棘孢木霉GH11家族木聚糖酶的异源表达及酶学性质

目的 探讨Rap1A DNA 甲基化在同型半胱氨酸(Hcy)促进小鼠单核巨噬细胞RAW264.7增殖中的作用。方法 将处于对数生长期的RAW264.7细胞分为对照组(Hcy 0 μmol/L)和不同浓度的Hcy(20,40,60,80,100 μmol/L)干预组,24 h后用XTT检测细胞活力;Edu检测细胞增殖情况;qRT-PCR和Western blot检测Rap1A的mRNA和蛋白的表达;甲基化特异性PCR法(MSP)检测Rap1A启动子区甲基化改变;激光共聚焦显微镜观察Rap1A的变化;将Rap1A干扰腺病毒转染RAW264.7细胞并用Hcy刺激,检测Rap1A的mRNA和蛋白水平的变化及细胞的增殖情况。结果 与对照组相比,不同浓度的Hcy干预细胞后,细胞活力增强,其中100 μmol/L Hcy浓度最为明显(P＜0.01),且细胞增殖水平明显增加(P＜0.01);经Hcy刺激后,细胞Rap1A的mRNA和蛋白表达量显著增加(P＜0.01),启动子区甲基化水平降低(P＜0.01);干扰Rap1A的表达后能够部分逆转Hcy所致的细胞增殖(P＜0.01)。结论 Rap1A启动子区低甲基化介导了Hcy导致的RAW264.7细胞增殖。     

琼胶寡糖对脂多糖诱导的巨噬细胞RAW264.7炎症反应的抑制作用

目的:研究琼胶寡糖对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞RAW264.7炎症反应的抑制作用。方法:采用傅里叶红外光谱法、核磁共振和高效液相色谱法解析琼胶寡糖的分子结构;采用LPS诱导巨噬细胞RAW264.7建立炎症反应模型,测定琼胶寡糖对RAW264.7细胞活力、细胞内一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和活性氧簇(ROS)水平的影响;采用Western blot分析丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中c-Jun氨基末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)和蛋白激酶p38的表达和磷酸化水平。结果:分子结构鉴定结果显示琼胶寡糖具有β构型半乳糖糖环结构,分子质量范围为1 065.5~1 308.2 u。琼胶寡糖可以提高LPS诱导巨噬细胞系RAW264.7炎症反应后的细胞活力,在0~250 μg/mL剂量下呈浓度依赖性地降低细胞内NO、TNF-α和ROS水平,对LPS诱导MAPK家族激酶JNK、ERK、p38磷酸化水平的升高具有抑制作用。结论:琼胶寡糖能够抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7炎症反应,可能与阻碍MAPK信号转导有关。     

轮叶党参粗多糖对体外培养小鼠脾淋巴细胞及RAW 264.7细胞的免疫活性

目的:研究轮叶党参多糖对小鼠脾淋巴细胞及巨噬细胞(RAW 264.7)作用以探究其免疫增强的功效。方法:浓度为1000,500,250,125 μg/mL多糖体外分别与脾脏细胞、RAW 264.7共培养,采用ELISA法检测细胞上清中细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-6和TNF-α浓度的变化。采用MTT法,研究轮叶党参粗多糖对RAW 264.7增殖的影响。Griess法测定细胞上清液中NO的含量变化。通过RT-PCR法检测iNOS mRNA的生成情况。结果:与正常组相比,轮叶党参粗多糖组IL-2、IFN-γ、IL-6、TNF-α和NO的分泌量极显著增加(p<0.01),显著促进RAW 264.7增殖(p<0.05)。与正常组比较,iNOS mRNA明显增加。结论:轮叶党参粗多糖可与ConA协同增强T细胞活性,也可参与活化单核-巨噬细胞对特异性免疫与非特异性免疫活性起到正向调节的作用。     

羊栖菜多酚通过核转录因子-κB/丝裂原活化蛋白激酶通路缓解脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症反应

目的：研究羊栖菜多酚对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7细胞炎症反应的影响。方法：噻唑蓝法测定细胞活力;Griess法测定一氧化氮（NO）水平;实时荧光定量聚合酶链式反应测定白细胞介素（interleukin,IL）-6、IL-1β、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α、环氧合酶2（cyclooxygenase-2,COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）的基因相对表达量;流式细胞术测定细胞吞噬能力;蛋白免疫印迹法测定信号通路丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs）和核转录因子（nuclear factor,NF）-κB信号通路关键蛋白表达水平。结果：羊栖菜多酚对RAW264.7细胞的安全质量浓度范围为0～160 μg/mL。与LPS组相比,羊栖菜多酚剂量依赖性降低巨噬细胞吞噬能力并抑制NO的生成。同时,羊栖菜多酚下调促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和炎症诱导酶（iNOS、COX-2）的mRNA水平,且作用效果与给药剂量及LPS刺激时间相关。这些炎性介质的表达与羊栖菜多酚抑制p38 MAPK和NF-κB p65的激活有关。结论：羊栖菜多酚可通过减弱p38 MAPK和NF-κB p65信号通路的激活水平,抑制下游炎症介质的转录表达,从而缓解LPS诱导的巨噬细胞炎症反应。     

姬松茸多糖诱导巨噬细胞释放NO的机制

以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象,研究姬松茸多糖对其NO释放和iNOS表达的作用,并通过检测IκBα蛋白磷酸化水平的变化来探究姬松茸多糖诱导巨噬细胞释放NO的分子机制。结果表明,姬松茸多糖可剂量依赖性增强RAW264.7细胞NO的释放与iNOS蛋白的表达,且两者趋势一致。此外,25μg/mL姬松茸多糖能够增强RAW264.7细胞中p-IκBα蛋白的表达量,且在45min时达到最高,证明其能够激活NF-κB信号转导通路。综上,姬松茸多糖通过NF-κB途径上调巨噬细胞iNOS的表达,进而促进NO释放。     

黑灵芝多糖对S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞cAMP/PKA、IP_3/Ca~(2+)及DAG/PKC信号通路的影响

目的:探讨黑灵芝多糖(polysaccharide from Ganoderma atrum,PSG-1)对S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)/细胞蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)/Ca2+及甘油二酯(diacylglycerol,DAG)/蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)信号通路的影响。方法:将S-180细胞接种于BALB/c小鼠体内建立荷瘤小鼠模型,成模后收集腹腔巨噬细胞进行体外培养,用不同浓度的PSG-1干预;ELISA法分别检测巨噬细胞培养上清液中的IP3、DAG和AMP含量;流式细胞仪测定细胞内Ca2+含量;Western blotting测定细胞PKA及PKC蛋白表达。结果:PSG-1在20~160μg/mL质量浓度范围能促进S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞产生cAMP、IP3和DAG,同时能增加细胞内Ca2+含量,并显著增强PKA及PKC蛋白表达量。结论:PSG-1能有效激活S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞cAMP/PKA、IP3/Ca2+及DAG/PKC信号通路。由此推测,PSG-1可能通过cAMP/PKA、IP3/Ca2+及DAG/PKC信号通路促进S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞抗肿瘤作用。     

重组黑芝免疫调节蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7向M1型分化的影响

真菌免疫调节蛋白具有免疫调节和抗肿瘤功效。巨噬细胞在肿瘤免疫治疗中发挥重要的作用,M1型巨噬细胞具有很强的肿瘤杀伤能力和抗原递呈能力。本研究通过真菌免疫调节蛋白在体外对小鼠巨噬细胞RAW264.7经典活化M1型的影响探究其抗肿瘤的作用机制。利用重组黑芝免疫调节蛋白（recombinant Ganoderma atrum immunomodulatory protein,rFIP-gat）干预RAW264.7细胞,用中性红吞噬实验测定细胞吞噬能力,一氧化氮（nitric oxide,NO）检测试剂盒测定NO浓度,采用实时荧光定量聚合酶链式反应测定肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α,TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）的mRNA相对表达量。结果表明,rFIP-gat以剂量依赖的方式增强RAW264.7细胞的吞噬能力,促进其产生NO,并提高iNOS和TNF-α基因的转录。因此,rFIP-gat可能具有诱导RAW264.7细胞向M1型巨噬细胞分化的作用。     

硒化低聚氨基多糖对RAW264.7细胞的免疫调节作用

本实验旨在研究硒化低聚氨基多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫功能的影响。用噻唑蓝比色法分别考 察硒化低聚氨基多糖、Na2SeO3对巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响,并观察巨噬细胞形态的变化。通过中性红 法、酶联免疫吸附测定法及实时荧光定量反转录聚合酶链式反应法分别检测巨噬细胞的吞噬能力、肿瘤坏死因子 （tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素（interleukin,IL）-6及IL-10细胞因子的分泌量及其mRNA表达水平。 结果表明：硒质量浓度为100～1 000 μg/L时,硒化低聚氨基多糖对细胞的相对增殖率无显著影响;而Na2SeO3的硒 质量浓度超过200 μg/L即对巨噬细胞RAW264.7产生细胞毒性作用。硒化低聚氨基多糖能增强巨噬细胞吞噬活性, 显著提高RAW264.7细胞TNF-α、IL-6及IL-10分泌量及其mRNA表达水平,且效果比Na2SeO3处理组、低聚氨基多糖 处理组及Na2SeO3＋低聚氨基多糖复合添加组好。实验结果提示硒化低聚氨基多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7具有一 定的免疫调节作用。     

铁观音茶提取物对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症反应的抑制作用及机制

研究铁观音茶提取物对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症反应的抑制作用及机制。用脂多糖作用于RAW264.7细胞,建立炎症模型,并用吲哚美辛和不同浓度铁观音提取物处理,检测NO和IL-6的分泌情况,qPCR检测一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶2(COX-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素6(IL-6)mRNA相对表达,Western Blot检测炎症相关蛋白激酶(IKKβ),核转录因子κB抑制因子(IκB)、核转录因子κB p65(NF κB p65)及其磷酸化产物的相对表达。结果显示,铁观音茶提取物能显著抑制炎症介质NO分泌和IL-6蛋白表达量(p<0.05),抑制炎症相关基因iNOS、COX-2、TNF-α和MCP-1等表达,并极显著抑制NF-κB信号通路相关蛋白IKKβ、IkB和p65的磷酸化(p<0.01)。以上结果表明,铁观音茶提取物可明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应,其机制可能与抑制NF-κB信号通路激活有关。     

巴氏蘑菇多糖对巨噬细胞RAW264.7免疫活性的影响

探讨不同浓度巴氏蘑菇多糖(ABPS)对巨噬细胞RAW264.7免疫活性的影响。以ABPS作用巨噬细胞RAW264.7 12,24 h和36 h,采用MTT法检测巨噬细胞的增殖。以ABPS及脂多糖(LPS)作用巨噬细胞RAW264.7 24 h,分别收集细胞培养上清和细胞,提取全细胞蛋白,检测iNOS含量。细胞培养上清用来检测NO生成量。结果表明:ABPS对巨噬细胞RAW264.7作用12,24 h和36 h后,与空白对照组相比,一定浓度的ABPS均可促进巨噬细胞RAW264.7的增殖,差异极显著(P0.01)。不同浓度的ABPS和LPS作用巨噬细胞RAW264.7 24 h后,除ABPS质量浓度为250μg/m L时,iNOS生成量与阴性对照组无显著性差异外,其他浓度下iNOS及NO生成量均极显著高于阴性对照组(P0.01)。LPS作用后iNOS和NO的生成量极显著高于ABPS组(P0.01),其中ABPS质量浓度为1 mg/m L时,NO的生成量显著低于LPS组(P0.05)。在一定浓度范围内,iNOS及NO生成量与ABPS浓度存在剂量效应。当ABPS质量浓度为1 mg/m L时,二者生成量最高。ABPS能够促进巨噬细胞RAW264.7的增殖及其产生iNOS和NO,对其免疫活性起正向调节作用。