新型青霉素结合蛋白基因(Bt-pbp2)的克隆、表达及其在青霉素残留检测中的应用

从苏云金芽胞杆菌中克隆到一种新型的青霉素结合蛋白基因Bt-pbp2,并在大肠杆菌中表达该蛋白,通过微量热泳动仪(MST)证实该蛋白与青霉素G有特异相互作用,其Kd值为10.36 nmol/L,利用该蛋白与青霉素G特异性相互作用,设计了竞争性酶联法检测牛奶中青霉素G残留的方法。研究表明,该方法当青霉素G浓度在4~256 μg/L之间时,浓度与吸光度有线性关系,其添加回收率在93.4%±5.24%以上。研究表明,Bt-PBP2蛋白可以用于检测牛奶中青霉素残留,为进一步开发快速、高效青霉素残留检测试纸条设计奠定了基础。     

牛奶中残留青霉素类抗生素检测方法的研究进展

介绍了牛奶中青霉素类抗生素残留的来源、危害，并对在牛奶中常见的青霉素类抗生素的检测方法进行了阐述，对于改进实验方法和提高奶及奶制品质量都有一定的借鉴作用．     

牛乳中氨苄青霉素残留的受体分析法测定

建立基于受体识别技术检测牛乳青霉素类抗生素残留的新方法。通过生物技术制备与青霉素类抗生素具有高度亲和力的受体蛋白质,进而以其为识别元件开发间接竞争氨苄青霉素残留检测方法。青霉素受体包被质量浓度5μg/mL,生物素化氨苄青霉素质量浓度500ng/mL 条件下,对其残留量进行测定,检出限为2μg/kg,有较好的精密度及回收率。在样品中残留的青霉素种类已知的前题下(以氨苄青霉素为例),本方法可以作为定量筛选方法。     

牛奶中青霉素类残留物快速检测方法问世

华中农业大学的“牛奶中青霉素类残留微生物学快速检测方法及试剂盒研究”成果5月11日在武汉通过了农业部鉴定。这项“十五”国家科技攻关项目子课题填补了国内空白,整体技术水平达到国际先进,预期具有良好的社会效益和经济效益。国家兽药残留基准实验室和农业部食品安全评价重点实验室的袁宗辉教授为首的课题组针对牛奶中青霉素类药物残留问题,建立了检测牛奶中青霉素类残留的微生物学快速筛选方法,研制出适合牛奶中青霉素药物残留快速检测试剂盒,经稳定性、交叉反应和动物残留等试验,该试剂盒的灵敏度、假阳性率等性能指标与意大利试剂盒(…     

LC-MS/MS测定牛奶中六种青霉素类抗生素残留

目的建立一种用LC-MS/MS快速测定牛奶中6种青霉素类抗生素残留的方法。方法选择青霉素G-D7为内标,样品经乙腈沉淀蛋白,SPE柱净化、浓缩,有效地去除杂质。经高效液相色谱C18柱分离,选用含0·1%甲酸的水和乙腈作流动相,在26min内,在线梯度洗脱将6种青霉素类抗生素得以分离。结果方法检出限为青霉素G0·02ng/ml、青霉素V0·06ng/ml、苯唑西林0·04ng/ml、氯唑西林0·11ng/ml、奈夫西林0·02ng/ml、双氯唑西林0·19ng/ml,在0·2~2·0ng/ml线性范围内,相关系数r为0·991,回收率大于90%,方法精密度为4·87%。结论该方法准确可靠,重复性好,灵敏度高。可适用于牛奶中多组分β-内酰胺类抗生素的确认和准确定量检测,能满足各国对上述β-内酰胺类抗生素的最低检出要求。     

超高效液相色谱-串联质谱法测定乳及乳制品中青霉素类药物残留量

建立了超高压液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定乳及乳制品中青霉素类药物残留量的方法。利用UPLC-MS/MS外标法进行样品中青霉素类药物的测定。乳制品经乙腈、乙酸锌、盐酸溶液提取,样品再经HLB固相萃取柱富集净化后,进行UPLC-MS/MS检测。结果表明,10种青霉素在1~50 ng/mL范围呈良好线性,线性相关系数大于0.9991。牛奶的平均回收率为88.8%~92.0%,测定结果的相对标准偏差为1%~7%;奶粉的平均回收率在88.7%~91.3%之间,相对标准偏差为5%~11%。研究表明,该方法操作简便、快速、灵敏度高,适用于牛奶和奶粉中10种青霉素类抗生素残留的同时测定。     

青霉素结合蛋白的重组表达及其在β-内酰胺类抗生素检测中的应用

目的 获得重组表达纯化的青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins, PBPs),研究其在β-内酰胺类抗生素检测中的应用。方法 以来源于肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae R6的PBP2x蛋白为对照,以PBP1a蛋白作为目标受体,研究其与β-内酰胺类抗生素的亲和作用。结果 经纯化后的重组蛋白PBP2x和PBP1a检测头孢噻呋、青霉素G、氨苄青霉素、喷沙西林、阿莫西林的半抑制浓度(inhibitory concentration, IC50)都在7.02 ng/mL以下,明确了PBP1a和PBP2x具有β-内酰胺类抗生素结合能力。结论 该研究为开发新的基于PBPs蛋白检测β-内酰胺类抗生素的免疫学方法奠定了基础。     

基于量子点二抗偶联物的荧光免疫分析法测定牛奶中的氨苄青霉素

目的建立基于量子点二抗偶联物的荧光免疫分析法测定牛奶中的氨苄青霉素。方法采用共价偶联的方法将Qdot 655红色荧光量子点(quantum dots, QDs)与二抗偶联,利用制备好的QDs-二抗偶联物代替传统酶标二抗应用到检测牛奶中氨苄青霉素残留检测的荧光免疫分析方法中,并将该方法与酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)进行比较。结果该方法 50%抑制浓度(IC50)为8.3μg/L;检测限为2.5μg/L。空白牛奶加标回收率为94.0%～106.2%,变异系数为2.1%～9.2%。在实际样品的检测中,该方法与ELISA方法和HPLC方法测定的结果相比无显著差异(P0.05)。结论该方法准确、灵敏,适用于牛奶中氨苄青霉素残留的检测。     

应用酶联免疫法快速检测乳品中β-内酰胺类抗生素残留

建立乳品中β-内酰胺类抗生素残留酶联免疫快速检测方法。应用氨苄青霉素抗体,通过人工制备了氨苄青霉素(Amp)和辣根过氧化物酶(HRP)的结合物Amp-HRP,建立直接ELisa竞争法检测β-内酰胺类抗生素,确定了各种β-内酰胺类抗生素的检出限,并对检测条件进行了优化。检测了已知阴性和阳性的生鲜牛乳样品,结果表明对于阴性和阳性牛奶样品的检测未出现假阳性或者假阴性结果。该方法检测结果准确可靠,可广泛应用于检测乳品中β-内酰胺类抗生素残留的检测。     

碳纳米管-壳聚糖复合物免疫传感器检测牛奶中的青霉素

建立了一种高灵敏度阻抗电化学免疫分析法测定青霉素的方法。利用层层自组装技术将多壁碳纳米管（MWCNTs）,壳聚糖（CS）,和Ⅷ冲标记青霉素抗体（HRP．Ab＊）共固定于玻碳电极表面,利用HRP可以催化H202的还原进一步促进对苯二酚的氧化,从而引起阻抗的变化,然后根据电流的变化从而实现了对牛奶中青霉素的定量测量。对于牛奶样品,需要盐析以除去其蛋白质和脂肪,同时对缓冲液的pH、免疫温度和时间都进行了优化。实验表明,在优化条件下,该传感器的响应电流与青霉素的浓度在0．05～5μgL-1范围内有较好的线性关系,相关系数为0．9853,检测限是1．05μgL皿。最后,通过和酶联免疫法（ELISA）对比,可知该法测定青霉素灵敏度高,重复性好,特异性高,可适合用于检测牛奶样品中的青霉素残留。     

酸度计法快速检测牛奶中残留的β-内酰胺酶

为了快速、准确地检测牛奶制品中残留的β- 内酰胺酶的含量,利用β- 内酰胺酶分解青霉素产酸使牛奶pH 值下降的原理,对人工添加了β- 内酰胺酶的牛奶制品与青霉素反应后pH 值的下降规律进行研究。得到牛奶中残留的β- 内酰胺酶与青霉素反应的较适宜条件,从而获得快速检测牛奶制品中残留的β- 内酰胺酶的方法。结果确定牛奶制品中残留的β- 内酰胺酶与青霉素反应的适宜条件为温度33℃、底物质量浓度10mg/mL,检测时间仅为60min。此方法对液态纯牛奶中β- 内酰胺酶的最低检出限为8.92U/mL。     

牛奶中β-内酰胺类和三聚氰胺检测方法的建立

建立一种快速、简便,同时针对牛奶中β-内酰胺类抗生素和三聚氰胺残留的检测方法。应用竞争抑制免疫层析原理,研制β-内酰胺类和三聚氰胺胶体金试纸条。该试纸条检测限分别为青霉素G2μg/L、氨苄青霉素3μg/L、阿莫西林3μg/L、苯唑青霉素6μg/L、邻氯青霉素6μg/L、双氯青霉素6μg/L、萘夫西林20μg/L、头孢喹肟20μg/L、头孢哌酮40μg/L、头孢曲松50μg/L、头孢噻呋90μg/L、头孢洛宁10μg/L、三聚氰胺50μg/L,假阳性率低于5%、假阴性率为0,检测时间不超过15min。该方法操作简便、灵敏度高、特异性强,适用于乳品流通环节中β-内酰胺类抗生素和三聚氰胺残留的快速检测。     

牛奶中β-内酰胺和四环素类抗生素二联检测试纸条的初步研究

抗生素越来越多地被应用于畜牧业中,其在乳制品中的残留问题也备受关注.乳品中残留抗生素不仅危害人体的健康,而且影响经济贸易的正常进行.为适应基层检测牛奶中抗生素残留的需求,作者采用胶体金免疫层析方法,建立了可以同时测定牛奶中的β-内酰胺类抗生素和四环素类抗生素的二联胶体金试纸条.该方法简单可靠,可同时检测牛奶中12种β-内酰胺类抗生素和4种四环素类抗生素,是一种值得推广的定性筛选方法,可作为液相色谱等定量检测仪器法的补充.     

高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶和奶粉中9种青霉素类药物残留量

建立一种检测牛奶和奶粉中9种青霉素类药物残留量的高效液相色谱-串联质谱方法。样品经乙腈-水提取,经HLB固相萃取柱净化,用高效液相色谱串联质谱检测,外标法定量。本方法的检出限,牛奶中氨苄西林、奈夫西林为1μg/kg,阿莫西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、氯唑西林为2μg/kg,苯唑西林、双氯西林为4μg/kg;奶粉中氨苄西林、奈夫西林为8μg/kg,阿莫西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、氯唑西林为16μg/kg,苯唑西林、双氯西林为32μg/kg。9种青霉素在1.0～50ng/mL范围呈良好线性,线性相关系数大于0.9888。牛奶的平均回收率为77.58%～97.77%,测定结果的相对标准偏差为4.24%～16.59%(n=10);奶粉的平均回收率在85.95%～96.78%之间,相对标准偏差为2.71%～13.41%(n=10)。该方法具有简便、快速、准确度高、检出限低的优点,适用于牛奶和奶粉中青霉素类抗生素的测定。     

华中农大完成“十五”科持攻关项目 牛奶中青霉素类残留可快速检测

~~华中农大完成“十五”科持攻关项目 牛奶中青霉素类残留可快速检测~~     

牛奶中β-内酰胺类抗生素残留检测试剂盒的研制

以牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素为检测目标,开发一种能快速检测其残留的试剂盒。利用嗜热脂肪芽孢杆菌BS 10208对酸和β-内酰胺类抗生素敏感的特点,优化其最优的生长条件,并制成在2.5 h内能发生显色反应的检测试剂盒。单因素结果表明,当菌液接种量5%、生长初始pH 8.0、培养温度55℃、蛋白胨添加量0.50%,其菌落数对数值分别为2.9、7.5、7.3、5.8。正交结果表明,在外加入0.5%蛋白胨营养肉汤中,接种5%种子液,在65℃恒温振荡器中培养24 h,其菌落数对数值为7.6。优化后检测试剂盒在2.5 h内能检测牛奶中β-内酰胺类抗生素残留,其各项参数为:反应体积为0.5 mL,1.5%琼脂,0.01 g/L溴甲酚紫浓度,BS 10208细胞总数为1.30×108 cfu,最适反应温度65℃,青霉素钠的限值为2～4μg/L。该试剂盒还能检测牛奶中残留的四环素类、磺胺类、大环内酯类、氨基糖苷类等抗生素。     

乳品中β-内酰胺类抗生素快速检测试纸条研制

通过β-内酰胺类抗生素-载体蛋白偶联物的合成,单克隆抗体的制备与纯化,胶体金标记物的制备,β-内酰胺类抗生素单克隆抗体-胶体金标记物的制备并冻干到微孔试剂,样品吸收垫和反应膜的制备等研究过程,研制出乳制品中β-内酰胺类抗生素的快速检测试纸条。检测限分别为:青霉素G2μg/L、氨苄青霉素4μg/L、阿莫西林5μg/L、苯唑青霉素/邻青霉素/双青霉素均为6μg/L、头孢洛宁10μg/L、萘夫西林20μg/L、头孢喹肟20μg/L、头孢曲松25μg/L、头孢哌酮50μg/L、头孢噻呋90μg/L;本试纸条特异性好、假阳性率不高于3%、假阴性率为0,检测时间不超过15min,检测限量达到了我国和欧盟的要求,适用于乳品流通环节乳品中β-内酰胺类抗生素残留的检测。     

利用基于表面等离子体共振的生物光学传感器检测牛奶中氨苄青霉素残留的方法

采用表面等离子体共振的生物光学传感器的方法,利用生物分子相互作用分析原理及传感器对折射率的高度敏感性,结合传感器金膜表面绑定抗氨苄青霉素单克隆抗体的技术,实现了牛奶中氨苄青霉素含量的定量检测.实验中利用微型表面等离子体共振传感器构建了测量系统,介绍了传感器表面的处理方法,并对氨苄青霉素浓度为0、10、50、100ng/ml的牛奶样品进行了测量,通过对测量结果进行分析,得到了不同氨苄青霉素浓度的传感器响应图,对牛奶中氨苄青霉素含量的最低检测限达到了50ne/ml.结果表明,基于表面等离子体共振的光学生物传感器在牛奶抗生素药物残留检测方面具有很好的应用前景.     

超高效液相色谱串联质谱法测定乳制品中 10种青霉素类抗生素残留

目的建立同时测定乳制品中10种青霉素类抗生素残留的超高效液相色谱-串联质谱分析方法。方法样品经乙腈提取后,乙腈饱和正己烷除去脂肪,经0.22μm微孔滤膜过滤,用乙腈-水(含0.1%甲酸5mmol/L乙酸铵)为流动相,C18柱分离,20 min内梯度洗脱分离10种青霉素;电喷雾正离子模式电离(ESI+),多反应监测模式检测(MRM),外标法定量。结果在0.1~20μg/L浓度范围内,10种青霉素类药物在各种乳制品基质中均有良好的线性关系,线性相关系数均0.999;液体乳最低检测限为0.2μg/kg~1.0μg/kg,乳粉的最低检测限1.0μg/kg~5.0μg/kg;方法回收率在70.2%~108.2%,相对标准差为15%。结论该方法测定乳制品中10种青霉素药物的残留量简便、快速、准确,可以满足对青霉素类抗生素的监测要求。     

蜂蜜中四环素类抗生素的放射免疫法检测

探讨应用放射免疫法检测蜂蜜中四环素类抗生素残留,建立快速筛选方法,确定样品处理;按照GB 14963-2003《蜂蜜卫生标准》中对四环素类抗生素残留要求确定控制点设定的方法。用LC-MS(液相色谱质谱)法验证放射免疫分析法筛选的样品,符合率达100%,且该方法特异性强,与氯霉素、红霉素、链霉素、青霉素G、磺胺嘧啶等其它族抗生素无交叉反应。因此,该法能达到检测蜂蜜中四环素类抗生素残留的要求。