可视化-环介导等温扩增技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H

目的建立可视化的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)联合横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)方法检测肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)0157:H7的分析方法。方法以EHEC 0157:H7的遗传标志性基因z3276基因序列为检测靶标设计6条LAMP特异性引物,其中2条环引物分别标记异硫氰酸荧光素和地高辛,用LFD检测扩增产物,建立EHEC0157:H7 LAMP-LFD检测方法。结果所建立的检测方法能够特异性的检测EHEC 0157:H7,与试验对照菌株EHEC 026、0145、045、0121,及其他主要大肠杆菌血清型025、078、0103、O111、0127、0138、0139、0141,及禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)E058、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)SEC627、EPEC SEC689、K12-MG1655、BL21,和其他种属的受试菌,不存在交叉反应;对EHEC 0157:H7纯培养物的最低检测限为1.3 CFU/mL。结论本研究所建立的LAMP-LFD检测方法特异性和敏感性良好,操作简单,结果可视。     

可视化-环介导等温扩增技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7

目的 建立可视化的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)联合横向流动试纸条(lateral flow dipstick, LFD)方法检测肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)O157:H7的分析方法。方法 以EHEC O157:H7的遗传标志性基因z3276基因序列为检测靶标设计6条LAMP特异性引物, 其中2条环引物分别标记异硫氰酸荧光素和地高辛, 用LFD检测扩增产物, 建立EHEC O157:H7 LAMP-LFD检测方法。结果 所建立的检测方法能够特异性的检测EHEC O157:H7, 与试验对照菌株EHEC O26、O145、O45、O121, 及其他主要大肠杆菌血清型O25、O78、O103、O111、O127、O138、O139、O141, 及禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)E058、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)SEC627、EPEC SEC689、K12-MG1655、BL21, 和其他种属的受试菌, 不存在交叉反应; 对EHEC O157:H7纯培养物的最低检测限为1.3 CFU/mL。结论 本研究所建立的LAMP-LFD检测方法特异性和敏感性良好, 操作简单, 结果可视。     

环介导等温扩增结合免疫层析试纸条快速检测羊肉及其制品中的鸭源成分

为实现肉及肉制品中掺假成分的快速检测,本文将环介导等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification,LAMP)与免疫层析试纸条(immunochromatographic test strip,ICTS)相结合,建立了一套可在羊肉及其制品中特异并灵敏地检测出鸭源性成分的方法。根据鸭特异性细胞色素b(cytb)基因的6个特异性区域设计LAMP引物,其中两条内引物FIP和BIP分别使用生物素(biotin)和地高辛(digoxin)标记。使用LAMP扩增技术于65℃下扩增30 min产生生物素和地高辛标记的双链DNA产物,将扩增产生的双链DNA产物(10 μL)与90 μL上样缓冲液(PBS pH=7.4)混合均匀后使用免疫层析试纸条进行可视化检测。本研究所建立的LAMP-ICTS方法能够在40 min内特异性地检测出羊肉及其制品中的鸭源成分,且与其他肉类不存在交叉反应,检出限可达到0.01%(w/w)。市售实际样品检测结果显示,所采集的羊肉片、羊肉串样品中均有鸭源性成分,且此结果与行业标准方法(PCR-电泳)的检测结果一致。LAMP-ICTS方法具有灵敏度高、特异性好、检测速度快、对仪器的依赖低等优点,适用于基层监管部门对羊肉及其制品真伪进行快速检测。     

转基因产品的PCR-ELISA液相杂交检测条件的研究

确定杂交液成分,选择探针浓度,将5’端标记生物素的PCR扩增产物与5’端标记地高辛的探针呈液相混合,在PCR管中按优化后的条件(92℃,5 min;55℃,5 min)进行液相杂交.杂交产物通过链霉亲和素被固定在微孔表面,同时在含高浓度二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)的杂交液中将非特异结合的探针解离,然后对被固定的特异杂交产物进行ELISA检测.PCR-ELISA液相杂交检测方法操作简便,特异性高,避免了繁琐的杂交程序和对人体有害的溴化乙锭,适用于转基因产品及其加工食品的快速检测.     

环介导等温扩增法检测食品过敏原大豆成分

目的 建立食品过敏原大豆成分的环介导等温扩增(LAMP)分析方法。方法 根据大豆的内源管家基因Lectin基因设计6条过敏原大豆的特异性引物(两条内引物, 两条外引物和两条环引物), 建立LAMP检测方法。结果 环介导等温扩增法在63 ℃条件下, 40 min内可检出过敏原大豆成分, 该方法能够有效对大豆成分进行快速检测, 具有较强的特异性, 灵敏度可达0.01%(w/w)大豆粉。结论 该方法特异性强, 灵敏度高, 可以快速、准确检测食品中过敏原大豆成分。     

应用LAMP快速检测金黄色葡萄球菌的研究

建立环介导等温扩增技术(Loop-medisothermalamplification,LAMP)快速检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus).根据金黄色葡萄球菌nuc基因序列中的保守区域设计了4条特异性引物,在65℃等温条件下,45min即可扩增出梯形条带.LAMP检测金黄色葡萄球菌纯培养物的...     

环介导等温扩增技术检测肉及肉制品中沙门氏菌

建立用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测肉及肉制品中沙门氏菌的方法。利用靶基因的6 个区段设计4 条引物,应用具有链置换活性的Bst DNA 聚合酶,能够在恒温(65℃左右)条件下特异、高效、快速地扩增待测物的DNA。针对沙门氏菌的特异基因invA 基因设计两对LAMP 引物,建立LAMP 检测沙门氏菌的新方法,并对肉及肉制品中的沙门氏菌进行检测。结果表明：建立LAMP 技术检测肉及肉制品中沙门氏菌的方法,该方法能够特异检测沙门氏菌,且灵敏性可达10-9CFU/mL,对48 份样品检测,该方法检出率为91.6%、敏感性100%、特异性70.0%、符合率为93.8%、检出时间1.5h。     

双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术结合核酸杂交侧流条快速检测牛肉中的鸡、鸭、猪源性成分

目的? 建立快速、简便、经济的双拖尾重组聚合酶恒温扩增结合核酸杂交试纸条快速检测牛肉中鸡源、鸭源、猪源性成分的可视化检测技术。方法? 采用多重双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术(multiplex recombinase polymerase amplification,mRPA)与核酸杂交试纸条相结合。对鸡、鸭、猪线粒体D环区域设计特异性拖尾RPA引物,扩增出双拖尾的RPA产物。鸡、鸭、猪3个物种RPA产物的拖尾序列分别与红、黄、蓝三种颜色的金纳米探针和试纸条上的检测探针杂交,形成肉眼可见的红、黄、蓝三色条带,整个RPA扩增(15 min)和试纸条检测(5 min)过程在20 min内即可完成。结果? 该方法对牛肉中鸡、鸭、猪肉的检测限达0.01%,且仅对鸡、鸭、猪肉DNA有特异性,与其他10个物种的DNA均无交叉反应。采集50份市售牛肉样品,使用该方法进行真实性检测:10份牛肉干、10份生牛肉、10份酱牛肉中未检测出其他动物源性成分,10份牛肉馅料中检测出1份含猪源性成分,10份牛肉片中检测出1份含鸡源性成分。该方法与PCR结合凝胶电泳的检测结果具有很好的一致性。结论? 双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术结合核酸杂交试纸条具有特异性强、灵敏度高,操作简单的优点,可实现牛肉中鸡、鸭、猪源性成分的同时可视化快速检测。     

实时LAMP法快速检测食用植物油中的转基因成分CaMV-35S

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一项新的DNA扩增技术,近年来已被成功应用于转基因作物中外源基因的检测分析。本文针对花椰菜花叶病毒35 S启动子(CaMV-35S)设计引物以及有效提取目标DNA后,首次建立了食用植物油中CaMV-35S启动子的LAMP检测方法。通过在DNA提取过程中加入正己烷乳化和加入共沉淀剂,获得了可以进行LAMP扩增的DNA片段,采用LAMP实时浊度法和染色法对扩增产物进行比较分析。着重对FIP/BIP引物、甜菜碱和Mg2+浓度等反应参数进行了优化。结果表明,LAMP方法能够在56 min内特异性地检测到CaMV-35S启动子,检测灵敏度比常规PCR高10倍,而且不需要特别的仪器设备,扩增产物可通过观察实时浊度曲线或通过SYBR Green I染色后借助肉眼对检测结果进行判断。该方法快速高效、操作简便、灵敏度高、检测结果准确,适合食用植物油中转基因成分的快速检测。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度(LAMP)检测方法的建立

建立单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度LAMP检测方法。根据单核细胞增生李斯特氏菌hly A基因设计4条特异性引物,采用环介导等温扩增方法 (LAMP)建立单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法。建立的LAMP方法具有高度特异性,经对14株细菌进行扩增,单核细胞增生李斯特氏菌为LAMP阳性,其他菌株均为LAMP阴性。建立的LAMP方法对培养的单核细胞增生李斯特氏菌的检测下限为32 CFU/m L,可在60 min内完成扩增反应。用建立的LAMP方法对160份不同食品进行检测,共检出5份LAMP阳性样本,与传统培养方法结果一致。该方法与传统方法相比,可节省大量时间,且对试验仪器和操作人员的要求低,具有良好的实用性。