细菌纤维素生物合成的酶系统及其调控体系

纤维素合成酶和UDPG（二磷酸尿苷葡萄糖）焦磷酸化酶是纤维素合成过程中的关键酶。环二乌苷酸系统是细菌纤维素生物合成中重要的调控体系。本文对此作一简单介绍。     

胶质芽孢杆菌葡萄糖磷酸变位酶基因的克隆、表达与酶学性质研究

胶质芽孢杆菌所产胞外多糖作为絮凝剂在食品工业废水处理方面比传统的工业絮凝剂具有更好应用效果而引起了广泛的关注。葡萄糖磷酸变位酶(PGM,EC5.4.2.2)能将葡萄糖-6-磷酸转变成葡萄糖-1-磷酸而被认为是多糖合成路径上的关键酶之一。本研究克隆获得来源于自胶质芽孢杆菌GIM1.16编码PGM的基因pgm。序列分析表明,该基因包含一个1710bp的读码框。在大肠杆菌中表达了pgm基因并纯化了重组蛋白,SDS-PAGE电泳结果显示重组的PGM分子量约为63kDa。重组的PGM最适反应温度为40℃,但当反应温度超过55℃时,PGM基本丧失活性,PGM在酸性(pH4~6)及碱性溶液(pH8.5~10)中均表现出低活性,其最适合反应pH值为7.5。PGM对底物葡萄糖-1-磷酸的Kcat和Km值分别为684min-1和0.24mM-1。本研究为胶质芽孢杆菌菌株的基因工程改造和代谢工程研究奠定了坚实基础。     

α-PGM过表达对灵芝多糖发酵的影响

为了探究灵芝多糖合成途径中磷酸葡萄糖变位酶(α-PGM)的过表达对灵芝多糖发酵产生的影响,利用农杆菌介导法将同源性基因pgm转化灵芝原生质体,筛选灵芝转化子,测定灵芝胞外多糖产量及胞内多糖含量,并研究多糖合成过程中相关酶基因转录水平的相对表达量和酶的活性。结果发现在PGM过表达的重组型灵芝菌株中胞内多糖含量和胞外多糖量最高分别为21.02 mg/100 mg菌体和0.71 g/L,分别比野生型菌株高9.1%和39.2%;灵芝多糖生物合成途径中pgm、pgi基因转录水平表达量较野生型灵芝菌株处于上调状态,且多糖合成代谢中相关酶活性有显著提高。     

构建高效糖配体再生重组菌生物催化合成莱鲍迪苷D

利用拟南芥（Arabidopsis thaliana）蔗糖合酶AtSUS3构建活化糖配体尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose,UDPG）再生体系,与高效催化莱鲍迪苷D（rebaudioside D,RD）合成的糖基转移酶协同偶联完成RD的高效生物催化。从拟南芥cDNA克隆获得AtSUS3基因,将其装配至pET28a获得表达质粒pLW105,随后pLW105与携带糖基转移酶EUGT11基因的质粒共转化大肠杆菌BL21（DE3）构建双酶共表达工程菌。在不添加UDPG或者尿核苷二磷酸（uridine diphosphate,UDP）的条件下,以上述双酶共表达工程菌全细胞催化莱鲍迪苷A（RA）获得的底物摩尔转化率大于80%,RD产量达到930?mg/L。随后构建双酶基因串连质粒pLW108及双酶共表达大肠杆菌BL21（DE3）工程菌。用串连质粒构建的工程菌催化效果与双质粒共转化相同。采用共表达双酶工程菌的发酵破碎粗酶进行催化,结果显示以粗酶催化可简化催化体系,并可将细胞催化体系所需高质量浓度蔗糖用量降至质量浓度5 g/100 mL,同时在不添加外源UDPG的条件下实现RD的高效生物催化,RA底物摩尔转化率达到93%,RD产量约为1?051?mg/L。     

天麻、苦荞醇提物对灰树花胞外多糖合成酶类的影响及天麻苦荞醇提物复配发酵液的抗疲劳作用

该实验探究了天麻（Gastrodin elata Bl.）、苦荞（Tartary Buckwheat）醇提物的添加对灰树花（Grifola frondosa）胞外多糖（Exopolysaccharide,EPS）合成过程中磷酸葡萄糖变位酶（Phosphogluconate Mutase,PGM）、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose Pyrophosphorylase,UGPase）和磷酸葡萄糖异构酶（Phosphogluconate Isomerase,GPI）三种关键酶的影响。并以此为前提,采用动物实验进一步探究灰树花发酵液的抗疲劳作用。结果表明：天麻、苦荞醇提物的复配添加可显著增强PGM和UGPase的活力,降低GPI的活力,与空白组相比PGM和UGPase的活力分别增加了86.98%和69.12%,GPI的活力降低了65.78%。此外,其复配发酵液在抗疲劳作用方面表现最佳,显著高于空白组（p<0.05）和实验组（p<0.05）。主要在提高小鼠游泳力竭时间、肝糖原（Hepatic Glycogen,HG）和乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase,LDH）含量,降低乳酸（Lactic Acid,LA）和尿素氮（Blood Urea Nitrogen,BUN）含量几个方面体现。研究表明复配液的添加可显著改变灰树花EPS合成途径中关键酶类的活力,从而提升发酵液中EPS的含量,使其具有良好的抗疲劳作用。     

淀粉质原料在普鲁兰多糖生物合成中的作用及生理机制

为了考察不同淀粉质原料对出芽短梗霉生物合成普鲁兰多糖的影响,本文分别选用来源于木薯、玉米、马铃薯、红薯和小麦等作物的淀粉作为碳源发酵生产普鲁兰多糖。结果发现,木薯淀粉有利于普鲁兰多糖的生物合成,最高产量达到23.96 g/L;红薯淀粉则不利于普鲁兰多糖的合成,显著（P<0.05）降低了普鲁兰多糖的产量和分子量。进一步地,对普鲁兰多糖分批发酵动力学参数和生理学指标进行分析比较,发现木薯淀粉提高了普鲁兰多糖合成关键酶活性和胞内前体物质尿苷二磷酸葡萄糖的含量,进而提高了普鲁兰多糖的合成能力和产量;而红薯淀粉则提高了普鲁兰多糖降解酶活性,显著（P<0.05）降低了普鲁兰多糖的分子量。对普鲁兰多糖分批发酵碳源成本进行估算,发现利用木薯淀粉合成普鲁兰多糖的碳源成本只有葡萄糖对照组的56.6%。该研究结果为普鲁兰多糖的廉价高效生产提供了可行的技术参考。     

小麦淀粉加工废液制备葡萄糖浆的糖化工艺优化

以降黏和液化后的小麦加工副产物为原料,将原料中的小麦淀粉制备为葡萄糖浆,并优化其糖化工艺以提高葡萄糖的回收率。探究葡萄糖淀粉酶添加量、普鲁兰酶添加量、糖化时间、糖化温度和糖化pH各单因素对糖化液还原糖含量(DE值)的影响。通过响应面实验得出最优工艺参数为葡萄糖淀粉酶添加量300 U/g、普鲁兰酶添加量0.17 U/g、糖化温度62 ℃、糖化pH3.9,糖化时间36 h,得到的DE值为69.45%。进一步通过高效液相-蒸发光散射检测法,测出淀粉转化率为78. 70%,葡萄糖总回收率为23.82%。说明从小麦加工废液中制取葡萄糖浆是切实可行的,对实际生产有着重要的指导意义。     

表面活性剂在生物转化法合成普鲁兰中的作用及生理机制

考察斯潘类和吐温类表面活性剂在利用出芽短梗霉全细胞生物转化合成普鲁兰多糖中的作用,结果发现20 g/L斯潘80和5 g/L吐温80将细胞的普鲁兰合成能力分别提高了46.5%和32.9%,二者复配使用进一步提高了普鲁兰产量和合成效率。通过对相关生理生化参数进行测定,发现斯潘80和吐温80增加了细胞膜的通透性,提高了普鲁兰合成关键酶的活性,提升了胞内尿苷二磷酸葡萄糖和能量物质ATP的水平,加速了ATP的再生,在促进物质和能量代谢的基础上,实现了普鲁兰产量和合成效率的提高。研究结果部分解析了表面活性剂提高普鲁兰合成效率的生理机制,同时也为其他类似结构微生物多糖的高效合成提供技术参考。     

甜味剂莱鲍迪苷D的高效生物催化合成

采用来自水稻的UDP-糖基转移酶EUGT11并结合染色体改造构建了大肠杆菌工程菌,用于全细胞催化莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)生产莱鲍迪苷D(Rebaudioside D,RD)。为了增加宿主细胞内源性糖配体葡萄糖尿苷二磷酸(uridine diphosphate glucose,UDPG)的供给以满足糖基化反应需要,以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌对UDPG代谢通径进行改造,获得了一系列改造菌株SG1、SG2、SG3和SG4。其中以SG4为宿主过表达可高效催化RA合成RD的糖基转移酶EUGT11进行全细胞催化,RD产量高。随后以此工程菌为对象,对可能影响RD催化合成的条件进行了研究,结果表明50 m L培养菌液离心所收集新鲜菌体可在100 mmol/L pH 8.0磷酸钠缓冲液、80 mmol/L柠檬酸钠、体积分数0.1%Triton X100、500 g/L蔗糖、5 mmol/L Zn Cl2、42℃转化1 d的条件下催化1 mmol/L RA底物生成1112.21 mg/L RD,转化率可达98.5%。     

Tween-60对出芽短梗霉合成多糖代谢组学的分析

利用代谢组学技术,研究了Tween-60对出芽短梗霉合成普鲁兰多糖的影响。在初始发酵培养基中添加4 g/L的Tween-60,并采用GC-MS(Gas chromatography-mass spectrometry)对实验组和空白组40 h的胞内代谢物进行分析。结果表明:普鲁兰多糖产量由78.35 g/L提高至92.5 g/L;同时确定出包括L-阿拉伯糖醇、D-核酮糖等6种代谢物表达量上调,α-D-葡萄糖、D-半乳糖等6种代谢物表达量下调。进一步分析表明,添加Tween-60可以增强胞内TCA循环以及戊糖、葡萄糖醛酸循环,为出芽短梗霉代谢提供大量能量以及胞内保护性物质。同时,发现添加Tween-60加快胞内半乳糖代谢,进而促进了普鲁兰多糖发酵前体UDPG的合成,因而多糖产量显著增高。