VmaH和PMA在指状青霉中的表达及其作为潜在杀菌作用靶点的可能性

目的：研发安全、高效、具有新型作用靶点的杀菌剂，在对指状青霉（Penicillium digitatum）VmaH和PMA进行生物信息学和表达模式分析的基础上，进一步探讨两个基因作为潜在杀菌作用靶点的可能性。方法：以指状青霉为实验材料，使用Pfam、MEGA 5.0等在线软件对VmaH和PMA的编码蛋白进行生物信息学分析，进一步利用实时聚合酶链式反应技术分析VmaH和PMA在指状青霉中的表达规律。结果：结构域预测发现，VmaH具有2 个非常保守的结构域，分别为N端结构域和C端结构域；PMA具有3 个非常保守的结构域，分别为N端结构域、E1-E2 ATPase结构域和水解酶结构域。同源比对结果发现真菌物种中VmaH和PMA的氨基酸相似度分别为79%、80%，表明不同真菌间VmaH和PMA高度保守。进化树分析显示指状青霉VmaH和PMA与青霉属和曲霉属的VmaH和PMA具有较近的亲缘关系。相较于PMA，VmaH在指状青霉的整个生长过程中一直保持较高的表达水平，而PMA的基因表达水平在指状青霉生长后期显著下调。葡萄糖饥饿显著降低了VmaH和PMA的基因表达水平，葡萄糖回补可以恢复两个基因的表达水平，尤其是VmaH的表达量会显著上调。极酸极碱条件下VmaH和PMA的表达量均显著下调，弱酸和弱碱性环境使PMA基因的表达量增加。氧化、还原剂处理均能显著降低VmaH和PMA的表达水平，且PMA的下调尤为显著。PMA在不同杀菌剂处理条件下表达量均显著下降；而VmaH对不同杀菌剂处理的响应有所差异。结论：通过VmaH和PMA的生物信息学和表达规律分析，可以将VmaH和PMA所编码的蛋白作为指状青霉潜在杀菌作用靶点进行深入研究。     

乳酸菌产苯乳酸对指状青霉的抑菌活性及作用机理

为探究乳酸菌Lactobacillus plantarum CKXP13和L. plantarum CWXP24产苯乳酸的能力以及苯乳酸对柑橘绿霉病的控制效果及其抑菌机理,本实验使用高效液相色谱法测定这两株乳酸菌的苯乳酸产量,并通过研究苯乳酸处理后指状青霉的孢子存活率、菌落直径、菌丝形态、胞外电导率来探究其抑菌机理,最后以柑橘果实绿霉病干预实验探究苯乳酸对绿霉病的控制效果。结果表明,L. plantarum CKXP13、L. plantarum CWXP24均能产生苯乳酸,产量分别为42.4 mg/L和91.9 mg/L,苯乳酸质量浓度为2.5、5.0、10.0 mg/mL条件下,指状青霉的孢子存活率、菌落直径随苯乳酸质量浓度上升而显著降低（P＜0.05）,菌丝也随苯乳酸质量浓度升高出现表面粗糙、相互缠绕、形成塌陷或树瘤状凸起的情况,同时乳酸菌还能增强病原菌细胞膜的通透性,促进细胞内容物泄漏,导致病原菌死亡。果实绿霉病干预实验证明,10、20 mg/mL苯乳酸都能有效控制柑橘果实绿霉病。综上所述,苯乳酸作为天然杀菌剂在控制柑橘采后绿霉病方面具有良好的应用潜力和开发前景。     

柑橘采后病原菌意大利青霉PacC基因的克隆及表达分析

为初步分析柑橘采后病原菌意大利青霉（Penicillium italicum）pH信号传导途径中转录因子PacC的功能特性,克隆了PacC基因并对其进行生物信息学和表达模式分析。结果表明:PacC基因全长1921 bp,有1个内含子,编码蛋白质的氨基酸数量为636个,共包含3个转录因子典型的锌指蛋白结构域。进化树分析显示,PacC与指状青霉（Penicillium digitatum）和产黄青霉（Penicillium chrysogenum）亲缘关系较近。离体培养条件下PacC在意大利青霉生长中稳定表达;培养基pH影响意大利青霉生长与PacC表达,酸性条件下表达量显著下调（P<0.05）,碱性条件下表达量显著上调（P<0.05）;碳源条件影响该基因表达,葡萄糖饥饿和回补均显著提高PacC表达（P<0.05）;低浓度蔗糖引起培养液pH碱化,显著刺激PacC表达（P<0.05）,高浓度蔗糖引起培养液pH酸化,PacC表达逐渐下调（P<0.05）。活体结果表明,不同品种柑橘果实接种意大利青霉会导致果皮pH下降;接种初始pH影响意大利青霉的致病力,PacC在侵染柑橘果实期间表达较为稳定。这些结果表明,环境pH和碳源供应均能影响意大利青霉PacC表达,影响意大利青霉的致病性。     

柑橘绿霉病中草药高效抑菌剂的筛选及抑菌机理研究

利用牛津杯法筛选出对柑橘绿霉病菌(指状青霉)有最佳抑制作用的中草药提取物,并通过测定培养液电导率变化等对其抑菌机理作进一步研究。结果表明:桂枝、桂皮、香薷等乙醇提取物对指状青霉均有较好的抑制效果,抑制圈均在20 mm以上,其中以桂枝的抑菌活性最佳,对指状青霉的抑制圈大小达31.56±0.66 mm,最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)分别为6.25mg/mL、12.5 mg/mL,且其抑菌效果显著优于化学杀菌剂百可得。同时桂枝提取物对指状青霉菌的孢子萌发及菌丝生长发育也有较强的抑制作用,在提取液处理浓度为50 mg/mL时,孢子萌发抑制率高达99.007%,菌丝体细胞膜通透性增强,菌丝体可溶性蛋白及总糖含量分别只有1187.18μg/g及0.307%,菌丝形态呈现畸形甚至断裂,因而桂枝提取物对柑橘绿霉病菌有明显的抑菌活性,其抑菌作用主要是通过破坏细胞膜结构,扰乱菌丝物质代谢活动来实现的。     

11种中草药提取物对柑橘意大利青霉抑菌活性及机理研究

对11种中草药醇提物抑制柑橘意大利青霉的抑菌效果进行筛选,选用抑菌效果最佳的桂枝提取物从其对病原菌的孢子萌发率、细胞膜渗透性、菌丝形态及菌体内含物含量的影响来进行抑菌机理的研究。结果表明:桂枝、桂皮和黄柏提取液的抑制圈直径均大于30 mm,具有较好的抑菌效果。其中桂枝的抑菌活性最佳,对意大利青霉的抑制圈直径为(34.57±0.78)mm,最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)分别为3.125和6.25 mg/mL,且抑菌效果显著优于化学杀菌剂百可得。在抑菌机理方面,桂枝提取物可以抑制意大利青霉菌孢子萌发,影响菌丝的生长发育,其抑菌作用主要是通过破坏细胞膜结构,增加菌体细胞膜通透性,使菌体内容物外渗从而影响菌丝正常生长代谢来实现的。桂枝提取物对柑橘青霉菌有较好的抑菌活性,可作为天然杀菌剂的来源。     

肉桂酸钾对柑橘采后主要病原真菌的抑制作用

探讨了肉桂酸钾对柑橘意大利青霉、指状青霉、胶孢炭疽菌生长的抑制作用。采用生长速率法测定肉桂酸钾对致病真菌菌丝生长、产孢及孢子萌发的抑制作用,并通过细胞膜通透性及细胞膜完整性试验阐述肉桂酸钾对3种致病真菌的作用方式。结果表明:肉桂酸钾对3种病原真菌表现出不同程度的生长抑制作用,由大至小依次为指状青霉、意大利青霉、胶孢炭疽菌,肉桂酸钾质量浓度为4 mg/m L时,3种病原真菌的菌丝生长抑制率分别为100%、53.88%、45.29%。肉桂酸钾作用于病原真菌,菌悬液的相对电导率升高,DNA和蛋白质等內溶物释放,表明细胞膜通透性及完整性发生改变。肉桂酸钾对柑橘采后主要病原真菌具有较强的抑制作用,甚至是杀伤作用,适于作为柑橘保鲜剂。     

响应面法优化肉桂抑菌物质超声波提取工艺及其抑菌活性研究

许多天然药用植物对果蔬采后病原真菌具有很好的抑菌效果,意大利青霉和指状青霉是引起柑橘采后青霉病和绿霉病的病原菌。前期针对这2种病原菌筛选抑菌药用植物,发现肉桂具有明显的抑菌效果。实验以意大利青霉和指状青霉为供试菌,采用超声波法提取肉桂中抑菌物质,通过单因素实验和响应面分析法研究了超声提取时间、提取温度和料液比对肉桂抑菌活性的影响。采用牛津杯法测定抑菌活性,并进一步测定其对病原菌孢子萌发抑制率和病原菌菌丝形态的影响。结果表明:肉桂抑菌物质最佳提取条件为:乙醇浓度90%、提取温度30℃、提取时间0.5 h、料液比为1:26。在此提取条件下的肉桂提取物对意大利青霉和指状青霉的综合抑菌效果最好,其抑菌圈直径分别为20.64、23.96 mm。肉桂提取物可以抑制2种青霉菌的孢子萌发,影响菌丝的生长发育,并且其对2种病原菌孢子萌发抑制率及抑菌效果随肉桂提取物浓度的升高而升高。     

植物精油对柑橘的保鲜效果

为开发研制新型植物源柑橘保鲜剂,测定了13种植物精油对柑橘主要致腐菌意大利青霉和指状青霉的抑菌作用,确定最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）,并进行了菌丝生长的抑制试验和柑橘损伤接种试验。结果显示,13种植物精油中抑菌效果最佳的是丁香、牛至以及桂皮,对意大利青霉的抑菌圈分别为35.81、39.32、43.11 mm,指状青霉的抑菌圈分别为21.5、27.89、39.03 mm。这3种植物精油对意大利青霉菌的MIC分别为0.05%、0.05%、0.012 5%,MBC分别为0.1%、0.05%、0.012 5%,对指状青霉菌的MIC分别为0.1%、0.1%、0.012 5%,MBC分别是0.2%、0.1%、0.012 5%。0.1%的丁香、牛至和桂皮对菌丝生长的抑制率为100%。在损伤接种试验中发现指状青霉的致病力大于意大利青霉菌,对照在第4天贮藏中腐烂面积为10.19 cm²,约为意大利青霉的8倍。0.1%牛至、丁香...     

抗真菌剂三峡肽素抑制指状青霉的转录组学研究

为了分析三峡肽素（Sanxiapeptin）对柑橘类水果的主要采后致腐菌指状青霉（Penicillium digitatum）的抑制机理,本研究首先利用显微技术观察了指状青霉随三峡肽素的形态变化,并分析了细胞壁的保护剂山梨醇与细胞膜的保护剂麦角固醇在三峡肽素在抑制真菌过程中的作用,然后通过BGISEQ-500研究平台,对三峡肽素处理后的指状青霉进行了转录组测序,对测序产生的6.38 Gb序列数据进行了无参转录组分析。结果表明,经三峡肽素处理后,指状青霉的细胞表面形态发生了明显变化。与正对照膜靶点杀菌剂百可得不一样,细胞膜的保护剂麦角固醇可以明显缓解三峡肽素的抑制效果,而细胞壁保护剂山梨醇却会促进其抑菌能力。转录组序列相互比对率为93.66%,显示出较高的测序质量。指状青霉经三峡肽素处理后,超过2000个基因发生了表达变化,主要涉及细胞膜、细胞壁组分、自噬和糖代谢等途径。鉴于三峡肽素与百可得的作用途径不同,本研究选取了仅由三峡肽素引起的530个差异表达基因进行分析,发现这些基因主要与疏水蛋白、麦角固醇合成、聚糖合成及GPI（糖基磷脂酰肌醇,Glycosylphosphatidylinositol）的代谢相关,在17个候选基因中,有8个基因的RT-PCR半定量表达检测与转录组测序结果完全一致。上述结果说明三峡肽素可能通过影响细胞壁或细胞膜等细胞表面的功能,从而起到抑制柑橘采后致腐真菌的作用。     

壳聚糖和壳寡糖对四种青霉病菌生长和病害控制的比较研究

在离体和活体条件下,开展了壳聚糖与壳寡糖对四种同属不同种青霉菌菌丝与孢子抑制作用及病害防治的研究。结果表明:离体条件下,随着壳聚糖与壳寡糖浓度的升高,对四种青霉菌菌丝与孢子的抑制效果逐渐增强,总体上壳聚糖的抑菌效果要好于壳寡糖。其中,产黄青霉菌(Penicillium chrysogenus Thorm)对壳聚(寡)糖的敏感性在四种青霉菌中最强,指状青霉菌(P.digitatum)敏感性最弱。在柑橘果实实验中,壳聚糖或壳寡糖对柑橘指状青霉病害控制效应最弱,对产黄青霉病害控制效应最强。在四种青霉中,壳聚(寡)糖对产黄青霉的抑制作用和病害控制最为明显,且壳聚糖效果好于壳寡糖。     

抗菌肽Jelleine-I对采后柑橘果实绿霉病的控制作用

研究抗菌肽Jelleine-I对指状青霉（Penicillium digitatum）生长的影响及可能的作用机理,并采用损伤接种的方法评价Jelleine-I对柑橘果实采后绿霉病的控制效果。结果表明,Jelleine-I能明显抑制P. digitatum的生长,其最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为6.25 mmol/L和12.5 mmol/L;同时,其能有效控制柑橘果实采后绿霉病的发生。经Jelleine-I处理后的P. digitatum菌丝体细胞膜通透性增加,细胞间隔膜损坏,细胞内绿色SYTOX Green荧光强度增加,细胞间蓝色Calcofluor White荧光减少。此外,经Jelleine-I处理后的P. digitatum菌丝体胞外电导率以及胞内核酸物质泄漏量均显著增加（P＜0.05）。综上,Jelleine-I通过破坏P. digitatum细胞膜结构完整性,引起胞内物质泄漏,加速P. digitatum死亡,从而有效控制柑橘果实采后绿霉病的发生。     

盐酸小檗碱抑制指状青霉的作用机制

本实验主要对盐酸小檗碱(berberine hydrochloride,BH)抑制指状青霉(Penicillium digitatum)生长的活性以及可能的作用机制进行探讨.结果表明,BH抑制指状青霉生长的最低抑菌质量浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌质量浓度(m...     

膜醭毕赤酵母结合杀菌剂对柑橘果实采后病害的控制效果

探究膜醭毕赤酵母与低剂量杀菌剂（多菌灵、甲基硫菌灵）结合使用对柑橘采后病害的防治效果。通过筛选能与膜醭毕赤酵母结合使用的杀菌剂,考察柑橘常见病原菌对杀菌剂的敏感性,继而在果实上验证结合处理对柑橘采后病害的防治效果。离体实验的结果表明,多菌灵和甲基硫菌灵对酵母生长无抑制作用;柑橘青霉菌、绿霉菌和炭疽菌对两种杀菌剂敏感性不同,但半数抑制浓度（EC50值）均小于建议剂量的1%。果实活体实验的研究结果表明,膜醭毕赤酵母结合低剂量的多菌灵或甲基硫菌灵对柑橘果实青霉病、绿霉病的防治效果均好于膜醭毕赤酵母和低剂量杀菌剂单独处理;但膜醭毕赤酵母结合低剂量的甲基硫菌灵对夏橙果实接种炭疽病的防治效果不佳。同时,膜醭毕赤酵母结合低剂量的多菌灵或甲基硫菌灵对夏橙果实自然发病率的控制呈增效作用,对锦橙果实自然发病率的控制呈叠加作用,两种结合处理均能保证夏橙和锦橙的好果率。     

α-松油醇对指状青霉抑霉唑抗性菌株Pdw03的抑制作用

本研究探讨了α-松油醇对指状青霉抑霉唑抗性菌株Pdw03的抑制作用及其抑菌机理。体外实验结果表明α-松油醇抑制Pdw03生长的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）和最小杀菌浓度（minimal fungicidal concentration,MFC）均为4.00 μL/mL;体内实验研究发现MFC和5 MFC α-松油醇可明显降低接种Pdw03椪柑果实的绿霉病发病率和发病直径;碘化丙啶（propidium iodide,PI）染色实验发现,经1/2 MIC α-松油醇处理后,Pdw03的细胞膜完整性降低,麦角固醇含量显著降低（P＜0.05）,麦角固醇合成相关基因ERG9表达量显著下调（P＜0.05）。综上,α-松油醇通过抑制ERG9基因的表达影响菌株Pdw03的生长,可作为采后柑橘病害防治的有效替代品。     

Mutations of β-tubulin codon 198 or 200 indicate thiabendazole resistance among isolates of Penicillium digitatum collected from citrus in Taiwan

Penicillium digitatum causes green mold on citrus, resulting in severe postharvest fruit decay and economic losses in many citrus-producing areas of the world. Forty isolates of P. digitatum were cultured from citrus groves, packinghouses, and local markets in Taiwan, and assessed quantitatively for their sensitivity to thiabendazole (TBZ) fungicide. Sensitivity assays using a 96-well microtiter plate revealed that, of 40 isolates examined, only one isolate collected from fruit produced in Taiwan and two isolates from Florida-imported citrus fruit were sensitive to TBZ. The concentration of TBZ causing a 50% growth reduction (EC(50)) was less than 1 μg/mL. The remaining 37 isolates could tolerate high concentrations of TBZ, with an EC(50) greater than 80 μg/mL. Overall, more than 97% of P. digitatum isolates tested in Taiwan were found to be resistant to TBZ. In vitro assays also revealed the ineffectiveness of TBZ for controlling a TBZ-resistant isolate on sweet oranges. A sequence analysis of β-tubulin genes revealed that all TBZ-resistant isolates displayed a single transversion point mutation, resulting in a change at either amino acid 198 (glutamic acid→glutamine) or 200 (phenylalanine→tyrosine). The repetitive use of a single fungicide over several decades has favored the selection and dominance of TBZ-resistant isolates of P. digitatum.     

脱氢乙酸钠抑制指状青霉的作用机制

脱氢乙酸钠（sodium dehydroacetate,SD）可有效抑制指状青霉（Penicillium digitatum）的生长,但其作用机制尚不清楚。本实验通过分析不同质量浓度SD（0（对照）、1/2最小抑菌质量浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）、MIC）对P. digitatum菌丝体细胞结构和功能（细胞壁、细胞膜和线粒体）的影响,研究SD的抑菌机制。结果表明,SD处理菌丝体30 min时已通过主动运输进入细胞内,且在整个处理期间能维持胞内较高的SD质量浓度;SD处理的菌丝体细胞壁荧光强度和胞外碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）活力与对照无明显差异;而碘化丙啶染色实验结果表明,SD引起菌丝体荧光强度显著增加（P＜0.05）;此外,SD处理能够降低菌丝体总脂质含量,并提升胞外pH值,表明SD处理对菌丝体细胞膜造成损伤而未对细胞壁造成损伤。此外,SD处理降低了菌丝体线粒体膜电位和能荷水平,增加了Na＋/K＋-ATPase活力,干扰了细胞能量代谢。SD对金柑果实绿霉病干预实验结果表明,SD处理有效抑制了金柑果实绿霉病的发生,且呈质量浓度依赖效应。综上,SD可通过破坏P. digitatum菌丝体细胞膜和线粒体的结构和功能发挥其抑菌活性,从而降低金柑采后绿霉病的发生。研究结果可为SD应用于金柑采后病害绿色防控提供理论依据。     

Comparison of the activity of antifungal hexapeptides and the fungicides thiabendazole and imazalil against postharvest fungal pathogens

In this study, we evaluated the activity of short antimicrobial peptides against different fungal isolates that cause postharvest decay of fresh fruits. The previously identified hexapeptides PAF19, PAF26 and LfcinB4-9 inhibited the in vitro growth of isolates from Penicillium digitatum and P. italicum, and from Alternaria and Geotrichum genera, being no active against Rhizopus, Mucor and Aspergillus. The results extend our previous observations on the specific and distinct activity profiles of this class of antifungal peptides. In addition, peptide activities were compared with that of two fungicides used for citrus fruit preservation, thiabendazole (TBZ) and imazalil (IMZ). We observed a lack of correlation between peptide and fungicide sensitivity among different species. Importantly, P. digitatum and P. italicum isolates resistant to fungicides were susceptible to peptides and our data suggest that common multiple drug resistance mechanisms are not active against this class of peptides. The in vitro peptide inhibition was correlated with a retard of the decay caused by Penicillium on citrus fruits, and this effect was comparable for both fungicide-resistant and -sensitive isolates. Comparison of PAF26 and TBZ in vitro minimum inhibitory concentration (MIC) values and their in vivo effect on citrus decay indicated that PAF26 performed in vivo better than TBZ.