全细胞SELEX法筛选单增李斯特菌的ssDNA适配体

以单增李斯特菌活细胞为靶标,采用指数富集配基的系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)从含40个随机碱基序列的单链DNA(single-stranded DNA,ss DNA)文库中筛选与之特异性结合的适配体。酶联配体吸附法(ELASA)测定筛选过程中次级文库与单增李斯特菌结合力的变化。对筛选得到的适配体进行序列测定,RNA structure软件预测二级结构,ELASA测定适配体与靶标的结合能力和特异性。结果显示,每轮筛选后次级文库与靶标的亲和力增强,特异性适配体逐步得到富集。测序获得23条适配体,其序列同源性不高,但预测的二级结构有些相似,根据二级结构将其分为3个群,分析结果表明二级结构与适配体的亲和力有关。挑选亲和力较强的21号(Lma-21)和35号(Lma-35)适配体能特异性地识别单增李斯特菌。本研究为开发食源性病原菌单增李斯特菌的新型检测试剂提供了基础材料。     

基于计算机模拟技术优化筛选核酸适配体的初探

目的:通过分子模拟技术优化筛选5’单磷酸腺苷(AMP)的高特异性适配体,利用胶体金可视化试验验证筛选结果。方法:研究文献中已知的AMP原始适配体(S0)的结合位点,对7个关键碱基进行多轮迭代单点突变,获得新的适配体,进一步比较结合自由能,优化获得特异性高的适配体序列。结果:历经5轮筛选,优化筛选出4个特异性高的新序列(S1-S4),使用胶体金的可视化检测对最佳新序列(S4)和原始序列(S0)作比较,结果发现试验结果与模拟结果一致性良好。结论:计算机模拟技术优化筛选适配体具有省时、易制备、分子质量小、储存运输简单等多种优势,为快速获得特异性适配体提供了一个新方法、新思路。     

河豚毒素DNA适配子的制备及应用

人工合成78 个碱基的随机ssDNA文库,采用指数富集配基的系统进化技术与诱变聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）结合的方法,通过筛选富集、克隆、测序,获得了与河豚毒素（tetrodotoxin,TTX）特异结合的单克隆DNA适配子A3。DNA适配子A3的二级结构主要为茎环结构,与TTX的亲和力为1.254。对适配子和TTX结合的磷酸盐缓冲液pH值、荧光染料结合时间进行优化,结果表明,最适pH值为7.5,最佳结合时间为10 min。建立的快速筛选检测TTX的DNA适配子-荧光染料法对TTX的检出限为10－6 mo1/L。     

河豚毒素DNA适配子的筛选与结构分析

人工合成113个碱基的随机ssDNA文库,以河豚毒素为靶物质,采用SELEX技术进行12轮筛选,测定各轮富集文库与河豚毒素的亲和力,其中第10轮富集文库与河豚毒素的亲和力最高。将第10轮富集文库进行克隆、测序,用DNAMAN软件分析克隆子的一级和二级结构,并测定克隆子与河豚毒素的亲和力。结果表明:与河豚毒素结合力高的DNA适配子经过10轮筛选后得到富集,成功筛选到最高亲和力的DNA适配子G10。     

基于适配体拉曼光谱技术快速检测肠炎沙门氏菌方法

目的:应用SELEX技术筛选高亲和力、高特异性适配体,利用该适配体结合拉曼光谱技术建立肠炎沙门氏菌快速检测方法。方法:采用全细菌指数富集的配体系统进化技术(whole-bacteria systematic evolution of ligands by exponential enrichment,whole-bacteria-SELEX)筛选肠炎沙门氏菌特异性核酸适配体,并采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)与SERS技术对筛选出的适配体亲和力及特异性进行评价,建立肠炎沙门氏菌检测方法。结果:本研究通过对肠炎沙门氏菌进行十五轮SELEX筛选,并通过ELISA对其亲和力进行评价,筛选出Aptamer₄、Aptamer₁₀、Aptamer₁₂三条候选适配体,并通过SERS技术确认Aptamer₄为亲和力最佳适配体;将Aptamer₄与肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌等5种混合菌结合,结果表明,通过SERS技术可特异的检测出肠炎沙门氏菌,且该方法重复性较好,其最低检测限的细菌浓度为102 CFU/mL。且在猪肉样品的检测中,肠炎沙门氏菌的回收率为93.37%~100.18%。结论:应用SELEX方法成功筛选出与肠炎沙门氏菌高特异性、高亲和力适配体,并建立基于表面增强拉曼光谱技术快速检测肠炎沙门氏菌的方法,该方法特异性强、灵敏度高、成本低、快速简便,可应用于食品加工过程中肠炎沙门氏菌的快速检测。     

基于适配体的沙门氏菌检测方法研究进展

沙门氏菌(Salmonella)是重要的食源性致病菌,能引起人和动物中毒并引起多种严重的疾病,对人类健康造成了巨大危害,因此建立简单高效的检测方法是预防和控制沙门氏菌疾病的关键。适配体(aptamer)是通过指数富集配体的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)从构建的随机文库中筛选得到一段对靶标物质具有高度亲和力和特异性的寡核苷酸序列,多种食品致病菌的适配体已被成功筛选并广泛应用于食品中致病菌的检测。本文对当前沙门氏菌检测技术进行简单论述,重点介绍了基于适配体的沙门氏菌检测方法,对各种方法的优势和缺点进行了比较和总结,并论述了适配体的发展及应用。     

适配体功能化的DNA水凝胶的制备及其在食品安全小分子快速检测中的应用

DNA水凝胶是具有三维聚合物网络的高保水性材料。研究人员设计了多种DNA水凝胶交联制备方法, 并通过向其中引入其他功能分子或与其他类型的功能材料相互结合, 构建了具有优异性能的DNA水凝胶, 受到了广泛关注。适配体是基于指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技术从随机寡核苷酸文库中筛选获得的对目标物质具有良好特异性与亲和力的寡核苷酸序列。适配体功能化的DNA水凝胶具有靶向范围广、稳定性好、易于修饰、操作简单和成本低等优点, 得到了广泛应用。本文概述了构建适配体功能化的DNA水凝胶的基本设计原则与分类, 重点介绍了适配体功能化的DNA水凝胶在食品安全检测中的最新策略, 最后, 讨论了适配体功能化的DNA水凝胶面临的挑战以及对未来的展望, 旨在为其在食品安全领域的应用提供参考。     

核酸适配体在食源性致病菌检测中应用的研究进展

核酸适配体(aptamer)是经体外筛选可特异性识别并结合靶分子的寡核苷酸片段(单链DNA/RNA序列),具有高特异性、高灵敏度、高亲和力及易于修饰等优点,已在食源性致病菌检测领域得到应用。本文主要对核酸适配体筛选技术分类以及纳米金适配体技术、荧光适配体技术、电化学适配体技术、流式细胞适配体技术和表面增强拉曼适配体技术在食源性致病菌检测中的应用作简要综述。     

基于土壤宏基因组文库筛选非培养木聚糖酶基因

采用物理化学法提取土壤基因组DNA,将土壤DNA纯化后采用序列筛选策略获得非微生物纯培养方式的木聚糖酶基因。序列筛选依据木聚糖酶保守序列设计简并引物,PCR扩增获得200 bp的木聚糖酶核心序列,构建了约5 000个克隆子的序列文库。随机挑取200个克隆子测序,获得11条来自未培养微生物的木聚糖酶核心序列。并对其中细菌源序列1~19进行研究,利用HiTAIL-PCR扩增细菌源序列1~19的木聚糖酶基因全长,分析其编码蛋白,并将其与表达载体pET-28a(+)连接后导入E.coli表达,超声破壁后测得木聚糖酶酶活力为(19.94±0.3)U/mL。利用序列筛选获取土壤宏基因组源木聚糖酶基因的研究为筛选获得土壤未培养微生物木聚糖酶基因新资源提供了新的途径。     

河豚毒素DNA适配子核心区域的识别

用DNA folding form在线软件分析河豚毒素DNA适配子A3、G10的二级结构,根据二级结构,分别合成适配子A3、G10的各4个区域的5’端地高辛标记的序列。用丙烯酸-环氧乙烷珠子固定河豚毒素,测定抗地高辛碱性磷酸酶的适宜稀释倍数,用地高辛-抗地高辛碱性磷酸酶系统检测各区域与河豚毒素的亲和力,识别出适配子的核心区域。结果表明,抗地高辛碱性磷酸酶的适宜工作浓度为2×104倍稀释;合成的适配子A3的4个区域中,A3-2区域与河豚毒素的亲和力最强,即适配子A3的核心区域为A3-2区域,实际上含有47个核苷酸;合成的适配子G10的4个区域中,G10-4区域与河豚毒素的亲和力最强,即适配子G10的核心区域为G10-4区域,实际上含有56个核苷酸。     

Non-SELEX method for aptamer selection against β-casomorphin-7 peptide

The non-systematic evolution of ligands by the exponential enrichment (non-SELEX) method was used in the present study for the selection of β-casomorphin-7 (BCM-7)-specific aptamers. These aptamers were tested to evaluate their ability to detect BCM-7 peptide in the human urine sample. The method did not employ aptamer amplification and counterselection as used in conventional SELEX but included a negative round of selection. The selection was performed in a single day, and after 5 rounds, a total of 16 numbers of aptamer were identified through Sanger sequencing. Newly selected aptamers named sequence ID no. 3 have performed better than other aptamers in detecting the BCM-7 peptide. Sequence ID no. 3 was also compared with previously selected aptamers through the SELEX method and its performance was found to be better than old aptamers. The sensing experiment was tried on different platforms from magnetic beads to the membrane. In each strategy, satisfactory results were obtained with aptamers that recognized BCM-7 spiked in a human urine sample at a very low amount. The non-SELEX method is an easy and time-saving process for aptamer selection. Selection of viable aptamers from a large pool of sequences for sensing experiments is a tedious job; however, an attempt has been made to select aptamers on the basis of In Silico (http://www.unafold.org/, https://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/index.php) information, observing DNA band intensity on agarose gel and colorimetric results obtained on magnetic beads and membrane. These aptamers have the potential in biosensor making for detecting BCM-7 peptide in urine samples of autistic patients.     

指数富集的配体系统进化技术研究进展及在食品检测中的应用

核酸适配体是指能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的寡核苷酸序列,可识别的靶分子范围非常广,并均可通过指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选得到。近年来,在传统SELEX技术的基础上,新的SELEX技术不断出现。这些新技术的出现,在不断完善SELEX技术的同时,也极大地推动了适配体技术在各学科领域中的发展及应用。本文对核酸适配体的筛选方法进行了总结,并介绍了其在食品检测领域的应用现状和发展方向,为核酸适配体的筛选与应用提供了参考。     

农药核酸适配体筛选及应用的研究进展

核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术在体外筛选到的单链寡核苷酸,与靶标具有高亲和力和特异性,且稳定性好,易于合成和修饰,被认为是生物传感器的理想识别元件之一,在农药残留快速检测应用中表现出极大的潜力。近年来,SELEX技术在农药适配体筛选方面不断发展,目前已筛选获得多种农药适配体,并且通过诸多方法研究所筛选的适配体与农药分子的结合机理,为适配体在农药残留快速检测的进一步应用提供参考依据。本文概括和总结了以农药为靶标的适配体筛选方法、农药分子与适配体的结合机理,并简要总结了以适配体为识别元件的生物传感器在农药残留快速检测中的应用。     

氧化石墨烯指数富集法筛选食品中的组胺适配体

组胺(HA)是影响人类健康和食品质量的重要生化物质。对其进行快速、准确检测和鉴定至关重要。本试验利用氧化石墨烯对单链寡核苷酸(ssDNA)的强吸附作用,分离与靶标结合和未结合的ssDNA,对组胺适配体进行11轮的体外指数富集筛选,最终得到15条高亲和力和特异性的适配体。通过后续的适配体二级结构、亲和性和特异性分析,HAA-4和HAA-7被确定为最佳候选适配体,可被作为将来关于组胺的新型检测方法构建的候选适配体。本文首次利用氧化石墨烯指数富集(GO-SELEX)技术筛选出对组胺具有较高亲和特异性的适配体,为后续利用适配体对食品中组胺快速检测奠定了基础。     

甲胺磷的核酸适体筛选

目的 筛选识别甲胺磷的DNA适体。方法 体外合成ssDNA 文库, 将其固相化于琼脂糖凝胶颗粒表面, 液相中甲胺磷与其结合的DNA分子从固相表面分离, 进而建立非固相化SELEX技术, 最终获得识别甲胺磷的适体, 采用DNAMAN和RNA structure软件对适体进行一、二级结构分析。结果 经过10 轮筛选, ssDNA 文库与甲胺磷的亲和力呈上升趋势, 随机挑选的20个阳性克隆适体根据一级结构的同源性可分为5个家族, 二级结构预测以茎环结构为主。结论 本方法大大提高了适体的筛选效率, 最终筛选得到能识别甲胺磷的DNA适体。     

肠致病性大肠杆菌适配体筛选研究

目的食源性致病菌引起的食源性疾病已成为全球食品安全面临的巨大威胁,其中由大肠杆菌引起的食源性疾病最为常见。因此发展快速、准确检测大肠杆菌的方法对于保障食品安全、保护国民健康具有重要意义。方法应用Whole bacteria-SELEX(指数富集的配体系统进化技术),以肠致病性大肠杆菌为靶标,经过15轮的筛选富集,将所得产物进行克隆测序,并结合荧光分析考察所得序列的亲和力和特异性,根据解离常数值分析比较序列的亲和力和特异性,最终得到2条(Seq.1和Seq.28)与肠致病性大肠杆菌高特异性结合的适配体。结果适配体Seq.1和Seq.28均对肠致病性大肠杆菌表现出了相对良好的亲和力和特异性(对其他菌的相对亲和力均低于15%),解离常数分别为45.06±6.797和32.31±6.002 nmol/L。结论本文利用SELEX技术筛选特异性识别肠致病性大肠杆菌适配体,具有稳定性高、合成方便、易标记等特点,可进一步应用于食品中肠致病性大肠杆菌的快速检测。