甲醇-乙醇分步沉淀法提取γ-聚谷氨酸

采用非单一有机溶剂即甲醇-乙醇分步沉淀法从发酵液中提取聚谷氨酸(γ-PGA),通过响应面法对聚谷氨酸(γ-PGA)提取条件进行优化。在初步考察单因素影响的基础上,以BBD(Box-Behnken design)法设计考察有机溶剂沉淀倍数、沉淀pH、沉淀时间3个因素对γ-PGA提取纯度的交互影响,用Design-Expert v8.0.6.1软件对BBD实验数据进行分析处理。试验得到的最佳提取条件为:有机溶剂沉淀倍数为3.48、沉淀pH为8.13、沉淀7.30 h,γ-PGA提取纯度为75.16%,提取率83.77%,预测精准度达99.02%。     

γ-聚谷氨酸发酵工艺研究

采用发酵技术,利用枯草芽孢杆菌发酵生产γ-聚谷氨酸,对γ-聚谷氨酸发酵工艺进行研究。主要研究碳源、氮源、装液量、接种量、发酵时间、p H以及前体谷氨酸钠和促进剂氯化铵对γ-聚谷氨酸发酵的影响。前期研究表明,γ-聚谷氨酸发酵液黏度与其产量线性相关,故本研究中采用发酵液黏度作为γ-聚谷氨酸产量的衡量指标。通过单因素试验和正交试验,对发酵培养基和发酵条件进行优化,最后得到最佳发酵培养基配方和发酵条件。通过单因素及正交试验,确定最佳发酵培养基配方为:葡萄糖4%,酵母膏0.5%,谷氨酸钠3%,Mg SO4·7H2O 0.025%,K2HPO40.2%,氯化铵0.3%;最佳发酵条件为:初始p H 9.5,装液量50m L,接种量6%,摇床转速为220 r/min,37℃振荡培养72 h。     

碳源对γ-聚谷氨酸发酵的影响

以γ-聚谷氨酸生产菌yt102为供试菌株,研究了碳源对γ-聚谷氨酸发酵的影响.首先通过摇瓶实验确定发酵的最佳碳源为葡萄糖和柠檬酸,二者按一定的比例混合更有利于聚谷氨酸的产生,进一步利用10L发酵罐补料分批发酵确定碳源的最佳用量为40g/L,继续优化培养条件,确定采用溶氧控制的脉冲补料方式可有效延续γ-聚谷氨酸的合成.在最优发酵条件下,通过10L发酵罐补料分批发酵50h,r-聚谷氨酸产量可达34.5g/L.     

产γ-PGA菌种选育及固态培养条件的优化

从纳豆中分离筛选一株产γ-PGA菌株SK-1,以大豆为培养基固态发酵生产γ-聚谷氨酸,紫外、红外光谱扫描所提产物,结果与对照标准品图谱基本一致。通过正交试验对固体培养条件进行优化,得到γ-PGA固态发酵最佳条件:温度35℃,时间24h,装填量50g/250mL,接种量5%.产物提取条件试验表明:添加不同比例乙醇对γ-PGA产量基本无影响,提取时无需调节浸提液pH。     

γ-聚谷氨酸高产菌株Bacillus natto S003-D16的选育和优化

以产γ-聚谷氨酸的纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto S003)为出发菌,经紫外(UV)-硫酸二乙酯(DES)复合诱变,分离筛选得到1株高产稳定突变株Bacillus natto S003-D16,经摇瓶实验验证γ-聚谷氨酸的含量达到20.58g/L,较出发菌株提高40.38%.通过正交试验优化的培养基组成为:味精废液120mL/L、豆粕50g/L、葡萄糖30g/L、FeCl3 0.4g/L、MgSO4 0.6g/L、MnSO4 0.01g/L、K2HPO4 0.2g/L,pH7.0;利用优化的培养基在500mL三角烧瓶装液量100mL,37℃、230r/min条件下培养72h,发酵液中的γ-PGA产量可达到31g/L.纯化后产物经红外光谱鉴定其结果与标准品的图谱基本一致.     

纳豆芽孢杆菌液体发酵生产γ-聚谷氨酸

本研究采用单因素实验和正交实验优化了纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)液体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵培养基和发酵条件.结果表明,在25 g/L葡萄糖为碳源,15 g/L蛋白胨为氮源,谷氨酸钠添加量20 eel的基础上,纳豆杆菌在pH为7.5,接种量为2%,摇床转速为150r/min,装液量为50mL/250mL三角瓶的条件下液体发酵48h,发酵液的γ-PGA产量达到11.97g/L.产物水解后,经液相色谱检验,初步确定产物为γ-聚谷氨酸.利用SDS-PAGE电泳对发酵产物的分子量进行了测定,结果表明其并非是单一分子量的γ-PGA,而是多种不同分子量的混合体.     

产γ-PGA批式发酵动力学模型的建立

以一株γ-PGA(γ-聚谷氨酸)高产菌枯草芽孢杆菌HCUL-B115为实验菌株,在5L发酵罐中进行分批发酵,并测定发酵过程中的生物量、残糖量、前体物残量和γ-聚谷氨酸产量.应用MATLAB软件进行最优参数估计和非线性拟合,得到了菌体生长、产物生成和底物消耗的动力学模型和模型参数.结果表明,所建立的批式发酵动力学模型能较好地反映γ-PGA批式发酵规律.     

全水化无醇提取γ-聚谷氨酸工艺的研究

为实现γ-聚谷氨酸无醇提取,利用板框除菌,酶解除大分子多糖,活性炭脱色,超滤除小分子杂质,最后冷冻干燥获得γ-聚谷氨酸(γ-PGA)成品。确定了全水化无醇提取条件:下罐调p H6.0,发酵液稀释2倍;硅藻土和红土配比为2∶1(m∶m),总添加量为1.5%(w/v),除菌率97%以上;脱色条件:活性炭添加量1.5%(w/v)、温度30℃、p H5、时间60min。超滤选择10ku的膜包除杂并最终浓缩至原液的1/9。冷冻干燥18h得到的γ-聚谷氨酸纯度达90%。无醇提取工艺的探索为工业生产提取γ-PGA提供了重要参考依据。     

γ-聚谷氨酸的发酵条件优化及其初步表征分析

为提高微生物发酵生产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的产量,采用枯草芽孢杆菌发酵制备γ-聚谷氨酸,并通过单因子试验及正交试验分析,得到枯草芽孢杆菌发酵生产γ-聚谷氨酸的最佳营养条件为:40g/L葡萄糖、5g/L酵母膏、30g/L谷氨酸钠、3g/L NH4Cl、2g/L K2HPO4、0.25g/L MgSO4:最佳培养条件为:接种量2%,装液量40mL(250ml三角瓶),培养温度37℃,摇床转速200r/min,pH值7.0,发酵时间48h,此时γ-聚谷氨酸的产量最高,达到20.15g/L.纯化后产物经纸层析及红外光谱检测,初步确定为γ-聚谷氨酸.     

响应面法优化γ-聚谷氨酸发酵条件

以一株从纳豆中分离得到的纳豆芽孢杆菌进行γ-聚谷氨酸发酵,利用响应面法对发酵的条件进行优化。实验结果表明:接种量、pH值和温度是影响发酵的主要因素。最终达到该株纳豆芽孢杆菌发酵γ-聚谷氨酸的最佳发酵条件:温度40.00℃,接种量7.1%,pH值7.76。此条件下γ-PGA为19.612g/L。     

发酵生产γ-聚谷氨酸的补料策略

采用补料分批发酵方法对Bacillus subtilis GXA-28摇瓶发酵生产γ-聚谷氨酸的初始葡萄糖和谷氨酸钠浓度、补料时间、补料配方等进行了研究。确定最优补料时间为17 h,补料配方:葡萄糖20 g/L,谷氨酸5 g/L,KH2PO40.5 g/L、MgSO40.1 g/L。在优化的补料条件下,γ-聚谷氨酸产量由16.24 g/L提高至24.36 g/L,较分批发酵提高了50%;生产强度由0.74g/(L·h)提高至0.87 g/(L·h)。研究结果表明,采用分批补料发酵方法能提高γ-聚谷氨酸生产率,实验方法可给γ-聚谷氨酸中试研究提供参考。     

pH值对聚谷氨酸发酵液粘度及聚合物结构的影响

生产中聚谷氨酸的发酵液非常黏稠(粘度达1.71Pa.s),这使除菌体提取聚谷氨酸非常困难。通过加酸或碱调节发酵液pH<5或pH>8可明显降低发酵液的粘度(其中pH3.5时粘度仅为pH6.5时的1/50左右)。将pH3.5的发酵液离心除菌(10 000×g,10 min)后超滤浓缩(滤膜孔径0.45μm,平均压力0.08 Mpa)1倍,再加入95%乙醇提取-γPGA,与pH中性时相比,可减少50%以上的能量消耗及40%的溶剂,但聚谷氨酸损失约10%。加酸或加碱处理可使发酵液中-γPGA的分子结构发生改变,分子质量降低,这对生产高分子质量的聚谷氨酸不利,但对生产低分子质量产物是适宜的。     

微生物发酵合成γ-聚谷氨酸的初步表征分析

以一株γ-聚谷氨酸高产菌——枯草芽孢杆菌B-115为实验菌株,通过单因素试验对其发酵条件进行优化,结果显示:最佳发酵条件为初始pH6.5、接种量2%、装液量50 mL/250 mL、转速150 r/min、37℃培养84 h;γ-聚谷氨酸的产率从57.85 g/L提高为68.3 g/L。且通过薄层层析、红外检测等方式对其发酵产物进行初步表征分析。     

细菌纤维素/γ-聚谷氨酸复合膜发酵条件的优化

在发酵培养基中添加γ-聚谷氨酸(γ-PGA),可以制备具有更优性能的细菌纤维素(BC)复合膜.采用响应面分析法优化细菌纤维素/γ-聚谷氨酸复合膜发酵生产工艺,首先通过Plackctt-Burman试验设计对影响复合膜发酵生产的8个因素进行筛选,得到3个关键影响因子:聚谷氨酸添加浓度,pH和γ-聚谷氨酸的添加时间;然后用最陡爬坡试验逼近响应值的最大区域;最后通过Box-Behnken设计及响应曲面分析确定了各考察因子的最佳取值:葡萄糖25g/L,柠檬酸6g/L,Na2HPO42g/L,γ-聚谷氨酸1.04g/L,γ-聚谷氨酸的添加时间4h,发酵初始pH5.0,温度30℃,发酵周期7d.在优化条件下复合膜的湿重达到61.07g/100mL培养基试验值与预测值误差为-3.05%,较初始培养基复合膜产量提高9 1.32%.     

γ-聚谷氨酸产生菌发酵培养基的响应面法优化研究

利用从纳豆中筛选得到的一株纳豆芽孢杆菌发酵生产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)。在单因素优化实验的基础上,通过响应面法对发酵培养基进行优化,得到最佳培养基配方为蔗糖43.92 g/L、大豆蛋白胨7.00 g/L、谷氨酸钠46.32 g/L,γ-PGA产量由原来的7.253 g/L提高到11.794 g/L。     

谷氨酸分析仪测定发酵液中γ-聚谷氨酸的实验条件研究

研究了pH值和培养基主要组分对谷氨酸分析仪测定谷氨酸含量的影响,确定了γ-聚谷氨酸水解的最佳条件.结果表明,在pH=5～10内,溶液的pH值对谷氨酸分析仪的测定结果没有显著影响;模拟发酵液体系的试验,发酵液中各主要成分含量的变动范围±25%时,对测定结果也没有明显影响.采用正交试验优化了γ-聚谷氨酸的水解条件.以2 mL发酵液为例,其最佳水解条件为4 mL浓度为6 mol/L浓盐酸,真空度为0.1 MPa,110℃,24 h.     

电渗析法从谷氨酸发酵液中提取谷氨酸铵的研究

探讨了利用电渗析法从谷氨酸发酵液中直接分离提取谷氨酸铵。通过模拟谷氨酸发酵液对提取工艺进行了单因素优化实验,获得了如电流密度、料液与浓缩液体积比、循环流量等优化操作条件。采用优化条件对真实谷氨酸发酵液进行电渗析分离提取谷氨酸铵,当料室pH4.7左右可观察到结晶现象。通过补加氨水调节料室pH,可明显改善电渗析的整体效果,其中浓室谷氨酸浓度达到120g/L,回收率为78.8%。     

产γ-氨基丁酸的菌株筛选及鉴定

为获得产γ-氨基丁酸安全菌株,本实验从泡菜汁及酸奶液中进行定向筛选,利用薄层层析法(TLC)对其发酵物进行了初步分析,随后对其进行了16S r DNA基因测序,最后利用高效液相色谱法(HPLC)进行产物定量分析评估其生产能力。结果表明得到六株产谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸的菌株,在Gen Bank中进行同源性比对后,鉴定六菌株均为植物乳酸短杆菌。定量分析六株菌发酵液中γ-氨基丁酸含量发现其产量均在200~500μg/m L之间,其中最高产量为493.3μg/m L。实验结果显示,硅胶薄层层析可以快速定性检测培养物中是否含有γ-氨基丁酸,而优化后的高效液相色谱法能准确定量检测培养物中的γ-氨基丁酸含量。筛选获得的乳酸杆菌生物安全性高,有一定应用推广前景。     

γ-聚谷氨酸生产菌种的ARTP诱变及其发酵条件优化

γ-聚谷氨酸是一种由生物所合成的氨基酸聚合物,具有极强的水溶性,生物相容性,能被广泛的运用到食品、医药、日化、环保、农业等行诸多领域,具有巨大的市场前景。本实验以实验室保藏的一株产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis QY-27为出发菌株,通过常压室温等离子体(ARTP)诱变,筛选获得一株遗传性能稳定的高产γ-聚谷氨酸突变菌株Bacillus licheniformis QS-21,该突变菌株γ-聚谷氨酸的产量较出发菌株的9.12g/L,提高了42.26%,达到15.89g/L。对筛选获得的变异株发酵条件优化结果显示,L-谷氨酸20g/L,甘油100g/L,Mg SO4·7H2O0.5g/L为变异株合适发酵培养基,在37℃,摇瓶转数230r/min,发酵培养72h,γ-聚谷氨酸的产量达22.56g/L,比优化前提高了29.56%。     

γ-聚谷氨酸合成菌株的筛选与优化培养

从土壤筛中筛选分离获得1株γ-聚谷氨酸合成菌Bacillus subtilis PGS-1,在富含谷氨酸和葡萄糖的培养基中可大量合成γ-聚谷氨酸,与大多文献报道的微生物合成的γ-聚谷氨酸相比,具有较低的分子量(300ku～400ku)和较窄的分子量分布,可适用于低分子量要求的医药、化妆品和水处理等应用领域,值得深入开发研究.为提高γ-聚谷氨酸的发酵产量,对Bacillus subtilis PGS-1的摇瓶培养基条件进行了响应面优化,确定了影响γ-PGA合成的显著因素依次为谷氨酸、葡萄糖和(NH4)2SO4;在优化条件下,γ-聚谷氨酸产量达26g/L,较优化前提高了44%.