一株枯草芽胞杆菌L249的分离鉴定及对烟草赤星病的盆栽防效

为筛选出对烟草赤星病具有生防潜力的拮抗细菌，以链格孢菌（Alteraria alternata）为靶标菌，采用5点取样法在赤星病发生严重地块采集健康烟株根际土壤，通过梯度稀释分离法和平板对峙法筛选得到一株具有生防作用的拮抗菌L249，对链格孢菌抑菌率达72.27%，经菌落形态、生理生化和分子生物学鉴定为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。该菌能产生蛋白酶、纤维素酶和硝酸还原酶等生防相关酶类。利用比浊法测定菌株L249的生长速率，结果表明该菌培养4 h后进入对数生长期，14 h后进入稳定生长期。盆栽试验结果表明，菌株L249发酵液能有效抑制烟草赤星病的发生，相对防效达60.66%，与10%苯醚甲环唑水分散粒剂的相对防效差异不显著。枯草芽胞杆菌L249可有效防治烟草赤星病，具有较好的生防潜力。     

烟草赤星病拮抗芽胞杆菌的筛选及培养基优化

以赤星病原菌Alternaria longipes为筛选指示菌,采用平板共培养初筛和发酵上清滤液复筛的方法,筛选了烟草赤星病拮抗芽胞杆菌3株。其中菌株K₁₁的菌体径向生长抑制率（PIRG）为63.64%,发酵上清滤液的PIRG值达67.44%。盆栽试验证明,该菌对烟草赤星病具有良好的拮抗能力。经鉴定菌株K₁₁为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。由单因素实验和正交实验优化得到了K₁₁菌株生物量较高的摇瓶发酵培养基配方：葡萄糖20.0 g/L,豆粕30.0 g/L,K₂HPO₄·3H₂O 1.0 g/L,MgSO₄·7H₂O 0.1 g/L。优化后生防菌株K₁₁的生物量比对照提高6.5倍,生物量高达1.28×10¹⁰ CFU/mL,芽胞形成率在95%以上。     

拮抗菌AM6代谢产物防治烟草赤星病试验

为开发更多的生物农药,进行了球孢链霉菌AM6代谢拮抗物质防治烟草赤星病试验。采用不同的施用浓度、不同的施用次数在自然发病条件下进行田间小区防效试验。结果表明,含有AM6拮抗物质的制剂喷雾烟草叶片对烟草赤星病有较好防治效果。其防效随制剂中拮抗物质含量的增加而提高,以100倍液施用2次防效较好,田间防效为80.3%;400倍液施用1次、2次和3次的防效分别为46.9%、64 9%和69.3%。含有AM6拮抗物质的制剂对烟草无明显药害。     

烟草赤星病拮抗芽胞杆菌的筛选、鉴定及促生防病作用

为获得对烟草赤星病菌具有较好生防效果的芽胞杆菌,从福建、山东、云南等地烟草叶片中分离得到187株菌株,对烟草种子进行浸种处理,通过测定发芽率筛选到能够促进种子萌发的6株菌株;利用平板拮抗法、离体叶片接种法、温室生测发现FJ1、FJ1-6能促进烟草生长且对赤星病防效较好;通过生理生化和分子生物学鉴定,FJ1为萎缩芽胞杆菌（Bacillus atrophaeus）,FJ1-6为贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）。防病特性研究发现,两菌株含有参与脂肽类抗生素Surfactin、Fengycin和Iturin合成的基因且脂肽类粗提物对赤星病菌丝生长有明显的抑制作用,抑制率分别为56.9%、65.0%。综上,FJ1、FJ1-6具有优良的促生防病特性及显著的促种子萌发效应,可应用于烟草育苗及赤星病的防治。     

烟草黑胫病不同植物源生防菌的筛选及防效测定

植物内生菌是生防菌剂的宝贵资源,在作物病害生物防治中具有重要作用。本文采用稀释平板法从8种不同植物茎组织中分离内生菌,采用二次平板对峙法筛选拮抗菌,通过形态观察、生理生化反应及16S rDNA分析鉴定菌种,利用盆栽和田间试验检验其生防防效,并测定其促生作用。结果表明:分离出内生菌共89株,其中烟草疫霉菌拮抗效果较好的菌株6株,分别为J11、J21（构树）,T3、T23（马铃薯）,G3（枸杞）和KY（烟草）。KY被鉴定为亚麻假单胞菌（Pseudomonas lini）,J11、G3和T3为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）,T23为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）,J21为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。KY、T23及J11的相对防效较好,盆栽相对防效分别为75.41%、63.93%、70.49%,大田相对防效分别为63.62%、51.11%、52.67%,且对烟株的株高、茎围均有促生作用。      

巴里坤草原西伯利亚蝗虫肠道内高产纤维素酶菌株筛选

从采集到的新疆巴里坤草原西伯利亚蝗虫活体标本肠道内分离筛选高产纤维素酶细菌菌株并对其进行初步鉴定。采用常规方法分离肠道菌；利用羧甲基纤维素钠刚果红（CMC-Na）改良培养基初筛分解纤维素菌株，选取透明水解圈较大的菌株测其纤维素酶活力进行复筛；利用VITEK-32生化鉴定仪（法国梅里埃公司）对复筛菌进行鉴定。实验结果表明以羧甲基纤维素钠刚果红（CMC-Na）培养基作为初筛培养基效果较好，初筛到30株菌，选取水解圈较大的10株菌进行复筛，复筛得到4株产纤维素酶活性较高的菌株。经初步鉴定其中一株菌可能是干燥棒杆菌；另一株菌可能是耳葡萄球菌，两株菌未鉴定出。     

拮抗丁香假单胞菌海洋微生物的筛选与鉴定

该研究采用平板涂布法和平板划线法从印度洋沉积物中分离纯化海洋微生物，首先采用滤纸片法对丁香假单胞菌拮抗菌株进行初筛，然后采用牛津杯法进行复筛，并通过形态观察、生理生化试验和分子生物学技术对其进行菌种鉴定，最后研究其抑菌谱。结果表明，从印度洋沉积物中共分离纯化出115株微生物，经过初筛得到33株丁香假单胞菌拮抗菌株，再经过复筛后，筛选出一株对丁香假单胞菌抑菌效果最好的菌株，编号为NO.4.1.3-1，其抑菌圈直径达（12.63±0.06） mm。该菌被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）；除屎肠球菌外，该菌对8株致病菌均有抑制作用，且对肺炎克雷伯氏菌、金黄葡萄球菌的抑菌作用较好，具有较广的抑菌谱。     

烟草赤星病防治药剂的筛选

为筛选防治烟草赤星病的高效杀菌剂,测定了5种常用药剂(氟啶胺、啶氧菌酯、啶酰菌胺、嘧菌环胺、噁唑菌酮)对烟草赤星病菌(Alternaria alternata)的室内毒力及田间防效。结果表明,98%氟啶胺对病菌菌丝生长的抑制活性最强,EC_(50)为0.138 2 mg/L,其次为95%嘧菌环胺,EC_(50)为3.568 9 mg/L,而95%噁唑菌酮最弱,EC_(50)为30.098 3 mg/L。田间防效试验表明,5种杀菌剂中以50%氟啶胺SC和62%嘧菌环胺WG的防治效果较好,防效分别为70.44%和63.09%;以50%啶酰菌胺WG防治效果最差,为39.53%。综合室内毒力和田间防治试验结果,在烟草赤星病防治中推荐氟啶胺和嘧菌环胺。     

抗副溶血弧菌海洋微生物的筛选、鉴定及抑菌谱研究

该研究采用平板涂布法和平板划线法从印度洋沉积物中分离纯化海洋微生物,以副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）为指示菌,采用平板划线法对拮抗菌株进行初筛,琼脂扩散法进行复筛,并通过形态观察、生理生化试验和分子生物学技术对其进行菌种鉴定,并研究其抑菌谱。结果表明,从印度洋沉积物中共分离纯化出115株微生物,经过初筛,得到10株有抑制效果的拮抗菌,经过复筛得到1株对副溶血弧菌有较好抑制效果的菌株,编号为NO.5.10.1-1,抑菌圈直径为（18.50±0.28） mm,该菌被鉴定为中村芽孢杆菌（Bacillus nakamurai）。除金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）外,该菌对7株致病菌均有抑制作用,具有较广的抑菌谱。     

烟草黑胫病拮抗菌XF10的筛选与鉴定

为丰富烟草黑胫病拮抗细菌菌株资源,有效利用生物防治方法控制烟草黑胫病,在烟草黑胫病发病严重地块的健株根际周围选取土壤样品300份,通过喷施病原指示菌快速初筛、平板对峙培养复筛等方法获得了对烟草黑胫病菌有明显拮抗作用的生防菌株XF10。该菌株菌落为圆形,表面光滑凸起,边缘整齐,可产生橙色色素。经形态特征观察、生理生化特性观察、BIOLOG自动微生物鉴定系统鉴定和16S rDNA序列分析,结果显示:该菌株与假单孢菌属的多个绿针假单胞菌序列的同源性达到99%,为假单孢菌属绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)。XF10菌株的菌液以及胞外代谢产物粗提液对烟草黑胫病菌的抑制率均达80%以上,且该菌株的挥发性代谢产物能有效抑制烟草黑胫病菌菌丝生长,抑制率为86%。     

烟草疫霉菌拮抗细菌的筛选鉴定及发酵条件优化

为了筛选对烟草疫霉菌具有拮抗作用的生防细菌菌株,本研究从烟草黑胫病病圃地采集健康烟株的根际土样,采用对峙培养法筛选得到8株对烟草黑胫病具有拮抗作用的细菌菌株,其中编号为LB-9的菌株对烟草疫霉菌的抑制作用最强且效果稳定,抑菌率为60.6%,且抑菌谱广,对其进行16S rRNA基因序列分析后将该菌株鉴定为多粘芽孢杆菌。采用单因素优化试验初步探究了多粘芽孢杆菌LB-9的最适发酵条件,明确了LB-9的最适发酵培养基、最适发酵温度、最适发酵时间和最适发酵初始pH值,对其生防制剂的开发应用具有重要意义。     

生防菌复配对烟草黑胫病的防治效果研究

为解决单一生防菌防效不稳定问题,通过平板对峙试验、相容试验、盆栽试验从6株生防菌中筛选对烟草疫霉菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）具有较高拮抗活性的复配菌株组合;利用分子生物学方法对各菌株的16S rRNA和gyrA基因进行系统进化分析,鉴定各菌株分类地位;并采用轮换因子法筛选各菌株的最适发酵培养基。结果表明,GY1、GY10和GY12发酵后混合施用对烟草黑胫病的防治效果最好,平板抑菌率达到86.9%,盆栽防效为74.53%,比GY1、GY10、GY12单独处理分别提高15.34%、27.42%和44.94%;分子鉴定表明,3株菌分别为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;并筛选得到了GY1、GY10、GY12的最适发酵培养基,发酵24 h后生物量相较于基础培养基分别增加了75.12%,92.31%和194.55%。     

三株芽孢杆菌的生防特性研究

为明确贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）GY1、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）GY10和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GY12的生防特性,采用平板试验法、对扣法、盆栽试验等,对三株生防菌的抑菌谱、次生代谢产物、挥发性物质、根际定殖能力和促生能力等进行了研究。结果表明,GY1、GY10、GY12培养液可以显著促进烟草种子的萌发和烟株的生长;三株生防菌抑菌谱广,对烟草赤星病菌、黑胫病菌及花生镰刀菌等9种病原具有显著的抑制作用,并且都具有分泌嗜铁素和蛋白酶的能力;三株生防菌发酵上清液和挥发性物质对链格孢菌（Alternaria alternata）和烟草疫霉菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae）具有显著抑制作用;菌株的分泌蛋白热稳定性好,对烟草赤星病菌具有显著的体外抑菌活性,并对酸性环境具有较高的耐受性;根际定殖结果表明,GY1-GY10-GY12复配与单菌株相比能增加各生防菌在烟草根际的定殖。以上结果对于菌株GY1、GY10、GY12生防特性的深入挖掘和产业化开发具有一定的指导作用。     

四种稻瘟病生防菌的筛选及其活性评价

为了探明生防菌对稻瘟病菌的抑制作用,采用平板对峙法初筛、生长速率法复筛,从供试菌株中筛出4种对稻瘟病菌有明显抑制作用的目标生防菌,即解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)D1、嗜麦芽寡养假单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)he41、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)he14和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H3。采用生长速率法测定4种生防菌无菌发酵滤液对稻瘟病菌的抑制作用,并对这4种目标生防菌活性的遗传稳定、耐高温、抗紫外线及耐酸碱的性质进行研究。结果表明,无菌发酵滤液的浓度在0.5%~64%时,对稻瘟病菌的抑制率为13.19%~100%之间。菌株D1、he41、he14、H3经转接培养30次,抑菌活性>86%,其发酵液经121 ℃高温处理后,菌株he14无菌发酵滤液的抑菌率达82%,而菌株D1、he41、H3发酵液经40 ℃处理后对稻瘟病菌则无抑制作用。菌株D1、he41、he14、H3在紫外灯(30 W)下照射6 h后,发酵液抑菌率仍达83%以上,经pH3~11的条件处理后,抑菌率>82%。综上,菌株he14是对稻瘟病具有一定生防作用的潜力菌株,为下一步开发防治稻瘟病的微生物制剂奠定了基础。     

一株防治花生采后黄曲霉污染的拮抗菌的筛选及其防控效果

为预防花生储藏过程中的黄曲霉污染,从农田土中分离出2株拮抗芽孢杆菌,通过平板对峙法优选出1株作为研究对象,研究其对黄曲霉的抑制效果及对花生采后黄曲霉污染的防控效果。采用平板对峙法检测拮抗菌的抑菌广谱性并绘制生长曲线,并通过生理生化实验、形态特征观察及16S rDNA序列分析对该菌株进行鉴定。结果表明：优选出拮抗菌B419作为研究对象,其可有效抑制黄曲霉的生长,在拮抗菌浓度为1.0×10⁶ CFU/mL,黄曲霉孢子浓度为1.0×10³ CFU/mL时,黄曲霉孢子萌发抑制率达到98%;相比拮抗菌无菌发酵滤液和拮抗菌细胞悬浮液,拮抗菌发酵液防治花生黄曲霉污染效果最好;该菌株对互隔交链孢霉、枝孢霉、青霉、拟盘多毛孢等多种霉菌都有抑制作用,对大肠杆菌、酵母菌也有抑制作用;该菌株在培养4 h后进入对数期,14 h达到最大,26 h后进入衰亡期;该菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。综上,分离的拮抗菌B419对多种微生物都有抑制作用,不仅可以用来预防花生储藏过程中的真菌污染,在防治植物微生物病害方面也具有良好的应用潜力。     

高产淀粉酶细菌的分离鉴定及产酶条件优化

从赊店老酒大曲中分离筛选产淀粉酶的细菌,通过碘熏蒸产生透明圈法进行初筛,淀粉酶活力测定进行复筛,结合菌落形态观察和16SrDNA同源序列分析以及生理生化对筛选获得的高产淀粉酶细菌进行鉴定,研究影响细菌产淀粉酶能力的单因素:碳源、发酵时间、初始pH、接种量,采用响应面优化确定最佳产酶条件。结果表明,6-10菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),通过响应面优化确定产酶工艺条件最佳为:发酵时间4d,初始pH 5,接种量10%。优化后产酶能力达到(164.37±3.25)U/mL,是优化前产酶能力的4.43倍,具有较强的产淀粉酶能力。     

抗烟草疫霉活性木霉与芽孢杆菌共培养体系的构建与优化

为减轻化学药剂防治烟草疫霉带来的弊端,提高生防菌剂效果,通过琼脂糖扩散法筛选抗性木霉并构建木霉和枯草芽孢杆菌Tpb55共培养体系,采用菌丝生长速率法评价了种间互作防治烟草疫霉的效果,利用单因素法优化共培养体系的培养基成分和发酵条件,并通过盆栽试验验证其对烟草黑胫病的防治效果。结果表明,棘孢木霉HG1具有良好的抗烟草疫霉活性,与枯草芽孢杆菌Tpb55的共培养体系如下:HG1(10⁶CFU/mL)接种量为2%,与Tpb55(10⁶CFU/mL)接种比例为10:1,采用序列共培养方式,即先接种HG1,24h后接种Tpb55。优化后的最适培养基成分为木糖10 g/L,蛋白胨和酵母粉(质量比为2:1)5g/L;最佳发酵为温度25℃,初始pH7.5,转速140r/min。共培养发酵液盆栽防病效果显著优于单培养,防治效果达到74.72%。该体系发酵后能够明显提升两株生防菌抑制烟草疫霉的活性,并对烟草黑胫病具有显著防病效果,为后续多菌株共发酵生防菌剂的开发提供基础。     

猕猴桃溃疡病菌拮抗菌筛选、鉴定及发酵条件优化

目的:从不同地区猕猴桃根际土壤中筛选拮抗猕猴桃溃疡病菌的菌株,优化其产生抑菌活性物质的发酵条件,为猕猴桃溃疡病的生物防治提供潜在的资源菌。方法:采用平板稀释法从猕猴桃根际土壤中分离获得菌株,采用抑菌圈法筛选拮抗菌;通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析对其进行鉴定;并采用单因素及正交试验优化培养基组分及发酵条件。结果:从土壤中共分离到288株放线菌,其中编号为NA-TXL-1的菌株对猕猴桃溃疡病菌的拮抗效果最佳,采用预防法、治疗法进行盆栽实验,发酵原液的防治效果分别为73.06%、55.62%,初步鉴定该菌株为抗生链霉菌。其最佳发酵配方和培养条件为:乳糖30 g/L、酵母粉3 g/L、NaCl 1 g/L、K_2HPO_4 0.5 g/L、MgSO_4·7H_2O 0.5 g/L、FeSO_4 0.01 g/L,种子培养基为乳糖-酵母粉培养基,接种量为2%,起始pH值为7.0,发酵原液、上清液、重悬液分别培养5、14、5 d。结论:经鉴定,拮抗菌株为Streptomyces antibioticus。在优化的发酵条件下,该菌株对猕猴桃溃疡病菌具有更好的拮抗效果。     

产耐盐蛋白酶深海细菌的分离鉴定

本文采用高盐富集、复筛发酵及耐盐稳定性实验的方式,从深海海泥中筛选产耐盐蛋白酶的深海海洋细菌。从深海海洋微生物中共筛选出25株耐盐菌,在这25株菌株中有14株在酪蛋白平板上能产生较大的水解圈;通过发酵复筛及耐盐稳定性实验,筛选得到一株酶活性能高且耐盐稳定性好的菌株,将其编号为SWJSS3;对菌株SWJSS3进行16SrDNA的鉴定并初步研究了盐浓度对产酶情况和酶稳定性的影响。菌株SWJSS3在0~10%(m/V)的盐浓度条件下均能生长,在0~10%的盐浓度下,菌液OD600的吸光值范围为0.08-1.98;通过发酵复筛其所产生的蛋白酶酶活在盐浓度为1%时达最高,为233.56±2.16U/mL;所产蛋白酶在终浓度为15%(m/V)的NaCl溶液下,混匀4℃保存1h,残余酶活为初始酶活的40.70±2.06%,继续存放一段时间到第9h,酶活基本保持不变;通过16SrDNA鉴定其为铜绿假单胞菌,与PseudomonasaeruginosaRP2816SrDNA的相似性达到99%以上。