植物乳杆菌内源性质粒序列分析及其表达载体的构建

目的：构建乳酸杆菌的表达载体,对菌株携带的质粒进行序列测定和功能分析,并利用自身带有的质粒系统构建乳酸杆菌的表达系统,对乳酸菌口服疫苗的制备起到积极的促进作用。方法：从植物乳杆菌LP3中提取质粒并进行序列测定和功能分析。通过质粒pLP3复制子,与pCPSP载体的氯霉素基因CmR、pUC19的复制子构建大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒。在穿梭质粒的基础上加上嗜酸乳杆菌的S层蛋白启动子PslpA和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,eGFP）基因,进一步构建乳酸菌表达载体D-pLP3-PslpA-eGFP。结果：从植物乳杆菌LP3中得到一个天然隐蔽性质粒pLP3,该质粒大小为2 017 bp,GC含量为37.48%。基于质粒pLP3,构建了大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒D-pLP3,并成功转化至不同类型乳酸菌,转化效率介于0.3×102～1.0×103 CFU/μg（DNA质量计）之间。乳酸菌表达载体D-pLP3-PslpA-eGFP转化至植物乳杆菌,成功获得了荧光蛋白的表达。结论：成功构建了乳酸菌表达载体D-pLP3-PslpA,为乳酸菌基因操作提供了新的工具。     

乳酸乳球菌内源隐蔽性质粒序列分析及食品级克隆载体的构建

为构建乳酸菌食品级载体,对乳酸乳球菌内源隐蔽性质粒p KL001进行全序列测定、序列分析及PCR扩增,获得了该质粒的复制子。以Southern杂交对质粒p KL001复制模式进行分析,结果显示p KL001为θ型复制。将该复制子与镉抗性功能片段连接,构建了食品级克隆载体p KF168,其在受体菌株KLDS4.0319-5中可稳定存在。     

产酪胺粪肠球菌和屎肠球菌PCR检测方法的建立

目的：建立快速简便地检测产酪胺粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)的PCR方法。方法：将粪肠球菌和屎肠球菌的酪氨酸脱羧酶基因与GenBank数据库中已公布的细菌的酪氨酸脱羧酶基因进行比对,根据它们的非保守序列,分别设计粪肠球菌和屎肠球菌的特异性引物,建立检测产酪胺粪肠球菌和屎肠球菌的PCR方法。结果：根据非保守序列,分别设计粪肠球菌和屎肠球菌的特异性引物,用27株细菌对这两对引物分别进行反复验证,结果显示,所设计的两对引物都只对其目的菌株产生特异性扩增,对其他菌株没有扩增,方法的检测限可达到1.0×102CFU/mL。结论：本方法具有良好的特异性、稳定性和灵敏性,可用作食品中产酪胺粪肠球菌和屎肠球菌的检测。     

自然发酵乳中粪肠球菌和屎肠球菌的4种鉴定方法的比较

采用传统生理生化鉴定方法,16S rRNA基因序列分析技术,16S-23S rRNA间区序列多态性分析技术,变性梯度凝胶电泳技术(DGGE),对分离于自然发酵乳中的9株粪肠球菌和6株屎肠球菌进行鉴定,并对4种鉴定方法进行比较和评价。结果表明,16S-23S rRNA间区序列多态性分析技术和DGGE技术不但可以快速、精确地区分粪肠球菌和屎肠球菌,而且能够将粪肠球菌和屎肠球菌种内的不同基因亚型区分开,而传统生理生化鉴定方法和16S rRNA基因序列分析技术较以上两种方法区分效果略差。     

两株粪肠球菌的安全性评价

乳酸菌KLDS6.0610和KLDS6.0611是两株分离于传统乳制品的粪肠球菌,这两株菌均会产生高效抗李斯特菌的细菌素,而且产生的细菌素具有良好的加工稳定性。本实验主要是评价这两株菌的安全性,为其实际应用提供可靠的理论依据。通过对两株菌的耐药性、有害代谢产物、机体指标、急性毒理实验以及溶血性和易位实验得到:急性毒理实验中,动物的体重变化正常而且主要脏器无异常;两株菌对大部分常见的抗生素都没有耐药性,只是对庆大霉素具有抗性,不含有可转移的质粒;而且菌株的生长代谢过程中不会产生硝基还原酶、胆盐羧化酶和氨基脱羧酶;谷胱甘肽和丙二醛含量基本正常,不会产生溶血和易位现象。通过对两株菌的安全性评价可知乳酸菌KLDS6.0610和KLDS6.0611是安全的。     

两株粪肠球菌的安全性评价

乳酸菌KLDS6.0610和KLDS6.0611是两株分离于传统乳制品的粪肠球菌,这两株菌均会产生高效抗李斯特菌的细菌素,而且产生的细菌素具有良好的加工稳定性。本实验主要是评价这两株菌的安全性,为其实际应用提供可靠的理论依据。通过对两株菌的耐药性、有害代谢产物、机体指标、急性毒理实验以及溶血性和易位实验得到:急性毒理实验中,动物的体重变化正常而且主要脏器无异常;两株菌对大部分常见的抗生素都没有耐药性,只是对庆大霉素具有抗性,不含有可转移的质粒;而且菌株的生长代谢过程中不会产生硝基还原酶、胆盐羧化酶和氨基脱羧酶;谷胱甘肽和丙二醛含量基本正常,不会产生溶血和易位现象。通过对两株菌的安全性评价可知乳酸菌KLDS6.0610和KLDS6.0611是安全的。      

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)产生物胺交互作用研究

粪肠球菌和屎肠球菌是发酵香肠中常检出的2种主要的产酪胺和苯乙胺微生物。将粪肠球菌和屎肠球菌按照不同比例进行混合接种培养,发现在48h连续培养过程中,当粪肠球菌和屎肠球菌以1∶9比例混和接种培养时,体系pH值、细菌数量和酪胺生成量均显著低于其他各处理组;粪肠球菌有很强的产苯乙胺能力而屎肠球菌产苯乙胺能力较弱,当两者混合接种培养时,各混合体系的产苯乙胺水平相当,屎肠球菌产苯乙胺能力不受影响,而粪肠球菌产苯乙胺能力显著降低。     

食品来源粪肠球菌的全基因组分析

目的 了解食品来源粪肠球菌的全基因组分子特征, 并与临床分离菌株进行比较基因组学分析。 方法 对收集的食品来源粪肠球菌进行全基因组测序和生物信息学分析, 比较分析3株食品来源粪肠球菌和7株已发表的临床分离粪肠球菌基因组, 对比粪肠球菌基因组中携带的耐药基因、毒力基因和移动元件, 筛选核心基因, 构建系统进化树。结果 3株食品来源粪肠球菌染色体全基因组序列全长分别为2816436、3005875和2818728 bp, 共含有2733、2853和2756个基因, 基因平均鸟嘌呤和胞嘧啶(guanine and cytosine, GC)含量为38.0%。在全基因组核酸水平上, 食品与临床分离的粪肠球菌线性关系良好, 基因组结构高度相似。3株食品来源菌株基因组中含有3~7种耐药基因、8~19种毒力基因和42~67个移动元件, 与临床分离菌株比较, 无显著性差异(P>0.05)。系统进化树分析发现食品来源和临床分离粪肠球菌分布在一个进化分枝, 分子遗传关系距离较近。结论 本研究获得了食品来源粪肠球菌全基因组基本特征的背景材料, 证实了食品来源和临床分离粪肠球菌进化溯源关系相近, 基因组无显著差异(P>0.05), 为后续食品工业界实际应用粪肠球菌的安全性评价奠定了基础。     

酸马奶酒中粪肠球菌抑菌特性的研究

研究了分离自内蒙古锡林郭勒盟地区不同酸马奶酒样中的粪肠球菌的抑菌特性,并探讨了菌株H1-1-2抑菌活性物产生影响因素以及抑菌物质的粗提。研究结果表明,分离到的12株粪肠球菌中有6株对单核细胞增生利斯特斯菌有不同程度的抑制作用,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无抑制作用;菌株H1-1-2在指数生长期开始后,抑菌活性迅速增加;控制pH值的降低,有助于提高抑菌物质的产生;抑菌物质的活性耐受pH值范围较宽,粗提后的抑菌物质是一类分子量较大的蛋白类物质。     

大蒜精油对屎肠球菌和粪肠球菌产苯乙胺和酪胺的影响

本试验采用双倍试管稀释法,测定大蒜精油分别对高产苯乙胺和酪胺的E.faecium和E.faecalis的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC);并利用高效液相色谱法测定不同浓度的大蒜精油对两株高产苯乙胺和酪胺菌株的影响,从而明确大蒜精油对其产生物胺能力的抑制作用。结果表明:大蒜精油对供试菌株都具有较强的抑菌活性,大蒜精油对E.faecium的最大抑制率可达48.20%,对E.faecalis的最大抑制率为52.41%,且抑菌效果随大蒜精油浓度的增大而逐渐增强;在大蒜精油的添加量为1/2 MIC时,大蒜精油对E.faecium和E.faecalis的生长具有抑制作用;当大蒜精油浓度为0.025%时,能够显著(p0.05)降低供试菌株产苯乙胺和酪胺的含量,苯乙胺含量与空白组相比降低了26.61%,酪胺的降低了15.54%。说明大蒜精油对高产酪胺和苯乙胺的菌株具有显著(p0.05)抑制效果,从而减少了酪胺和苯乙胺的生成。