利用秸秆水解液五、六碳糖共发酵产琥珀酸放线杆菌的酶活分析及定向选育

目的:在产琥珀酸放线杆菌主要酶活分析基础上选育出高产突变株对工业规模生物转化农作物秸秆制备琥珀酸具有重要意义.方法:采用酸解方法处理原料秸秆并利用高效液相检测降解糖分,在菌株主要酶活分析及调控的基础上,利用软X射线诱变结合丙烯醇抗性平板进行定向选育以降低乙醇流量,并对代谢酶活进行了分析.结果:秸秆水解液的检测表明200g的秸秆干粉酶解得约47g的葡萄糖和约26g的木糖,酶活分析表明,Pepck、Pc及Mdh是琥珀酸合成重要代谢酶且酶活可调控,发现乙醇脱氧酶(Adh)的高酶活造成了大量副产物乙醇的生成.筛选出的丙烯醇抗性突变株S.JST01的乙醇产量由8.9g/L降为1.4g/L,降低了84%,而琥珀酸流量产量由54.2g/L升至63.1g/L,升高了16%.酶活检测表明Adh的酶活力单位从614U降低到108U.结论:围绕产琥珀酸放线杆菌Adh酶活降低实施定向选育有助于提高琥珀酸的流量,突变株的末端产物琥珀酸累积达63.1g/L,具有工业应用潜力.     

丙酮酸羧化酶对酿酒酵母积累琥珀酸的作用探究

为探究丙酮酸羧化酶及微量元素Ca~(2+)和生物素对酿酒酵母积累琥珀酸的作用,敲除了琥珀酸脱氢酶编码基因(SDH2)并过量表达来自米根霉的丙酮酸羧化酶基因(Ro PYC)。琥珀酸产量由(0. 011±0. 002) g/L提高至(0. 841±0. 020) g/L,较表达前提高了75. 45%。随后,外源添加不同浓度Ca~(2+)和生物素考察其对琥珀酸发酵的影响,结果发现,Ca~(2+)的添加促进了菌体的生长但不利于琥珀酸的积累,而外源添加浓度为16、32、64、96μg/L生物素时,琥珀酸产量分别提高75. 04%、84. 26%、69. 28%、66. 79%。其中生物素质量浓度为32μg/L时,琥珀酸产量达到最大为(0. 964±0. 02) g/L,且丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC)酶活提高14. 42%,说明PC酶活的提高促进了酿酒酵母中琥珀酸的积累。该研究为解决酿酒酵母琥珀酸合成过程中前体碳代谢流不足问题提供了新的解决思路。     

琥珀酸产生菌原生质体的复合诱变

利用酶解法制备琥珀酸产生菌的孢子原生质体,对其进行紫外线与He-Ne激光的复合诱变,筛选到了一株突变株MS-23,其琥珀酸产量为1.27g/L,是出发菌株产酸量的20.16倍。将此菌株连续传代5次,具有较好的遗传稳定性。     

匍枝根霉诱变株β-葡萄糖苷酶结构功能研究及发酵优化

经紫外-甲基磺酸乙酯复合诱变选育得到的匍枝根霉诱变株TZ-03,其产β-葡萄糖苷酶(β-glycosidase,BG)能力显著提高,酶活峰值高达10. 53 IU/mL,较原菌TP-02提高1. 52倍。为研究该诱变株产酶差异内因,比较诱变前后bg基因转录水平,并克隆得到BG编码基因bgl4,利用Swiss model和Discovery Studio 3. 0等生物信息学软件进行结构建模及分析。结果表明,诱变后bgl4基因转录水平上调90. 19%,其可导致蛋白表达量的提高,从而可能引起BG酶活的提高。且诱变后BGL IV活性中心构象变化可能更有利于酶与底物的结合,对酶活的提高也有一定的促进作用。为进一步提高TZ-03的BG产量,经摇瓶优化确定最佳培养基为:微晶纤维素20 g/L、鱼粉蛋白胨10 g/L、谷氨酸1 g/L、CaCl_22 g/L、KH_2PO_43 g/L、MgSO_4·7H_2O 4 g/L、PEG-4000 0. 25 g/L、麸皮浸出汁2. 5%、Tween 80 200μL/L、微量元素液1 mL/L,TZ-03可在培养108 h达到BG酶活峰值22. 15IU/mL。利用10 L发酵罐进行放大培养TZ-03,使BG酶活在84 h达到最大值41. 62 IU/mL。     

富产琥珀酸米曲霉菌株的诱变选育

以米曲霉AS3.042为出发菌株,经过紫外线诱变后选育出一支琥珀酸产量高的菌株AS-4。以AS-4为出发菌株,采用亚硝基胍诱变后得到一支富产琥珀酸米曲霉诱变菌株ASC-5。该菌株经摇床培养后,琥珀酸产量达到3.60 g/L,相同条件下为出发菌株的371倍,为单用紫外线诱变后的菌株AS-4的13.43倍。     

耐酸性高产琥珀酸放线杆菌的诱变选育

在确定产琥珀酸放线杆菌ATCC55618菌株生长的临界pH为4.5之后,对其进行紫外诱变,筛选出耐pH3.5强酸的菌株M1,产量为17.25g/L,较原始菌株提高了12.09%,之后用含0.1%的溴甲酚绿变色平板筛选,对M1进行两轮紫外-亚硝基胍复合诱变,筛选出琥珀酸高产菌株R2,该菌株琥珀酸产量为27.35g/L,较原始菌株产量提高了77.71%。     

琥珀酸产生菌的诱变与选育

对琥珀酸产生菌S-1进行紫外线亚硝基胍的复合诱变后,筛选出琥珀酸产量高,遗传性状稳定的菌株S-57,并对其进行激光诱变,筛选出菌株SH-24,相同发酵条件下琥珀酸产量达到21.25g/L,相对于未诱变菌株产量提高了343倍。     

高菊粉酶活酿酒酵母的诱变选育

以安琪酿酒酵母为出发菌株,采用紫外与微波2种物理诱变方法进行复合诱变.经过初筛与复筛,选育出了高菊粉酶活突变菌株Y05,其酶活达到90.97U/mL,约为出发菌株的8倍.经多次传代证明该菌株遗传稳定性良好.当培养基中菊粉浓度200g/L时,经30℃72h发酵突变菌株Y05发酵液乙醇浓度为71.78g/L,乙醇得率为0.43g/g,分别比出发菌株提高了42.5%和13.2%.     

常压室温等离子诱变选育L-天冬酰胺酶高产重组菌

以Bacillus subtilis WB600为宿主,构建了能分泌表达L-ASNase的重组菌,并通过常压室温等离子体诱变进一步提高了重组菌的产酶量。重组Bacillus subtilis WB600(p MA5-wap Aans Z)发酵30 h,胞外酶活达到37.2 U/m L,表明L-ASNase在信号肽wap A介导下能分泌至胞外。在功率120 W、气流量10 L/min、诱变时间40 s的诱变操作条件下,对重组菌进行了等离子体诱变。突变株的酶活最高达48.4 U/m L,较诱变前提高30%。上述结果表明,常压室温等离子体诱变能有效提高重组菌产L-ASNase的酶活.研究结果为L-ASNase的工业化生产提供了高效的生产菌株。     

乳酸克鲁维酵母常温常压等离子体诱变选育及其突变株整细胞催化特性

采用常温常压等离子体（ARTP）诱变方法,以耐20 g/L的苯乙酮毒性和酮基还原酶酶活作为筛选标记,对乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）进行选育,得到酮基还原酶酶活2.72 U/mL的突变菌株KL5,并研究了该菌株在不同碳源、氮源中的生长特性及对底物苯乙酮转化能力。结果表明,蔗糖、酵母浸粉分别是突变株的最佳碳源和氮源;在一次添加苯乙酮20 g/L底物,蔗糖22.0 g/L,酵母浸粉10.0 g/L,磷酸二氢钾3.0 g/L,七水合硫酸镁1 g/L的催化条件下,28 ℃、200 r/min转化48 h,诱变菌株KL5对苯乙酮转化率可达到91.8%,比出发菌株提高2.5倍。该菌株具有广阔的生物催化应用前景。