5.57×103U/mg,纯化倍数达到42.85倍,分子质量约为52.0 k Da。经特异性分析该酶为骨胶原蛋白酶,且有显著的水解I型胶原蛋白的能力。其水解能力优于其他常用的蛋白酶。构建出该酶降解牛骨胶原蛋白的动力学模型为:降解速率R=(583.813 6E_0+1.296 7S_0)exp(-0.119 0DH),水解度DH=8.403 4ln(1+69.473 8(E_0/S_0)t+0.154 3)t,酶的失活常数K4为64.115 7/h。     

杏鲍菇重组漆酶对不同酚类污染物的降解研究

探讨重组漆酶的酶学性质,并研究降解时间、酶用量、酚类物质浓度、pH对两种不同结构酚类化合物(壬基酚、2,4-二氯酚)的降解效果。结果表明,该重组漆酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为2.5~3.0;该酶在30℃下具有较好的热稳定性,在pH9.0~10.0具有较好的pH稳定性。该重组漆酶具有降解不同结构酚类的能力,漆酶对不同浓度酚类化合物的降解率随着酚类浓度的增加而减小。当降解时间为16 h、重组漆酶浓度1 U/m L、pH3.5时,10 mg/L的壬基酚的降解率为100%;当降解时间为16 h、漆酶浓度是1.25 U/m L、pH4.0时,5 mg/L的2,4-二氯酚的降解率为95.1%。该重组漆酶的研究为酚类污染物的降解提供了理论基础。     

一株嗜热梭菌β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

以嗜热梭菌(Symbiobacterium thermophilum IAM 14863)基因组DNA为模板克隆了编码葡聚糖内切酶的基因,同时将该酶基因构建于表达载体pET32a(+)中,获得重组表达载体pET32a-Glu,转化至E.coli BL21(DE3)PLYS中并进行表达。结果表明:该基因大小为1 101 bp,共编码366个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果表明该基因在E.coli BL21(DE3)PLYS中得到了有效表达,相对分子质量约为60 kDa,纯化后重组酶活力为103 U/mL;酶学性质实验结果表明:酶最适pH值为5左右,最适反应温度为55℃,且此酶具有良好的耐热性(75℃左右)和pH值稳定性。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的克隆表达及重组酶性质研究

为实现对魔芋葡甘聚糖具有高度专一性的β-甘露聚糖酶基因的异源表达,从枯草芽孢杆菌G1中克隆出β-甘露聚糖酶基因BsmanA,将该基因与表达载体pACYCDuet-1连接并转化到E.coil BL21(DE3)中。结果表明:该β-甘露聚糖酶基因BsmanA序列全长为1098 bp,编码366个氨基酸;经Ni柱亲和层析纯化后,测得重组酶分子量大小为38 kD;酶学性质研究结果显示:该酶促反应的最适温度为60℃,最适pH为6.5,在温度50~70℃间,pH4.5~7.0的范围内能保持较好的稳定性。本研究实现了β-甘露聚糖酶的异源表达,为生物催化制备低聚甘露糖的工业化提供了新的选择。     

重组梅花鹿来源Cu/Zn-SOD的分离纯化及酶学性质

超氧化物歧化酶(SOD)能特异性清除氧自由基,对保护细胞免受氧化损伤具有重要作用。本文构建了表达重组梅花鹿来源Cu/Zn-SOD的毕赤酵母工程菌GS115-p PIC9K-SOD,并对重组SOD进行分离纯化和酶学性质研究。通过10 ku中空纤维柱超滤、DEAE弱阴离子交换层析、高效凝胶色谱分离纯化,重组Cu/Zn-SOD的比活力为1 7647.1 U/mg,回收率为36.84%。对重组Cu/Zn-SOD的酶学性质研究表明,其最适反应pH 8.0,最适反应温度30℃;在pH 5~9之间较为稳定,保温1h后仍能保留80%以上的酶活力;60℃保温1 h酶活保持在90%以上,70℃保温20 min残余酶活力仍有70%以上。重组Cu/Zn-SOD在中性条件下对蛋白酶耐受性较好,然而易受胃酸的酸解导致酶活力丧失。     

海燕体壁胶原蛋白肽的制备及其抗氧化活性的研究

以海燕体壁为原料,选取碱性蛋白酶、Alcalase酶和菠萝蛋白酶3种酶制备胶原蛋白酶解液,以对羟自由基的抑制率为指标,优选确定海燕体壁胶原蛋白的降解酶。利用正交实验优化制备具有体外抗氧化活性的胶原蛋白肽的酶解条件。结果表明,海燕体壁胶原蛋白的适宜水解酶为碱性蛋白酶和Alcalase酶。优化酶解条件分别为碱性蛋白酶酶加量5000 U/g、pH9.5和45℃条件下酶解9 h;Alcalase酶加量为3500 U/g、pH7.5和60℃条件下酶解9 h。在2种酶最佳酶解条件下所得到的胶原蛋白肽的羟自由基清除率IC_(50)分别为16.88、17.89 mg/mL。利用海燕制备胶原蛋白肽不仅可充分利用资源,且可避免其对周边环境的污染。     

枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在酿酒酵母中的表达和应用

将优化后的枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(serine alkaline protease,SAP)基因克隆到酿酒酵母表达载体pYES2上,在酿酒酵母Whu2d中进行表达。发酵酿酒酵母工程菌,对重组碱性蛋白酶酶学性质和降解豆粕中蛋白类抗营养因子效果进行研究。结果显示:工程菌发酵液中碱性蛋白酶酶活比出发菌株高55.2%。其最适反应温度和pH分别为45℃和8.0,在pH值为7.0~10.5时具有较好的稳定性,相对酶活可以保持在80%以上。与出发菌株相比,工程菌发酵后豆粕培养基中酸溶蛋白含量提高42.1%,粗蛋白和β-伴大豆球蛋白含量无显著差异,大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子的含量分别降低41.9%和57.4%。以上结果表明:该碱性蛋白酶酿酒酵母工程菌可以用于饲料、食品等富含蛋白原料的加工。     

单环刺螠内脏蛋白酶的分离纯化与酶学性质研究

以单环刺螠内脏为原料,对提取的蛋白酶的分离纯化条件及酶学性质进行研究。经硫酸铵纯化、Sephadex G-100凝胶过滤层析、DEAE-52阴离子交换层析得到单环刺螠内脏蛋白酶LPN2。SDS-PAGE电泳及高效液相色谱(HPLC)显示该酶纯度较高,分子质量约59 ku。其最适温度为50℃,最适p H范围6~8。丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)、金属蛋白酶抑制剂(EDTA)、Ca2+、Zn2+和Ba2+抑制蛋白酶LNP2的酶活,Fe2+在低浓度下对该酶有激活作用。根据水解度、风味感官分析、酶解前后游离氨基酸、分子质量分布结果,蛋白酶LPN2与中性蛋白酶作用方式相似,推断蛋白酶LPN2具有内肽酶的特性。