纳豆菌抗菌脂肽对副溶血弧菌的抑菌机理

目的:对纳豆菌抗菌脂肽抑制副溶血弧菌的抑菌机理进行探讨。方法:通过纳豆菌抗菌脂肽对副溶血弧菌生长曲线、细胞超微结构、细胞膜通透性、细胞DNA的作用、细胞蛋白的合成、细胞代谢的影响等方面的研究,探讨纳豆菌抗菌脂肽抑制副溶血弧菌的机理。结果:抗菌脂肽可以使副溶血弧菌细胞膜通透性增加,使得细胞内具有紫外吸收的大分子物质泄漏到细胞外;扫描电镜结果表明抗菌脂肽可以导致副溶血弧菌细胞壁破裂或形成孔洞;抗菌脂肽能够和副溶血弧菌DNA体外结合,导致DNA最大吸收峰发生了轻微的蓝移,且产生增色效应;SDS-PAGE分析表明抗菌脂肽对副溶血弧菌蛋白表达未见有明显影响;当抗菌脂肽的质量浓度达到0.6 MIC以上时,其对副溶血弧菌代谢活力的抑制作用显著。结论:纳豆菌抗菌脂肽可使副溶血弧菌的细胞膜通透性增加,或形成孔洞导致细胞内一些物质泄漏,使细胞生长受到抑制,进而导致死亡。     

抗菌肽BCp12对大肠杆菌壁膜及DNA损伤的作用机制

基于活菌亲和吸附法筛选的乳源蛋白抗菌肽BCp12具有广谱的抗菌效果,但其抑菌机制尚不清楚。本研究利用紫外吸收光谱、流式细胞仪、傅里叶变换红外光谱、扫描电子显微镜及透射电子显微镜等技术探究抗菌肽BCp12对大肠杆菌壁膜的损伤作用,并通过凝胶阻滞和荧光光谱实验研究BCp12与菌体DNA的结合作用及方式。结果表明：质量浓度2 mg/mL的BCp12可引起大肠杆菌壁膜亲水性增加,菌体细胞吸附率下降至64.73%,对菌体壁膜脂肪酸、蛋白、多肽酰胺、多糖及指纹信息区都有明显影响,菌体细胞膜损伤显著（损伤率为25.1%）,且细胞内紫外吸收物质泄漏,菌体形态变得粗糙皱缩,细胞质内部结构遭到严重破坏并出现空化现象;BCp12能够与溴化乙锭相互竞争结合位点,并以嵌入方式结合DNA,产生凝胶阻滞现象,影响DNA的正常复制,进而抑制菌体的生长繁殖。本研究部分揭示了BCp12的抗菌机理。     

源自螺旋藻渣枯草芽孢杆菌发酵抗菌肽SP-AP-1和伊枯草菌素对金黄色葡萄球菌抑菌机制对比研究

目的：研究枯草芽孢杆菌发酵螺旋藻渣的发酵液中分离出的抗菌肽SP-AP-1和伊枯草菌素对金黄色葡萄球菌的抑菌机理。方法：采用紫外分光光度法、邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷法和原子吸收光谱法研究抗菌肽对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响;采用考马斯亮蓝法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳考察抗菌肽对金黄色葡萄球菌胞内蛋白合成及对基因组DNA结合作用的影响,并通过模拟细胞膜的疏水环境探究抗菌肽发挥抑菌作用时其二级结构的变化情况。结果：抗菌肽SP-AP-1和伊枯草菌素均能引起金黄色葡萄球菌细胞膜通透性增加,导致胞内钾离子释放量、蛋白质泄漏量及细胞膜疏水性增加,但抗菌肽SP-AP-1的抑菌效果更为显著（P＜0.05）;两种抗菌肽均能抑制菌体蛋白合成,尤其对分子质量为17、20、25～35 kDa的蛋白抑制作用最为明显;虽然两种抗菌肽对金黄色葡萄球菌基因组DNA没有明显阻滞作用,但增大抗菌肽质量浓度,SP-AP-1可与溴化乙锭竞争性结合DNA,使基因组DNA条带变暗,影响蛋白质的表达。本实验为螺旋藻渣抗菌肽拮抗金黄色葡萄球菌的抑菌机理研究提供了理论参考。     

副干酪乳杆菌发酵液中抗菌肽的筛选及对副溶血性弧菌的抑菌作用

副溶血性弧菌是一种常见的食源性致病菌,严重威胁食品安全和人体健康。本研究利用超高效液相色谱-质谱联用技术鉴定副干酪乳杆菌发酵液中的多肽序列,并通过生物信息学筛选出可能的抗菌序列（RQQAENLAKFAKKG）,命名为Yt9z。研究结果表明其对副溶血性弧菌的最低杀菌质量浓度（MBC）为125μg/mL,可在3 h内将细菌完全杀死。通过膜通透、透射电镜、DNA凝胶阻滞分析、圆二色谱等试验探究其抑菌机制,结果在不同溶液环境下,抗菌肽Yt9z能改变自身的二级结构,进而增加细菌细胞膜通透性,并穿透细胞膜与DNA结合使其死亡。这些发现为抗菌肽Yt9z应用于副溶血性弧菌污染提供了理论参考。     

Bacillus pumilus HN-10抗菌肽P-1对粉红单端孢的抑菌机理

Bacillus pumilus HN-10抗菌肽P-1是一种对粉红单端孢（Trichothecium roseum）具有很强抑菌作用的肽,但其抑菌机理尚不明确。本研究从细胞膜通透性、蛋白合成和核酸合成3 方面研究其抑菌机理。通过大分子释放量和电导率研究抗菌肽P-1对粉红单端孢细胞膜通透性的影响;经胞内蛋白含量测定及胞内蛋白十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析研究抗菌肽P-1对蛋白合成的影响;采用琼脂糖凝胶电泳和荧光光谱分析抗菌肽P-1对粉红单端孢DNA的凝胶阻滞作用及与溴化乙锭（ethidium bromide,EB）竞争性结合作用,并通过DNA和RNA相对含量来研究粉红单端孢核酸合成是否受到抑制。结果表明：抗菌肽P-1可引起粉红单端孢细胞膜通透性增加,胞内电解质和大分子物质外泄;同时,菌体蛋白合成受到抑制,尤其对分子质量在43.0～97.4 kDa之间的蛋白最为明显;抗菌肽P-1对DNA没有明显阻滞作用,但其能与EB竞争性结合DNA,使核酸合成受到抑制,导致菌体代谢紊乱,影响蛋白质的正常表达,进而起到抑菌作用。     

Bacillus amyloliquefaciensBA-16-8所产fengycin对扩展青霉细胞的抑制机制研究

目的:从细胞层面探究B.amyloliquefaciensBA-16-8所产fengycin对Penicillium expansum的抑制机制。方法:采用扫描电镜、透射电镜、核酸染色、光谱吸收和荧光显微观察分析fengycin对P.expansum细胞膜通透性及线粒体等细胞器的影响;采用凝胶阻滞实验探讨fengycin对菌丝体核酸的作用效果。结果:Fengycin处理P.expansum的菌丝体细胞,会导致细胞表面粗糙且细胞形态发生改变,细胞膜的完整性发生了改变,细胞结构遭到破坏。PI染色及光谱吸收实验结果显示,Fengycin可破坏细胞膜的完整性并增加P.expansum细胞膜的通透性。凝胶阻滞实验结果表明fengycin可与P.expansum的DNA于体外结合。结论:Fengycin可改变P.expansum的细胞膜通透性并作用于核酸,抑制基因的表达和细胞器的合成。     

抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌的协同抑菌机理

金黄色葡萄球菌是食品中常见的致病菌,控制食品中金黄色葡萄球菌的生长繁殖对提高食品安全性至关重要。本研究以金黄色葡萄球菌作为指示菌,考察了抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸的协同抑菌机理。抑菌动力学结果表明抗菌肽与ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌具有协同抑菌效果;细胞膜质子动力势研究结果显示,抗菌肽对跨膜pH值梯度无明显影响,ε-聚赖氨酸会破坏跨膜pH值梯度,1/4最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)抗菌肽+1/4 MICε-聚赖氨酸(联用组)对跨膜pH值梯度产生了协同破坏作用;采用流式细胞术结合荧光显微镜考察细胞膜的完整性,发现抗菌肽对细胞膜完整性具有较强的破坏作用,1/4 MIC抗菌肽即可导致36.3%的膜破损,而ε-聚赖氨酸对膜完整性损伤较小,1/4 MICε-聚赖氨酸仅破坏10.4%的细胞膜完整性,两者联用可对细胞膜完整性产生协同破坏作用,导致51.3%细胞膜完整性发生损伤;采用透射电子显微镜观察了细胞超微结构,发现抗菌肽和ε-聚赖氨酸联用较单独使用对细胞形态和细胞内容物的泄漏产生了协同破坏作用;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,ε-聚赖氨酸会抑制菌体蛋白质的合成或降解蛋白质,而抗菌肽对蛋白质合成无影响;琼脂糖凝胶阻滞电泳表明,抗菌肽对菌体DNA条带无明显变化,而ε-聚赖氨酸以及两者联用会造成DNA滞留,表明ε-聚赖氨酸可以通过与DNA结合发挥抑菌作用。上述结果表明,抗菌肽brevilaterin和ε-聚赖氨酸联用可以增强对细胞膜的破坏强度,且兼具抗菌肽对呼吸链脱氢酶活性的抑制与ε-聚赖氨酸对跨膜pH值梯度的破坏和DNA的结合作用,从而实现多靶位协同抑菌。     

凡纳滨对虾抗菌肽的筛选及与DNA的结合机制

探究凡纳滨对虾中一种新型抗菌肽PV13对副溶血性弧菌的抑菌活性及与DNA的结合机制。采用超高效液相色谱-质谱联用技术鉴定凡纳滨对虾体内小分子多肽序列,并采用生物信息学从序列库中分析、筛选得到阳离子抗菌肽PV13(ALPWVLPWALPRALPRVLPR)。通过最低抑菌浓度(MIC)和时间杀伤曲线(Time-kill)测定抗菌肽PV13对副溶血性弧菌的MIC为62.5 μg/mL,可在2 h内将副溶血性弧菌全部杀灭。采用透射电子显微镜观察、细胞内膜通透性测定、DNA凝胶阻滞和圆二色谱仪等评价抗菌肽对副溶血性弧菌的抑菌机制。结果表明,抗菌肽PV13能增加副溶血性弧菌细胞膜内膜的通透性,使得细胞膜变薄,从而进入细胞,与基因组DNA结合来体现其抑菌活性,二者结合程度与肽浓度呈正相关。抗菌肽PV13在PBS和SDS溶液中均呈无规则卷曲结构,与副溶血性弧菌基因组DNA结合后,色谱吸收峰发生明显变化。推测序列中4个重复的亮氨酸-脯氨酸区域可能是其抑菌活性功能域。上述结果对凡纳滨对虾中抗菌肽的筛选及其分子设计具有指导意义,同时也为抗菌肽PV13作为食品新型防腐剂的应用提供理论支持。     

纳豆菌脂肽对金黄色葡萄球菌抑菌机理的研究

【目的】研究纳豆菌脂肽对金黄色葡萄球菌的抑菌机理。【方法】通过对金黄色葡萄球菌生长曲线、细胞膜通透性、细胞蛋白的合成、细胞超微结构、细胞代谢的影响等方面的研究,探讨纳豆菌脂肽对金黄色葡萄球菌的抑菌机理。【结果】脂肽可以使金黄色葡萄球菌的细胞膜通透性增加,使得具有紫外吸收的大分子物质发生泄漏;可以导致金黄色葡萄球菌细胞壁形成孔洞甚至使细胞断裂;脂肽对金黄色葡萄球菌蛋白表达未见有明显影响,但可抑制部分蛋白质的合成;对金黄色葡萄球菌代谢活力有较强的抑制作用。【结论】纳豆菌脂肽可使金黄色葡萄球菌细胞膜通透性增加,或细胞膜形成孔洞导致细胞内物质泄漏,使细胞生长受到抑制,进而导致死亡。     

石竹烯对热杀索丝菌的抑菌机理

本实验研究石竹烯对热杀索丝菌的抑菌效果及其作用机理。通过石竹烯对热杀索丝菌的最小抑菌浓度(minimum inhibition concentration,MIC)和生长曲线的测定考察其抑制活性;通过观察扫描电子显微镜和碱性磷酸酶的泄漏判定石竹烯对细胞形态和细胞壁结构的破坏程度;通过钾离子、二乙酸荧光素分子和蛋白质的泄漏考察其对细胞膜的影响;通过苹果酸脱氢酶以及丙酮酸激酶活力的测定探究其对细胞代谢的影响;通过荧光光谱扫描法研究石竹烯与细菌DNA的结合能力。结果表明,石竹烯对热杀索丝菌的MIC值为4.51 mg/mL,1×MIC和2×MIC石竹烯能够破坏细胞的形态、结构以及细胞膜的通透性,影响细胞代谢,导致苹果酸脱氢酶、丙酮酸激酶活力显著降低(P0.05),同时对基因组DNA构象和结构造成破坏。     

Interaction of MDpep9, a novel antimicrobial peptide from Chinese traditional edible larvae of housefly,with Escherichia coli genomic DNA

Antimicrobial peptides from edible insects may serve as a potentially significant group of food preservatives. In the present work, the mode of action of a novel antimicrobial peptide MDpep9 from Chinese traditional edible housefly larvae was investigated. MDpep9 was shown to bind to bacterial DNA from the results of gel retardation and fluorescence quenching experiments. Further investigations confirmed that MDpep9 could bind with the phosphate group of DNA and intercalate into the base pairs in a helix of DNA or locate in hydrophobic environment of DNA. The previous and present results demonstrated that MDpep9 has dual mechanisms of bactericidal activity: disrupting bacterial cell membranes and binding to bacterial genomic DNA to inhibit cellular functions, ultimately leading to cell death. The results of DNA-binding mode may be contributive in designing new and promising antimicrobial peptides for food preservatives.     

壳聚糖对革兰氏阴性菌抑菌机理的初步研究

体外抑菌法研究壳聚糖对绿脓杆菌、奇异变形杆菌和大肠杆菌的抑菌性能。同时,对细菌表面的亲水性和负电荷进行研究,以阐述革兰氏阴性菌表面性质与壳聚糖对其抑菌性能之间的关系。以大肠杆菌作为代表性菌株,考察了壳聚糖对革兰氏阴性菌的抑菌机理。通过测定菌液中加入疏水性荧光探剂1-N-苯萘胺(NPN)后荧光强度的改变,考察壳聚糖对外膜渗透性的影响。此外,采用红外吸收光谱(FT-IR),对壳聚糖和大肠杆菌的作用产物进行表征。结果表明：革兰氏阴性菌表面的亲水性越好,所带的负电荷越多,壳聚糖表现出较好的抑菌性能;壳聚糖可增加细胞外膜的渗透性,壳聚糖与细胞膜间发生静电作用而使细胞膜破坏,最终导致菌体的死亡。     

抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌的胞内作用机制

研究副干酪乳杆菌FX-6产抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌胞内抑菌作用机制。通过凝胶阻滞电泳、荧光光谱考察抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌DNA的结合作用及方式,考马斯亮蓝法检测、聚丙烯酰胺凝胶电泳考察抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌蛋白合成的影响,邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷法、荧光指示剂法分别测定抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌胞内β-半乳糖苷酶、非特异酯酶表达活性的影响,流式细胞仪分析F1对金黄色葡萄球菌细胞周期的影响。结果显示,抗菌肽F1能以嵌插方式与金黄色葡萄球菌细胞内的DNA结合,阻碍其遗传信息正常表达,使其蛋白的合成减少,并使胞内β-半乳糖苷酶、非特异性酯酶的表达活性减弱,胞内酶系统紊乱,影响其正常代谢,生长周期无法顺利进行,从而起到抑菌的效果。     

核桃青皮中胡桃醌对大肠杆菌的抗菌作用及机制

为研究胡桃醌对大肠杆菌的抗菌活性及其作用机理,用不同质量浓度胡桃醌处理大肠杆菌,分别对最小抑菌质量浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）、生长曲线、细胞膜相对电导率、荧光发射光谱等进行测定,并进行生物膜形成和细胞活性分析、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）以及大肠杆菌基因组合成分析。结果表明,胡桃醌对大肠杆菌具有有效的抗菌活性,MIC为0.062 5 mg/mL。经不同质量浓度胡桃醌处理后大肠杆菌细胞膜相对电导率升高,表明胡桃醌破坏了大肠杆菌膜的完整性,增加了细胞膜的通透性。荧光发射光谱分析结果表明,胡桃醌能够与膜蛋白相互作用从而改变大肠杆菌细胞膜结构。结晶紫和刃天青染色实验结果表明胡桃醌能够通过抑制大肠杆菌生物膜的形成减弱大肠杆菌的呼吸作用,进而抑制其活性。SDS-PAGE和大肠杆菌基因组合成分析结果显示胡桃醌可抑制大肠杆菌中蛋白质、DNA和RNA的表达。通过分子对接实验可知,胡桃醌可以结合到基因组DNA的...     

三种茶叶中多酚提取物的抑菌活性及其对致病菌膜渗透性的比较分析

目的:研究3种茶叶中茶多酚的抑菌活性及对菌株细胞膜渗透性的影响。方法:以西湖龙井、铁观音和普洱茶为材料提取茶多酚,以滤纸片法测定茶多酚的抑菌圈直径,二倍肉汤稀释法测定其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),比较其抑菌效果。通过DNA渗透性实验、DNA损伤实验评价茶多酚对细胞膜完整性及对DNA损伤的影响。结果:相同条件下,绿茶(西湖龙井)中茶多酚含量最高为(48.12±3.22) mg/g,青茶(铁观音)次之为(37.36±2.64) mg/g,黑茶(普洱茶)最低为(31.61±1.92) mg/g。绿茶对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强,抑菌圈直径为(1.80±0.06) cm,MIC值为0.125 mg/mL、MBC值为0.25 mg/mL。随着茶多酚提取物浓度的增加,260 nm下的细菌渗透性物质逐渐增多,并且基因组DNA的损伤程度逐渐增大。结论:3种茶叶中绿茶具有更好的抑菌效果,并通过增强细菌细胞膜渗透性,进而对DNA产生一定的损伤。     

对氯苯氧乙酰改性壳聚糖的制备、抑菌及机理研究

采用红外、紫外和荧光光谱对合成的对氯苯氧乙酰改性壳聚糖进行了表征,研究了壳聚糖及对氯苯氧乙酰改性壳聚糖对六种常见细菌生长的影响。此外,考察了对氯苯氧乙酰改性壳聚糖对枯草芽孢杆菌细胞膜蛋白及其质粒DNA的影响。结果表明:对氯苯氧乙酰改性壳聚糖对阴沟肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌性能比壳聚糖本身增强;对粪肠杆菌和肺炎克罗伯杆菌,起初抑制效果较好,但随着作用时间的延长,却失去了抑菌能力;对金黄色葡萄球菌作用24h后,才有微弱的抑菌活性;而对大肠杆菌几乎没有抑制作用。对氯苯氧乙酰改性壳聚糖对枯草芽孢杆菌的抑菌作用,可能是猝灭了其细胞膜蛋白的内源荧光,而改变了膜蛋白的结构,并且破坏质粒DNA的双螺旋结构所引起的。     

乳源抗菌肽BCp12对金黄色葡萄球菌多靶点抑菌机制

为研究新型酪蛋白源抗菌肽BCp12对金黄色葡萄球菌的抑菌机理,本实验通过酶标仪、流式细胞仪、透射电子显微镜分析BCp12对金黄色葡萄球菌的壁膜损伤机制;采用荧光光谱、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳研究BCp12对菌体DNA结合及蛋白质合成的影响;利用赖氨酸乙酰化、琥珀酰化、2-羟基异丁酰化、丙二酰化4 种泛抗体结合免疫印迹分析BCp12对菌体蛋白翻译后修饰的影响。结果表明：BCp12的最小抑菌质量浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）为2 mg/mL,经质量浓度超过MIC的BCp12处理后的菌体细胞膜疏水性显著下降（P≤0.001）,通透性增加,菌体形变严重,部分细胞内容物外泄形成空腔;BCp12与溴化乙锭竞争性结合菌体DNA,使核酸合成受到抑制,胞内蛋白质量浓度显著下降（P≤0.001）,特别是分子质量为15～35 kDa的蛋白变化最为明显,说明BCp12可抑制菌体蛋白质的合成;金黄色葡萄球菌蛋白存在大量的赖氨酸乙酰化、琥珀酰化、丙二酰化修饰,经BCp12处理的菌体赖氨酸丙二酰化修饰水平明显下调,而对赖氨酸琥珀酰化和2-羟基异丁酰化修饰的影响不明显。本实验揭示了BCp12对金黄色葡萄球菌的多靶点抑菌机制,对新型乳源抗菌肽的应用和保障食品安全具有一定的意义。