双重PCR 方法检测沙门氏菌和空肠弯曲菌

为建立能够同时检测食品中沙门氏菌和空肠弯曲菌的双重PCR 方法。采用沙门氏菌鞭毛基因fimY 和空肠弯曲菌马尿酸酶基因hipO 设计特异性引物,并对影响PCR 扩增的主要因素——引物浓度、退火温度、Mg2+ 浓度因素进行优化,比较单一PCR 和双重PCR 的检测效果。结果表明：采用单一PCR 法检测沙门氏菌和空肠弯曲菌时,灵敏度分别可达到3.98pg 和4.05pg;而采用双重PCR 检测时,灵敏度较单一PCR 法有所下降,沙门氏菌和空肠弯曲菌检出限量分别为398pg 和40.5pg。本研究建立的特异性强和灵敏度高的双重PCR 检测方法,可为实现食品中沙门氏菌和空肠弯曲菌的同时检测提供新方法。     

食品中沙门氏菌FTA膜结合跨越式滚环等温扩增检测方法的建立

为实现食品中沙门氏菌的简便和快速现场检测,本研究采用FTA膜(Flinders technology associates,FTA)结合跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)方法(FTA-SRCA)建立一种新型的沙门氏菌检测方法。利用FTA膜快速提取模板DNA,根据沙门氏菌的inv A基因设计及筛选引物,建立FTA-SRCA反应体系。扩增反应在能够实现集约化检测的凹孔板中进行,反应结束后添加荧光染料观察结果。确定了该方法的特异性、灵敏度和人工污染样品的检出限,并对60个实际样品进行检测,评估其敏感性、特异性和符合率。结果表明:检测的17株沙门氏菌均为阳性结果,29株非沙门氏菌均为阴性结果,特异性良好。FTA-SRCA方法的灵敏度为6.81×100 CFU/m L,比PCR方法高100倍,比SRCA方法高10倍。对于人工污染的牛奶样品检测,FTA-SRCA方法的检出限为3.22×100CFU/m L,比PCR方法低1000倍,比SRCA方法低10倍。检测实际样品的敏感性、特异性和符合率分别为100.00%,94.64%,95.00%。本研究建立的FTA-SRCA方法具有操作简便快速、成本低廉、特异性强、灵敏度高、检出限低等优点,可用于食品中沙门氏菌的大批量集约化快速现场检测。     

添加扩增内标的PCR方法快速检测食品中的沙门氏菌

为了建立一种含扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法,以细菌16S r RNA为扩增内标对照,以沙门氏菌inv A基因为靶基因设计了一对引物,并优化了PCR反应体系。通过对20种细菌进行PCR检测显示,该方法对沙门氏菌具有良好的特异性。灵敏度实验表明,该检测方法对沙门氏菌纯DNA模板的检测灵敏度为61.1 fg/μL,对沙门氏菌纯培养物的检测灵敏度为2×102 cfu/m L。对人工污染蛋清的检测实验显示,沙门氏菌接种量为2 cfu/25 m L的鸡蛋清样品经过8 h增菌培养后,可被该方法检出。结果表明,该检测方法特异性强、灵敏度高,能排除沙门氏菌PCR检测方法中可能出现的假阴性现象,适用于鸡蛋等食品中沙门氏菌的快速检测。     

食品中沙门氏菌恒温隔绝式PCR检测方法的建立

为弥补传统培养方法耗时长和现场检测步骤繁琐等缺陷,该研究建立了一种针对食品中沙门氏菌的恒温隔绝式PCR快速检测方法。根据沙门氏菌的inv A基因设计特异性引物和探针,通过水浴法快速提取细菌DNA,优化引物、探针以及模板用量,建立了一种基于恒温隔绝式PCR快速检测沙门氏菌的方法,并对方法的特异性和灵敏度及稳定性进行评价,最后对比建立的方法与传统PCR方法、传统分离培养法对实际食品样品中沙门氏菌污染的检测效果。建立的恒温隔绝式PCR检测方法特异性好,灵敏度高且与其他细菌无交叉反应,最低检出限可达75 CFU/mL,可在6 h内完成检测实际食品样品中污染的沙门氏菌,传统PCR方法至少需12 h才能达到与之相同的检测效果,传统培养法验证了建立方法的准确性和可靠性。本研究建立的恒温隔绝式PCR方法更快速,且操作简便,适用于现场检测食品中污染的沙门氏菌。     

可视化跨越式滚环等温扩增技术检测食品中沙门氏菌

建立一种新型的核酸体外等温扩增方法--可视化跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)检测沙门氏菌。根据沙门氏菌stn基因序列设计引物,进行特异性验证。测定该技术的灵敏度以及人工污染鸡肉样品的检出限。通过检测多种实际食品样品,评价SRCA方法的敏感性、特异性和符合率。研究结果表明:所有沙门氏菌呈阳性结果,非沙门氏菌呈阴性结果,说明引物特异性良好。SRCA方法检测沙门氏菌DNA的灵敏度为5.6×10~0fg/μL,检出限为3.8×10~1CFU/mL;PCR方法的灵敏度为5.6×10~2fg/μL,检出限为3.8×10~3CFU/mL。该方法检测30个实际样品的检出率为13.33%,并与GB 4789.4-2016方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%,96.30%和96.67%。结论:可视化跨越式滚环等温扩增技术具有操作简便,特异性强,灵敏度高,检出限低,检测成本低,对试验设备要求低等优点,适用于基层单位对食品中沙门氏菌的快速检测。     

多重PCR技术检测食品中鼠伤寒沙门氏菌3 种毒力基因

该研究建立多重酶链式反应法快速检测鼠伤寒沙门氏菌3 种毒力基因的检测方法。以鼠伤寒沙门氏菌毒力基因mgtC、inva、mogA、sseL、araB 设计合成特异性引物,提取鼠伤寒沙门氏菌的DNA 为扩增模板,通过单重聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction,PCR）验证引物特异性,利用引物特异性、Tm 值等综合因素通过多重聚合酶链式反应技术（multiple polymerase chain reaction,MPCR）检测方法实现沙门氏菌多种毒力基因的检测,并优化MPCR 试验参数,提高检测灵敏性。结果表明,在多对特异性引物中进行MPCR 反应,筛选出mgtC、mogA、araB 3 种毒力基因进行MPCR 反应的特异性强、无交叉污染,且该方法能检测的最低灵敏度为0.0165 ng/μL。成功建立快速检测食品中沙门氏菌3 种毒力基因的方法,该方法检测特异性强、灵敏度高,检测限低。     

可视化环介导恒温扩增法检测蔬菜产地环境灌溉水源中沙门氏菌

目的建立可视化环介导恒温扩增体系(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测灌溉水源中沙门氏菌的分析方法。方法以沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因序列设计特异性LAMP检测引物,优化LAMP反应体系和反应条件后,通过特异性实验、灵敏度实验对LAMP检测方法进行测试,并与国标检测方法对比检测人工污染的灌溉水源样品,验证该方法的准确性。结果灵敏度实验结果显示本LAMP检测方法最低检出限为7 CFU/25μL,特异性实验结果显示本LAMP检测方法具有良好的特异性,干扰菌株对本LAMP检测方法无影响。该方法在与国家标准检测方法对比,检测人工污染的灌溉水源样品时具有相同的准确性,检测灵敏度为1×10^2 CFU/mL。结论本研究建立了快速、准确、灵敏的恒温扩增体系,可以应用于灌溉水源中沙门氏菌的快速检测。     

两种基于重组酶介导扩增技术的沙门氏菌检测方法比较

该研究旨在利用重组酶介导扩增技术建立并比较两种食品中沙门氏菌快速检测方法。根据沙门氏菌菌毛蛋白fimY基因设计引物和探针,分别采用荧光法和侧向流试纸条法对扩增产物进行检测,构建重组酶介导等温核酸扩增方法,验证两种方法的特异性、灵敏度及对人工污染样品的检测效果。该研究构建的两种方法均在39 ℃下恒温运行,检测时间30~40 min,方法特异性良好,与大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌等常见的其他食源性致病菌无交叉反应,侧向流试纸条法灵敏度可达到1 pg/μL,荧光法灵敏度为 10 pg/μL,对人工污染样品的检测结果与传统分离培养法检测结果一致。因此该研究建立了两种快速、特异、灵敏的方法用于检测沙门氏菌,为食品中沙门氏菌污染的快速筛查提供一定的参考价值和数据支撑。     

免疫捕捉通用引物PCR检测食品中沙门氏菌

利用免疫吸附富集结合经典PCR 技术建立免疫捕捉通用引物PCR(IC-UPPCR)检测食品中沙门氏菌。采用细菌16S rRNA 基因保守区设计特异性引物,建立通用引物PCR 技术是可行的,该IC-UPPCR 检测沙门氏菌的灵敏度最低,能检测到2 × 102CFU/ml,检测沙门氏菌属和非沙门氏菌属标准株的特异性为100%,无假阳性和假阴性出现。结果表明该方法具有简单、快速、特异性好和敏感性高等特点,并可满足大批样品沙门氏菌筛选检测的要求,适用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等领域。     

牛乳中沙门氏菌的荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种牛乳中沙门氏菌的荧光定量PCR快速检测方法,根据沙门氏菌invA基因序列和荧光定量PCR要求设计了合适的特异性引物,然后提取菌体DNA,对目的基因进行克隆,以重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线,以沙门氏菌DNA为模板进行荧光定量PCR扩增,确定其扩增条件。结果表明,建立的方法特异性强,与志贺氏菌等致病菌无交叉反应,且方法的灵敏度高(为0.1 ng/L)。以掺入沙门氏菌的牛乳为样品,可检测到牛乳中44.2 mL~(-1)的沙门氏菌。该方法适用于快速、准确检测牛乳中的沙门氏菌,为实验室快速检测致病菌提供参考。     

聚合酶链反应检测食品中的沙门氏菌

参考沙门氏菌侵袭性基因invA的序列,设计合成一对引物扩增其中一段序列,建立了特异性检测沙门氏菌的PCR方法。引物两端分别加了Bam HI和EcoR I切点,扩增片段大小为300bp。对收集的50个血清型123株沙门氏菌及7种23株非沙门氏菌进行PCR检测,结果仅沙门氏菌有300bp的扩增产物,显示了很强的特异性,为下一步克隆而设计的两个酶切位点对引物的特异性没有影响。经琼脂糖凝胶电泳,PCR的检出极限是10pg染色体DNA和10~2 cfu的细菌。将扩增产物经slot—blot与辣根过氧化物酶(HRP)直接标记的invA基因探针杂交,经增强型化学发光反应(ECL)及化学发光自显影(CPD)检测,可提高检测的敏感性一个数量级,同时增加了特异性。为推广应用,本文试验了8种模拟食品样品对PCR反应的影响,结果除奶酪外,其余都得到较好扩增。对120份污水及食品样品进行检测,该检测系统检出70份阳性结果,检出率高于常规分离。初步应用显示,PCR检测方法敏感、特异、简便、快速,适合于食品卫生检验和临床标本检验的现场应用。     

A nucleic acid sequence-based amplification method to detect Salmonella enterica serotype enteritidis strain PT4 in liquid whole egg

Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) was applied to the detection of Salmonella enterica cells in liquid whole egg. Samples (25 g) of liquid whole egg inoculated with Salmonella cells were enriched for 16 h in buffered peptone water, and the NASBA procedure was effective in detecting the presence of Salmonella in samples inoculated with 10 to 100 CFU prior to enrichment.     

NASBA技术及其在检验检疫中的应用

序列特异性核酸体外扩增技术(nucleic acid specific-based amplification,NASBA)是在PCR基础上发展起来的一种扩增RNA的新技术,作为一种新型研究手段,具有便捷、准确性好、灵敏度高、周期短的特点,尤其适用于RNA的分析研究。核酸分析技术是出入境检验检疫工作的重要手段,可用于食品病原微生物、动植物产品中的有害生物、病原的分析及鉴定。本文简要介绍了NASBA技术的基本原理,在论证对比NASBA技术与普通PCR方法、荧光PCR方法及其他恒温扩增等核酸分析技术的差异及相似性后,根据其使用特点进一步对NASBA在进出境检验检疫的食品安全检测及动植物检疫的应用予以综述及展望。     

食品中沙门菌PCR检测方法的建立

为建立食品中快速检测沙门菌的PCR方法。选取沙门菌属侵袭性抗原保守基因invA基因上的靶序列设计一对引物,选择最适Mg 浓度和退火温度,建立最适PCR反应体系,用2%琼脂糖,5μl反应产物(包括EB),100V,40min进行电泳,显像。用该引物对已经传统方法鉴定的22种77株沙门菌和24种24株非沙门菌进行特异性检测,并对人工污染的食品进行检测条件的研究。Mg 浓度和退火温度对该反应体系的影响较小,稳定性较好;经传统方法鉴定的22种77株沙门菌和24种24株非沙门菌验证了该检验方法具有很好的特异性;该检测方法可以在19h内检出含有沙门菌102CFUg的食品(火腿肠、鸡蛋、散装肉馅)。与传统方法比较,该方法快速、敏感、特异,能在较短的时间内对大量样品同时进行检测,适用于食品中沙门菌的快速、敏感、特异检测。     

AnDiaTec Salmonella sp. PCR-ELISA for analysis of food samples

A commercially available PCR kit (AnDiaTec Salmonella sp. PCR-ELISA) was developed and evaluated for the detection of Salmonella sp. in food samples. The test is based on PCR amplification and hybridization of the amplified DNA to a microtiter plate followed by the detection of PCR product in the manner of an enzyme-linked immunosorbent assay test. The sensitivity and specificity were evaluated first with Salmonella pure cultures and artificially contaminated food samples, including food types for which an inhibition of the PCR reaction was expected. Both experiments proved a very good sensitivity, specificity, and reliability of the test with a very broad range of food types. In a second evaluation study, more than 1,100 food samples of different types were tested in parallel with the PCR method and with the International Standardization Organization 6579 bacteriological reference method. The results of this evaluation study and the results from other experiments on dilutions of artificially contaminated food samples led to the establishment of a positive-negative cutoff value (optical density at 450 nm of more than 0.9) with respect to the conventional bacteriological method. Using this positive-negative cutoff, 98% agreement to the bacteriological method was obtained.     

Rapid, specific detection of Salmonella Enteritidis in pooled eggs by real-time PCR

An assay was developed for the specific detection of Salmonella Enteritidis in eggs with the use of an application of the fluorogenic 5' nuclease assay (TaqMan). In this assay, a segment of the gene sefA specific to Salmonella group D strains such as Salmonella Enteritidis was used. The amplification of the target gene products was monitored in real-time by incorporating a fluorescent dye-labeled gene-specific probe in the PCR reaction. This method correctly detected and distinguished Salmonella Enteritidis from nearly 50 of non-group D Salmonella and other non-Salmonella strains. Detection of the sefA gene was linear for DNA extracted from approximately 10(2) to 10(9) CFU/ml in phosphate-buffered saline and 10(3) to 10(8) CFU/ml in raw egg. In two trials, when applied to detection of Salmonella Enteritidis in homogenized egg pools and compared with conventional culture methods, the newly developed PCR method yielded a 100% correlation with results obtained by a conventional culture method. However, the PCR method required only 2 days, compared to the 5 days required by the culture method. The sensitivity of this assay was approximately less than 1 CFU/600 g of egg pool. The real-time PCR assay proved to be a rapid, highly sensitive test for detection and quantification of low concentrations of Salmonella Enteritidis in egg samples.     

鼠伤寒沙门氏菌ompc基因PCR的检测方法

建立一种鼠伤寒沙门氏菌的聚合酶链式反应检测方法。根据GenBank中已发表的鼠伤寒沙门氏菌的ompc的基因序列,设计和合成了一对特异性引物,并优化了反应条件,检测了该方法的敏感性和特异性。结果成功扩增出了鼠伤寒沙门氏菌470 bp的ompc特异性基因片段,而对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和志贺氏菌4 种食品中常见的病原菌均未扩增出相应片段。敏感性实验结果表明本方法可检测到最低1 pg/μL的鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA。     

环介导等温扩增方法在食品中沙门菌检测的应用和评价

将环介导等温扩增检测方法应用于食品中沙门菌的检验,并在检测方法特异性、灵敏度等方面与实时荧光PCR和传统检测方法进行比较。方法 针对沙门菌属高度保守的fimY基因设计环介导等温扩增检测引物并优化反应体系,在特异性、灵敏度和实际样品检测等方面与实时荧光PCR及传统检测方法比对。结果 本研究建立的LAMP方法检测沙门菌93株和非目标菌31株,具有良好的特异性。在纯培养、无需增菌情况下,其检测灵敏度为6.4×10²cfu/ml,与实时荧光PCR方法相当。食品基质添加试验中,环介导等温扩增方法检测低限为2cfu/25g样品;对45份实际食品样品检测结果表明,该方法实际样品检出率为11.1%,与实时荧光PCR及传统方法检测结果一致。结论 本研究建立的沙门菌环介导等温扩增检测方法具有良好的特异性,检测灵敏度与实时荧光PCR相当,适用于沙门菌的快速筛选。