SDS-PAGE电泳测定乳清蛋白方法的研究

实验建立扫描定量测定乳清蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量的SDS-PAGE电泳分析方法.外标法定量,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白两种组分线性范围分别为0.25～1.75μg和0.16～1.44μg,线性关系良好,相关系数分别为0.9940和0.9912.加标回收率分别为88.6%～86.3%,RSD分别为3.8%～4.2%.对乳清粉和奶粉的分析结果表明,SDS-PAGE电泳分析方法是一种简易、快速、准确测定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量的方法.     

羊乳婴幼儿配方粉中牛乳成分鉴别与测定模型的建立

为实现羊乳婴幼儿配方粉中牛乳成分的快速分析，建立羊乳婴幼儿配方粉中牛乳的液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)鉴别与测定模型。样品经胰蛋白酶水解，采用高分辨四极杆静电场轨道阱串联质谱（Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Q Exactive, Thermo Scientific）结合蛋白数据库，筛选特征肽段。选择具有代表性的羊全脂乳粉、牛全脂乳粉和羊乳清粉、牛乳清粉，然后分别按不同的比例进行混合，LC-MS/MS测定，得到牛β-酪蛋白与牛全脂奶粉的换算系数k1为2.8343，牛β-乳球蛋白与牛全脂奶粉的换算系数k2为1.6542，牛β-乳球蛋白与牛乳清粉的换算系数k3为27.8598，通过换算系数构建特征肽与牛全脂奶粉和牛乳清粉的定量模型。结果表明，牛β-乳球蛋白和牛β-酪蛋白在20~1000 nmol/L范围内，线性关系良好，R2>0.999；方法的检出限为1.9 g/kg，定量限为6.4 g/kg；日内精密度为3.2%~8.1%，日间精密度为3.4%~7.3%，准确度为99.0%~103.0%；经三家实验室验证，方法的精密度为1.7%~6.9%；方法准确度为91.5%~103.0%；重复性相对标准偏差（r%）为4.3%~5.1%，再现性相对标准偏差（R%）为4.7%~5.7%。该模型可分别对羊乳婴幼儿配方粉中牛乳清粉和牛全脂乳粉进行鉴别与测定，两者之和即为牛乳含量。该模型极大的简化了前处理，具有操作简便、快速、方法实用性强等优点。     

热加工对乳清中主要过敏原潜在致敏性的影响

目的探讨不同温度条件下,热加工对牛乳中主要过敏原潜在致敏性的影响。方法将α-乳白蛋白与β-乳球蛋白经不同的加热条件处理后,用间接ELISA检测上述2种过敏原蛋白IgG的结合能力的变化。结果热处理后的α-乳白蛋白的IgG结合能力呈上升趋势;但经60~75℃热处理的α-乳白蛋白均比未加工的抗原性低,经60℃热处理的α-乳白蛋白的IgG结合能力下降幅度最大,下降比例为40%;经80℃热处理的α-乳白蛋白IgG结合能力大于未处理的α-乳白蛋白。热处理对β-乳球蛋白的IgG结合能力的影响与α-乳白蛋白相反:在60~80℃热加工条件下,β-乳球蛋白的抗原性随着温度的升高,抗原性逐渐减小,且经80℃加热处理的β-乳球蛋白的IgG结合能力最低,但仍然大于未加工的β-乳球蛋白的IgG结合能力。结论热加工能改变α-乳白蛋白和β-乳球蛋白IgG结合能力,进而改变致敏性。     

UPLC法测定乳及乳制品中乳清蛋白的研究

建立了超高效液相色谱法同时测定鲜牛乳和婴幼儿配方奶粉中α-乳球蛋白、β-乳白蛋白、乳铁蛋白的方法.鲜牛乳和奶粉经前处理后,采用ACQUITY UPLC BEH300? C18色谱柱进行分离,以0.1％TFA/H2O,乙腈+三氟乙酸(1000:0.5)为流动相,流速为0.5 mL/min,进行梯度洗脱,在280 nm波长...     

牛乳中主要过敏原致敏机理及其脱敏技术的研究进展

牛乳蛋白过敏是婴幼儿最普遍的一类食物过敏,主要是由于牛乳中αs1-酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白引起的免疫应答,可引发呕吐、腹泻甚至特应性皮炎等症状,严重影响了婴幼儿的生长发育。本文主要从牛乳蛋白过敏机制、脱敏方法和应用及其国内外抗过敏配方奶粉的研究进展进行了概述,并展望了牛乳脱敏技术的重点研究方向。     

利用壳聚糖选择性去除乳清中β-乳球蛋白

采用壳聚糖对浓缩乳清蛋白溶液进行处理以除去牛乳中主要过敏原β-乳球蛋白(β-Lg).在室温条件下,应用响应面分析法对反应条件进行优化,以β-乳球蛋白的减少量来评价反应的程度,得到的最适条件:pH值为6.69,壳聚糖添加量为2.04 g/L;此条件下可去除94.89%的β-乳球蛋白,剩余78.68%的α-乳白蛋白(α-La和35.41%的牛血清白蛋白(BSA).此外,对β-乳球蛋白和壳聚糖的回收进行研究,采用正交试验设计考察pH、醋酸钠溶液浓度和添加比例β-乳球蛋白回收率的影响.结果表明,最佳工艺条件为pH值为9.0,醋酸钠溶液浓度0.2 mol/L,添加比例1:15,此条件下可回收87.23%的β-乳球蛋白,纯度为84.1%.     

牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量的变化特性

为研究牧场牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白随季节变化规律,利用毛细管电泳法分别检测1～12月份牛乳样品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量.结果表明,α-乳白蛋白含量1月份最高(1.34 mg/mL),7月份含量最低(0.68 mg/mL);β-乳球蛋白含量2月份最高(3.46 mg/mL),8月份最低位(2.15 mg/mL).说明牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量与季节气候温度负相关.     

反相高效液相色谱法同时测定鲜牛乳中的乳清蛋白

通过对高效液相色谱条件中色谱柱、流动相、流速、检测波长、柱温优化的试验,建立了反相高效液相色谱对鲜牛乳中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白同时微量检测的分析方法,最终确定采用Agela Venusil ASB C8(5μm,4.6 mm×250 mm,150μm)色谱柱;三氟乙酸/乙腈/水流动相,流速0.8 m L/min,检测波长215 nm,柱温30℃的色谱条件,并利用外标法定量。结果表明,α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白3种组分的线性关系良好,相关系数分别为0.9999、0.9991、0.9998,检出限为0.001~0.012 mg/m L,样品平均回收率在86.5%~109.08%之间,精密度和重现性试验RSD值均小于5%。该方法的前处理简单、耗时少,样品损失少,分离效果好,能够实现牛乳中3种蛋白的同时检测。     

毛细管电泳法对乳及乳制品中乳源蛋白的测定

采用毛细管电泳方法对乳及乳制品中乳源蛋白成分进行检测.选择聚乙烯醇涂层毛细管,采用柠檬酸缓冲体系,在紫外检测214 nm、分离电压20 kV条件下对乳及乳制品中的α-乳白蛋白(α-La)、β-乳球蛋白(β3-Lg)、α-酪蛋白(α-CN)、β-酪蛋白(β-N)和k-酪蛋白(k-N)进行分离测定.五种蛋白线性良好,线性相关系数均大于0.997 8,各蛋白峰面积的相对标准偏差为1.76％～3.28％,加标回收率范围为88.1％～110.8％.应用该方法对液态奶、酸奶及奶粉中的乳源蛋白进行测定.本法准确、简便、易行,适于测定液态奶、酸奶、奶粉中蛋白质的检测.     

利用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱定量检测人乳中的α-乳白蛋白

目的建立一种新型基于多肽标准品体系的人乳α-乳白蛋白的定量检测方法。方法从人乳α-乳白蛋白筛选出特异性多肽,并建立对应的检测方法;利用化学方法人工合成特异性多肽、同位素标记特异性多肽和内标。结果本方法所选择的多肽具有高度特异性,α-乳白蛋白的检测灵敏度为8.0 mg/100 g,精密度均小于5.22%,回收率均在97.21%~102.45%之间。结论本方法建立了利用特异性多肽检测人α-乳白蛋白的方法,具有较高的准确度、灵敏度和稳定性。通过对447份人乳样品进行检测,初步探索了人乳中α-乳白蛋白的含量范围,为人乳化配方奶粉的华人配方奠定理论基础。     

聚乙烯吡咯烷酮/K_2HPO_4双水相体系分配α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的研究

本文研究了聚乙烯吡咯烷酮PVP/K_2HPO_4双水相技术分配α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的工艺,考察了PVP分子质量、PVP浓度、K_2HPO_4浓度、p H、温度等不同因素对双水相成相行为和蛋白质分配行为的影响。研究结果表明:分配α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的最佳工艺:30℃,分子量10000 u的PVP浓度为16%(w/w),K_2HPO_4浓度为14%(w/w),p H为7.5。在此条件下,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分别分配在双水相中的上相和下相,其分配系数分别为7.32和0.38,回收率为88.29%和74.07%。     

复合酶降低牛乳蛋白致敏性的研究

利用胰蛋白酶、风味蛋白酶单独或分布水解牛乳,均使α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、αs-酪蛋白的抗原性降低,结果表明,胰蛋白酶水解60 min后,αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的抗原降低率分别为83％,91％,13％;风味蛋白酶水解60 min后,αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的抗原降低率分别为93％,93％,55％;胰蛋白酶水解40 min,风味蛋白酶水解20min后,αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的抗原降低率分别为96％,96％,71％.因此,胰蛋白酶和风味蛋白酶分步水解牛乳蛋白抗原降低最显著,苦味最低,双酶分步水解后,产生大量分子量在5 000 u以下的肽.胰蛋白酶和风味蛋白酶分步水解牛乳技术将为婴儿配方乳蛋白脱敏提供理论基础.     

凝胶过滤色谱法测定婴儿配方乳粉中α-乳白蛋白

建立了一种用凝胶过滤色谱测定婴儿配方乳粉中α-乳白蛋白的方法。色谱条件:色谱柱为TSK-2000SWXL(7.8 mm×300 mm),流动相为6 mol/L盐酸胍溶液,检测波长280 nm。结果表明:α-乳白蛋白的检出限为2.8μg/m L,回收率在93%~106%之间,相对标准偏差RSD为3.2%。用此方法检测婴儿配方乳粉中α-乳白蛋白,操作简单,结果准确可靠,精密度高,重现性好。     

糖基化反应条件对乳清蛋白——麦芽糖复合物抗原性的影响

研究了将麦芽糖通过糖基化引入到乳清蛋白制备乳清蛋白-麦芽糖,用间接竞争ELISA法测定不同反应时间不同质量比的乳清蛋白-麦芽糖中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性的变化。结果表明,糖基化能有效降低α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性,α-乳白蛋白的抗原性可以从26.2 mg/L降低到14.4 mg/L,β-乳球蛋白的抗原性可以从95.1 mg/L降低到22.4 mg/L。反应时间对不同质量比的乳清蛋白-麦芽糖中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性有较大影响。蛋白与糖的质量比为1～8时,反应相同时间的乳清蛋白-麦芽糖中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性随蛋白与糖的质量比的下降而下降。     

德式乳杆菌保加利亚亚种的乳清蛋白利用能力比较

为了探究德式乳杆菌保加利亚亚种对乳清蛋白的利用能力,研究了8株德式乳杆菌保加利亚亚种菌株在乳清蛋白培养体系中的生长和产酸情况,发酵过程中氨肽酶Pep N、Pep C和Pep X活力变化及乳清蛋白主要组分β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和牛血清白蛋白的利用情况,探讨了不同菌株氨肽酶活力变化与乳清蛋白水解能力之间的相关性。结果表明,在乳清蛋白培养体系中,最适宜菌株生长的初始p H是5. 5,该条件下菌株在3 h内快速生长到达稳定期。在发酵过程(12 h)中,3种氨肽酶活力均表现出先升高后降低的变化趋势,但不同菌株的酶活力之间存在显著差异性。8株菌株均表现出对α-乳白蛋白较强的水解能力(26. 93%～31. 33%),但对于β-乳球蛋白的水解能力存在菌株差异性,β-乳球蛋白的变异体A和B的水解率分别是10. 56%～22. 82%和9. 04%～23. 83%。菌株的氨肽酶活力与β-乳球蛋白的水解能力之间存在一定相关性,DQHXNS8L6和DQHXNS15M2在3 h内即能达到最高的氨肽酶活力并有效水解β-乳球蛋白,具有发酵乳清蛋白饮料的应用潜力。     

气相色谱法测定婴幼儿配方奶粉和母乳中的碘

目的建立气相色谱法测定婴幼儿配方奶粉和母乳中碘的方法。方法在GB 5413.23-2010食品安全国家标准《婴幼儿食品和乳品中碘的测定》的基础上,对碘的气相色谱(gas chromatography,GC)检测方法进行改进,应用改进后的方法对62种婴幼儿配方奶粉和124份母乳样品进行检测。结果碘在1.00~2000.00μg/L范围内线性关系良好,线性相关系数(r~2)为0.9999;检出限、定量限分别为0.30、1.00μg/L;利用不同品牌婴幼儿配方奶粉中碘检测结果的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)考察方法精密度,相对标准偏差值在1.39%~1.61%之间;在5、25、100μg/100 g的加标浓度下,回收率在97.46%~98.98%之间,对应的RSD值在2.52%~2.73%之间。婴幼儿配方奶粉中的碘含量在33.14~132.94μg/100 g之间,母乳样品中的碘含量在31.25~1690.00μg/L之间。结论本方法减少了样品和试剂的使用量,节约了实验成本,简化了实验步骤,提高了检测效率,对于碘的准确测定、保障婴幼儿的健康成长具有重要意义。     

不同来源乳中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量分析

本研究通过高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)对不同种乳中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量进行测定和比较。结果显示,不同来源乳中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白和总蛋白存在一定差异。羊乳中乳清蛋白平均值为0.385 mg/100 g,低于牛乳和牦牛乳;羊乳中乳铁蛋白含量最高,均值为4.43 mg/100 g,最大值9.90 mg/100 g,是优质的乳铁蛋白来源;牦牛乳总蛋白含量(均值3.61%),明显高于牛乳(均值3.22%)和羊乳(均值2.89%);牛奶中乳清蛋白量在三类乳中最高。     

复合酶制备牛乳低致敏性蛋白基料的研究

利用胰蛋白酶、风味蛋白酶单独或分步水解牛乳,研究了α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、αs-酪蛋白的抗原性的变化.结果显示,胰蛋白酶水解60min后,αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的抗原降低率分别为83％、91％、13％,风味蛋白酶水解60min后,αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的抗原降低率分别为93％、93％、55％,胰蛋白酶水解40min,风味蛋白酶水解20min后,αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的抗原降低率分别为96％、96％、71％.因此,胰蛋白酶和风味蛋白酶分步水解牛乳蛋白抗原降低最显著,苦味最低,双酶分步水解后,产生大量分子量在5000u以下的肽.胰蛋白酶和风味蛋白酶分步水解牛乳技术,将为婴儿配方乳蛋白脱敏提供理论基础.     

乳清蛋白-低聚异麦芽糖模拟胃液消化过程中抗原性的变化

目的 研究乳清蛋白-低聚异麦芽糖和乳清蛋白在模拟胃液消化过程中抗原性及游离氨基酸的变化。方法 乳清蛋白(WPI)-低聚异麦芽糖制备后, 对WPI-低聚异麦芽糖及WPI模拟胃液消化过程中的抗原性变化和游离氨基酸含量进行分析。结果 糖基化后乳清蛋白中精氨酸、酪氨酸、胱氨酸和赖氨酸的含量显著降低。经过模拟胃液消化, 乳清蛋白和乳清蛋白-低聚异麦芽糖中α-乳白蛋白的抗原性降低到1 μg/mL以下, 乳清蛋白中β-乳球蛋白抗原性降低到42.83 μg/mL, 乳清蛋白-低聚异麦芽糖中β-乳球蛋白抗原性降低到15.66 μg/mL。结论 经过模拟胃消化, 乳清蛋白-低聚异麦芽糖中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性比乳清蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性低; 在模拟胃液消化过程中, 乳清蛋白-低聚异麦芽糖比乳清蛋白更容易受到胃蛋白酶酶解。     

亚麻酸对乳蛋白理化性质与免疫球蛋白G/E结合能力的影响

目的 探索亚麻酸对乳蛋白理化性质与免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig) G/E结合能力的影响。方法 以α-乳白蛋白和β-乳球蛋白为实验材料,通过非还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(Sodium Dodecyl Sulfate-polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE)、扫描电镜、粒径以及Zeta电位、间接竞争酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)法评价亚麻酸对乳蛋白理化性质以及与IgG和IgE结合能力的影响。结果 亚麻酸能够增强乳蛋白的IgG/IgE结合能力,并且通过扫描电镜、粒径以及Zeta电位结果发现,亚麻酸的加入导致α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的颗粒变大,粒径变大,并且稳定性更强,说明亚麻酸诱导乳蛋白发生了分子间的聚合,形成高聚物。结论 亚麻酸诱导α-乳白蛋白和β-乳球蛋白形成聚合物并促进IgG/IgE结合能力增强。