大豆降胆固醇活性肽的初步分离纯化

研究了大豆降胆固醇活性肽的初步分离纯化,用Alcalase碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白得到的酶水解物经过大孔吸附树脂脱盐,并用不同浓度的乙醇以疏水性大小洗脱,得出浓度为75%的乙醇洗脱物具有最高的降胆固醇活性,将此洗脱物再经过SephadexG15凝胶过滤色谱进行分子量分级,得到了部分纯化的大豆降胆固醇肽,其最高降胆固醇活性肽是分子量大多在1000以下的小肽,抑制率为81.26%。     

亚麻籽降胆固醇活性肽的酶解工艺优化及分级制备

以亚麻籽分离蛋白为原料,利用酶解工艺制备降胆固醇活性肽。对蛋白酶进行了筛选,并通过单因素实验和正交实验确定最优酶解工艺,采用超滤分离技术得到具有较高降胆固醇活性的亚麻籽肽,并对超滤前后亚麻籽肽的氨基酸组成及降胆固醇活性进行了研究。结果表明:最佳酶解工艺条件为采用Protease M进行酶解、加酶量1. 5%、底物质量分数2. 0%、酶解温度50℃、酶解时间3 h,在此条件下亚麻籽肽的降胆固醇活性最强,胆固醇胶束溶解度抑制率达53. 19%;超滤后相对分子质量小于1 kDa的多肽组分降胆固醇活性最强,胆固醇胶束溶解度抑制率达72. 39%,较超滤前提高了19. 20个百分点。氨基酸分析结果表明,超滤后相对分子质量小于1 kDa的多肽组分的总疏水性氨基酸含量明显高于超滤前,提高了15. 97个百分点,而且多肽组分中赖氨酸/精氨酸的比值低于超滤前,这可能是其降胆固醇活性强于超滤前的主要原因。     

酪蛋白源降胆固醇肽的酶解制备工艺优化

以酪蛋白为原料,采用中性蛋白酶、碱性蛋白酶以及胰蛋白酶对酪蛋白进行水解,确定制备降胆固醇肽的最佳蛋白酶;通过单因素实验和响应面试验,研究水解pH、水解温度、酶与底物比、底物浓度和水解时间对酪蛋白水解度和胆固醇胶束溶解度抑制率的影响,确定最佳水解条件;而后通过超滤和凝胶过滤层析确定降胆固醇肽的初步分离工艺。结果表明:制备酪蛋白源降胆固醇肽的最佳水解工具酶是中性蛋白酶,其最佳酶解条件为反应温度51.3 ℃,酶与底物浓度比6.47%,pH6.34,底物浓度5 g/100 mL,反应时间3.5 h,胆固醇抑制率为58.25%±0.59%;Sephadex G-10分离酪蛋白降胆固醇肽条件为上样浓度80 mg/mL,上样体积2.5 mL,洗脱速度3.5 mL/min;经酶解、超滤及层析后制备的酪蛋白源降胆固醇肽峰1和峰2样品在100 μg/mL的胆固醇溶解度抑制率为24.2%±0.24%和4.3%±0.16%。经酶解制备分离后,获得具有抑制降固醇胶束溶解活性的降胆固醇肽,为降胆固醇肽的开发提供理论研究基础。     

鹰嘴豆降胆固醇肽的制备及活性

为了获得降胆固醇肽,本试验以鹰嘴豆为原料,将提取的分离蛋白通过碱性蛋白酶水解,选择加酶量、料液比、酶解时间3个因素,以水解度和胆固醇抑制率为考察指标,进行单因素试验,并在此基础上,以胆固醇抑制率为评价指标,采用Box-Behnken响应面分析法优化酶解鹰嘴豆蛋白,制备降胆固醇活性肽的条件;并将制备的鹰嘴豆肽对Wister大鼠进行试验。结果表明:鹰嘴豆蛋白最佳酶解工艺为:p H 8.0,加酶量2%,料液比2%,酶解温度50℃,酶解时间80 min,在此条件下鹰嘴豆多肽体外胆固醇抑制率可达到71.55%;动物试验显示灌胃100 mg/kg bw剂量的鹰嘴豆肽可使大鼠体内胆固醇含量降低22.39%。     

乳清蛋白肽对自然衰老小鼠抗氧化效果及脑内乙酰胆碱脂酶的影响

利用碱性蛋白酶水解制得的乳清蛋白肽(WPP),以青年小鼠、自然衰老的小鼠和灌胃脑复康的自然衰老的小鼠作对照,以灌胃低中高剂量乳清蛋白肽即100,200和400 mg/(kg·d)自然衰老的小鼠为实验组,通过体内抗氧化指标(SOD、MDA、GSH-Px、蛋白质羰基)和脑内乙酰胆碱脂酶来研究乳清蛋白肽对自然衰老的小鼠抗氧化效果及乙酰胆碱脂酶活力的影响,并探究WPP对老龄小鼠学习记忆的影响。灌胃乳清蛋白肽自然衰老小鼠的SOD和GSH-Px活性显著增加,MDA和蛋白质羰基浓度显著降低,同时乙酰胆碱脂酶的活性也有所降低,高剂量组与脑复康对照组结果相近;实验结果表明乳清蛋白肽能显著提高自然衰老小鼠抗氧化能力,并能调节脑组织乙酰胆碱酯酶的活性,提高衰老小鼠学习记忆认知功能。     

酶解乳清蛋白制备降胆固醇活性肽的工艺研究

利用生物酶技术酶解乳清蛋白,制备具有降胆固醇活性的多肽,通过响应面试验、二次旋转回归设计建立回归模型,以胆固醇胶束溶解度抑制率为评价指标,对乳清蛋白的酶解条件进行了优化。结果表明,乳清蛋白的最佳酶解条件为：酶解时间8.5 h、酶解温度55 ℃、酶解pH 8.0、加酶量4.7%、乳清蛋白含量5.8%,在此条件下,酶解乳清蛋白得到的活性肽的胆固醇胶束溶解度抑制率为18.21%。     

双酶水解乳清蛋白ACE抑制肽的制备工艺优化

以乳清蛋白为原料,采用胃蛋白酶和胰蛋白酶双酶先后水解乳清蛋白,通过单因素试验和正交试验优化胃蛋白酶和胰蛋白酶水解乳清蛋白制备血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽的工艺,将水解物以3 kDa超滤膜过滤,研究表明,胃蛋白酶水解乳清蛋白最佳酶解工艺条件为水解温度37℃、底物质量浓度6 g/100 mL、酶与底物比3 728 U/g,此时乳清蛋白ACE抑制率为86%;胰蛋白酶水解乳清蛋白最佳酶解条件为温度55℃、底物质量浓度6 g/100 mL、酶与底物比3 480 U/g,此时ACE抑制率为72%。利用超滤离心管获得分子量小于3 kDa的乳清蛋白ACE抑制率96%。     

嗜酸乳杆菌细胞壁蛋白酶的分离纯化及酶学性质的研究

为优化CEP的分离纯化方法,采用聚乙二醇(PEG)-20000浓缩粗酶液,用超滤离心管过滤酶液,40%~60%硫酸铵盐析分级沉淀,Sephacryl-S-300HR纯化,并通过Native-PAGE切胶回收得到纯酶。所得CEP的分子质量为28.3ku,比酶活力62.066U/mg,最适温度32℃,最适pH6.5,耐热性比较强,耐酸性明显好于耐碱性。Co2+、Mg2+、Ca2+对CEP有激活作用;Ba2+、Mn2+、K+、Na+对CEP的活力影响不大;Zn2+、Ni2+则表现出较强的抑制CEP活性作用;EDTA对CEP活性有抑制作用,表明CEP是一种金属离子激活酶;PMSF对CEP有显著抑制作用,表明CEP是一种丝氨酸蛋白酶。用嗜酸乳杆菌CEP水解乳清蛋白,其酶解液对ACE的抑制率为56.31%,表明CEP水解乳清蛋白可以产生ACE抑制肽。     

酶解蚕豆蛋白制备降胆固醇肽及其响应面优化

为了得到具有较高降胆固醇活性的蚕豆肽,对蚕豆蛋白的酶解条件进行了研究。通过比较6种蛋白酶对蚕豆蛋白的酶解程度以及降胆固醇能力,选择碱性蛋白酶进一步优化酶解条件。以水解度(DH)与降胆固醇能力为指标,利用单因素试验和响应面试验优化确定了酶解蚕豆蛋白制备降胆固醇肽的工艺参数。结果表明,最佳酶解参数为:酶解温度40℃,p H 9.0,酶解时间60 min,加酶量8 000 U/g,料液比1∶20。验证试验后得到的水解度为14.29%蚕豆多肽产品,其对胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠抑制率分别为52.98%、31.87%、25.17%,与理论模型预测值52.49%、31.44%、24.76%基本相符。     

双蛋白酶解法制备低抗原性乳清蛋白肽及其抗氧化性能研究

通过双蛋白酶分步水解法制备了一种低抗原性乳清蛋白肽,并对其抗氧化活性进行了实验研究.通过响应面法实验对乳清蛋白水解的工艺技术条件如双酶复配比例、底物浓度、酶解温度、时间、酶解pH值等进行了优化.结果表明:碱性蛋白酶与风味蛋白酶之比为1∶1,酶解温度54℃,pH值7.1条件下水解,此时乳清蛋白肽的抗原抑制率仅为10.02...     

核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的分离纯化及稳定性研究

采用5种商业蛋白酶水解核桃粕,评估水解物对二肽基肽酶4（DPP-Ⅳ）的抑制活性,优选出碱性蛋白酶作为水解用酶。研究确定了碱性蛋白酶水解核桃粕的最佳水解时间为5 h,然后通过超滤和SP Sephadex C-25阳离子交换树脂柱层析分离纯化碱性蛋白酶水解物得到核桃蛋白DPP-IV抑制肽,并对所得DPP-IV抑制肽的热稳定性、pH稳定性和模拟胃肠道消化稳定性进行了测试。结果表明,核桃蛋白DPP-IV抑制肽（025 mg/mL）DPP-Ⅳ抑制率（76.19%）比未分离纯化的水解物的提高了约3倍,其富含碱性氨基酸（含量34.36%）,尤其是精氨酸含量高达25.93%。核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽在高温（121 ℃）、极端pH（pH 1.0和pH 11.0）和模拟胃肠道消化条件下,均显示出良好的稳定性,因此可用作控制血糖的功能性食品成分。     

瑞士乳杆菌蛋白酶水解乳清蛋白制备A C E 抑制肽的条件优化

目的：本实验以WPC-80 乳清浓缩蛋白为原料,对瑞士乳杆菌蛋白酶水解乳清蛋白产生血管紧张素转移酶(ACE)抑制肽工艺条件进行研究。方法：通过单因素条件和响应面方法研究水解pH 值、水解温度、酶与底物比、底物浓度和水解时间对水解度和ACE 抑制率的影响。结果：研究发现,五个工艺条件对ACE 抑制肽的产生都有影响,通过响应面法分析,确定瑞士乳杆菌蛋白酶酶解乳清蛋白的最佳水解条件为：[E]/[S] 0.6%、底物浓度6%、pH9.18、温度38.90℃,时间8.0h,在此条件下水解,产物ACE 抑制率达到92.21% ,IC50 为0.375mg/ml,水解度为18.76%。结论：应用响应面方法优化水解工艺条件是可行的。     

西兰花茎叶蛋白酶解条件优化及其降血脂活性

为优化胰蛋白酶水解西兰花茎叶蛋白的酶解条件及研究西兰花茎叶蛋白肽辅助降血脂活性,选取pH、温度、加酶量和底物浓度为自变量,水解度为响应值,利用响应面分析法,确定最佳酶解工艺参数;通过小鼠喂养实验分析西兰花茎叶蛋白肽对小鼠甘油三酯(TC)、总胆固醇(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量以及动脉硬化指数(AI)的影响。结果表明,西兰花茎叶蛋白胰蛋白酶酶解的最优条件为:pH7.5,温度50℃,加酶量2000 U/g,底物浓度4%,水解度22.37%±0.46%;西兰花茎叶蛋白肽低剂量组(300 mg/kg)小鼠血清TC、ALT含量与模型组相比有极显著差异(P<0.01),TG、LDL-C含量与模型组有显著差异(P<0.05),对AST含量无明显降低作用;中(600 mg/kg)、高(1200 mg/kg)剂量组样品在降低TC、TG、LDL-C、ALT和AST含量上与模型组有极显著差异(P<0.01);高剂量组(1200 mg/kg)对HDL-C含量无明显影响,低(300 mg/kg)、中剂量组(600 mg/kg)能增加HDL-C含量,与模型组间有极显著差异(P<0.01),有利于AI指数的降低。以上结果表明西兰花茎叶蛋白肽具有良好的降血脂活性。     

乳清蛋白水解制备功能性多肽的研究概况

乳清是生产干酪及干酪素过程中获得的大量液态副产物,含有丰富的营养成分,其主要成分乳清蛋白的营养价值极高。随着近年来小肽生物活性功能研究的开展,对于乳清蛋白水解物中功能性多肽的研究成为主要方向。近年来的研究中发现乳清蛋白中含有多种生物活性肽,包括ACE抑制肽、抑菌肽、抗病毒肽、抗氧化活性肽及其它活性肽。目前,国内外有关ACE抑制肽的研究较多,而对降胆固醇肽的研究多是以大豆蛋白为原料,而更具有研究价值的乳清蛋白源降胆固醇肽研究较少。本人以乳清蛋白为原料,对其酶解产物的降胆固醇活性肽进行分离制备,既充分利用了干酪的副产物,减少了资源浪费和环境污染,又能提供一种新型降胆固醇功能产品,为商业化开发乳清蛋白降胆固醇功能产品提供理论依据。本文结合本人对降胆固醇肽的研究,综述了乳清蛋白源功能性多肽的制备、分离纯化技术及其活性多肽的研究概况。     

降胆固醇亚麻籽蛋白酶解肽的分离纯化及结构鉴定

采用Protease M对亚麻籽蛋白进行酶解,制备具有降胆固醇活性的亚麻籽蛋白酶解肽,对其进行分离纯化及结构鉴定,并合成相应多肽验证其降胆固醇活性。结果表明,经Protease M对亚麻籽蛋白酶解4 h时获得的亚麻籽蛋白酶解肽胆固醇胶束溶解度抑制率最高,为47.57%;继续采用超滤技术将其分离为相对分子质量小于等于3 kDa、3~5 kDa、5~10 kDa、10~30 kDa和大于30 kDa 5个组分,发现相对分子质量小于等于3 kDa的组分胆固醇胶束溶解度抑制率最高,为71.0%;再经大孔树脂对该组分进行吸附后经过不同体积分数乙醇溶液洗脱,发现75%的乙醇洗脱分离得到的组分胆固醇胶束溶解度抑制率最高,为79.8%;采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）对其进一步分离纯化,收集到F9组分的胆固醇胶束溶解度抑制率最高,为85.7%;最后采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)从F9组分中鉴定出6种降胆固醇亚麻籽肽,氨基酸序列分别为Ile-Ile-Pro-Ala-Phe(IIPAF)、Leu-Asn-Phe-Phe(LNFF)、Leu-Leu-Gly-Thr-Leu(LLGTL)、Ile-Pro-Pro-Phe(IPPF)、Ile-Ile-Phe(IIF)和Leu-Leu-Gly-Ala(LLGA),其胆固醇胶束溶解度抑制率分别为82.8%、77.8%、88.0%、93.5%、80.3%和87.1%。     

凝胶过滤色谱纯化乳清蛋白降胆固醇肽的研究

从乳清蛋白水解物中纯化降胆固醇活性肽,乳清蛋白经胰蛋白酶水解得到的水解物经超滤粗分离,采用凝胶过滤色谱分离纯化,并对其洗脱流动相种类、pH值和洗脱液浓度进行优化筛选,采用体外检测方法筛选出最佳洗脱条件下的具有胆固醇胶束溶解度抑制活性最高的组分,并用已知分子量的标准蛋白质凝胶层析绘制校正曲线,建立分子量的对数与出峰时间的关系。结果表明,优化的最佳洗脱液为磷酸钠溶液,研究得到了凝胶过滤色谱的校正曲线,在洗脱时间为71 min时得到的组分降胆固醇活性最高,为57.48%,经计算其分子量在2 000~4 700 u范围内。     

小麦面筋蛋白短肽的镇痛作用研究

采用小鼠热板法和小鼠醋酸扭体法对由不同蛋白酶(碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃酶、胰酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶)水解制备的小麦面筋蛋白短肽的镇痛活性进行了测定。结果表明,由碱性蛋白酶、胃酶、胃酶和胰酶复合水解制备的3种面筋蛋白短肽(AWGH、PWGH和PPWGH)具有较好的镇痛作用。在小鼠热板法实验中,其痛阈提高百分率分别为(77.78±13.82)%、(81.22±9.69)%和(79.78±22.77)%;在小鼠醋酸扭体实验中,其扭体抑制率分别为(38.25±2.98)%(、57.82±3.04)%和(52.43±3.87)%。     

乳清多肽对D - 半乳糖衰老模型大鼠血清和脏器组织抗氧化效果的影响

研究乳清蛋白的碱性蛋白酶水解产物对D- 半乳糖(D-gal)衰老模型大鼠抗氧化效果的影响。将大鼠分为7组,包括正常对照组、D-gal 模型阴性对照组、D-gal ＋未水解乳清蛋白组、D-gal ＋乳清蛋白肽低剂量组、D-gal＋乳清蛋白肽中剂量组、D-gal ＋乳清蛋白肽高剂量组和D-gal ＋抗坏血酸模型阳性对照组。各处理组灌胃45d 后,检测衰老大鼠血清、心脏和肾脏的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量的变化及肝脏中过氧化氢酶(CAT)活性的变化。抗坏血酸阳性对照组和低、中、高剂量乳清多肽组均可使大鼠血清、心脏和肾脏的SOD 、GSH-Px 及CAT 活性提高,MDA 含量降低,并且与阴性对照组相比差异显著 (P ＜0.05)。其中,高剂量乳清多肽组(200mg/kg bw)对SOD 酶活性作用最显著,使血清SOD 活性比阴性对照组提高了29.2%。高剂量乳清多肽组使肾脏GSH-Px 活性及肝脏中CAT 活性达到了阳性对照抗坏血酸的水平(P ＞ 0.05),同时,中剂量乳清多肽组(100mg/kg bw)使心脏中的MDA 含量与阴性对照组相比下降了38.6%。结果表明,乳清多肽能够通过提高生物体内抗氧化酶系的活力,减少自由基对组织器官的损害,发挥其抗氧化作用,这说明乳清多肽在延缓机体衰老方面具有一定的效果。     

碱性蛋白酶水解乳清分离蛋白工艺优化

目的 降低乳清分离蛋白中的致敏蛋白含量, 制备低致敏性乳制品。方法 利用碱性蛋白酶水解乳清分离蛋白, 研究酶添加量、初始pH、酶解时间以及温度对乳清分离蛋白水解度的影响。在单因素的实验基础上, 采用Box-Behnken实验设计方法进行四因素三水平的响应面优化实验。结果 在P<0.05的水平下, 4个因素对乳清分离蛋白的水解度都有显著影响。最优的水解工艺为: 酶添加量6.4%、初始pH 11、酶解时间4 h、温度60 ℃。乳清分离蛋白在此条件下水解后, 水解度达到21.11%。酶解液的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析显示, 经过这一优化工艺水解, 10 kDa以上的蛋白基本全部被降解。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)分析酶解产物的多肽及蛋白质分子量分布, 结果显示酶解产物的分子量大都分布在3.5 kDa及以下。采用间接竞争酶联免疫吸附法原理测定2种标志性致敏蛋白(β-乳球蛋白和α-乳白蛋白)的残余抗原性, 发现2种致敏蛋白的残余抗原性也有不同程度的降低。结论 通过碱性蛋白酶水解后, 乳清分离蛋白中具有致敏性的大分子蛋白转变为小分子的肽类, 从而降低了致敏性。     

大豆降压肽酶解制备工艺的优化研究

以大豆分离蛋白(SPI)为原料,分别采用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶对SPI进行酶解,测定水解度及ACE抑制率,结果表明碱性蛋白酶酶解液效果较好。采用响应曲面法对碱性蛋白酶酶解工艺参数进行优化,在此基础上采用双酶协同酶解和三酶联合酶解,然后对酶解液进行超滤分离和真空冷冻干燥,采用FA-Phe-Gly-Gly为底物的酶活力检测法对不同大豆降压肽组分进行活性检测。结果表明三酶联合酶解效果最好,水解度(DH)及ACE抑制率高达32.24%和84.44%。