柚皮素通过PI3K/AKT/NF-κB通路抑制卵巢癌细胞增殖和侵袭、诱导凋亡作用的研究

目的:探究柚皮素（NAR）通过PI3K/AKT/NF-κB通路抑制卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的机制。方法:体外培养卵巢癌细胞,并分为空白组、低剂量柚皮素组、中剂量柚皮素组和高剂量柚皮素组;使用柚皮素预处理后,检测NAR对卵巢癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响情况;检测细胞侵袭迁移及凋亡相关蛋白和PI3K/AKT/NF-κB通路相关蛋白的表达情况。结果:使用柚皮素处理后,各组卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭受到显著抑制,凋亡受到显著促进,且对柚皮素呈剂量依赖性。相比空白组,使用柚皮素各组PCNA、Bcl-2、N-cadherin、MMP-9、MMP-2蛋白水平显著降低（P<0.01）,Bax、Caspase-3、E-cadherin、PI3K蛋白表达水平及AKT、p65磷酸化水平显著升高（P<0.01）,且随着柚皮素使用剂量的增加呈剂量依赖性,总AKT蛋白表达无显著变化（P>0.05）。结论:NAR可能通过抑制EMT及PI3K/AKT/NF-κB通路抑制卵巢癌细胞增殖和侵袭能力,并促进卵巢癌细胞的凋亡,在一定剂量范围内呈剂量依赖性。     

芍药苷通过PI3K/AKT/m-TOR信号途径抑制肥大细胞活化脱颗粒

目的: 研究芍药苷（paeoniflorin,Pae）对肥大细胞（P815）活化及脱颗粒的影响,并探索其作用机制。方法: CCK-8法评价Pae的细胞毒性,ELISA法及显色法测定Pae对P815释放组胺和β-氨基己糖苷酶（β-HEX）及IL-1β、IL-4、IL-8、IL-12的影响。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测上述炎症因子及蛋白酶激活受体（PARs）在mRNA水平上的表达。Western blot测定磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、哺乳动物雷帕霉素靶体蛋白（m-TOR）的磷酸化水平。结果: 当芍药苷的浓度为1,10,100 μg/mL时对P815无毒性,且能有效抑制组胺、β-HEX的释放及IL-1β、IL-4、IL-8、IL-12的分泌,并降低PARs的表达。Western blot显示,Pae能抑制PI3K、AKT、m-TOR的磷酸化。结论: Pae可能通过抑制PI3K/AKT/m-TOR信号通路实现对肥大细胞活化及脱颗粒的抑制作用。     

PI3K/Akt/FOXO3a信号通路介导的保护性自噬参与肺腺癌获得性顺铂耐药表型重塑

目的：比较顺铂压力下人肺腺癌亲本A549细胞与获得性顺铂耐药表型的A549/DDP细胞自噬水平,探寻肿瘤细胞获得性耐药表型重塑的分子机制。方法：不同浓度顺铂（cisplatin, DDP）干预亲本A549细胞及获得性顺铂耐药表型的A549/DDP细胞,应用CCK-8法比较两株细胞耐药指数、免疫印迹法比较自噬相关蛋白（Beclin 1、LC3Ⅱ及p62）表达水平;应用10 μmol/L顺铂（相当于亲本A549细胞半数抑制浓度,即A549 IC50值）干预A549及A549/DDP细胞,构建细胞应激状态,CCK-8法比较两株细胞生存活力,免疫印迹法比较自噬相关蛋白（Beclin 1、LC3Ⅱ及p62）、凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3）、转录因子FOXO3a及其磷酸化蛋白（p-FOXO3a）表达水平,免疫荧光法观察FOXO3a亚细胞定位,并利用自噬晚期抑制剂巴弗洛霉素A1（Baf A1）干预A549及A549/DDP细胞,进一步验证顺铂压力下细胞自噬激活情况;利用蛋白激酶抑制剂干预PI3K/Akt信号通路,免疫印迹法检测顺铂压力下A549及A549/DDP细胞Akt、p-Akt及自噬相关蛋白表达水平,以探寻肿瘤细胞获得性耐药表型重塑的分子机制。结果：与亲本A549细胞相比,获得性顺铂耐药表型的A549/DDP细胞具有更强的顺铂耐药性及较高的基础自噬水平。在10 μmol/L顺铂压力下,A549/DDP细胞存活率明显高于A549细胞;A549细胞中,顺铂通过抑制PI3K/Akt/FOXO3a信号通路,上调转录因子FOXO3a表达水平,下调Bcl-2表达、促进Bax及Cleaved Caspase-3活性片段表达增加,诱导细胞凋亡;A549/DDP细胞中,相同浓度的顺铂通过抑制PI3K/Akt/FOXO3a信号通路,抑制FOXO3a磷酸化,上调Beclin 1及LC3Ⅱ表达、下调p62表达,促进细胞保护性自噬,使耐药细胞获得生存活性。 结论：顺铂诱导亲本A549细胞凋亡可能与抑制PI3K/Akt/FOXO3a信号通路,上调转录因子FOXO3a表达有关;A549/DDP细胞顺铂耐药表型的获得可能与顺铂抑制PI3K/Akt/FOXO3a信号通路,抑制FOXO3a磷酸化,上调细胞保护性自噬相关。     

桑黄多糖调控PI3K/AKT/mTOR通路抑制肝癌腹水荷瘤小鼠及对化疗的减毒增效作用

目的:研究桑黄多糖通过调控PI3K/AKT/mTOR通路对肝癌腹水荷瘤小鼠化疗的增效减毒作用。方法:SPF级雄性昆明种小鼠90只，随机分为正常组、模型组、环磷酰胺组、桑黄多糖组及桑黄多糖+环磷酰胺组。制备肝癌腹水荷瘤小鼠，各给药组分别给予30 mg/kg的环磷酰胺或（和）200 mg/kg的桑黄多糖，灌胃给药。正常组及模型组灌胃10 mL/kg的生理盐水。观察小鼠抑瘤率、肝脏、脾脏等指数、肿瘤组织内VEGF与炎性因子含量、PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达。结果:环磷酰胺组、桑黄多糖组及桑黄多糖+环磷酰胺组小鼠体质量、瘤体质量、肿瘤组织内血管内皮生长因子（VEGF）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素（IL）-6、PI3K、AKT及mTOR磷酸化水平均低于模型组，IL-1β水平高于模型组；桑黄多糖+环磷酰胺组小鼠体质量、抑瘤率、肿瘤组织内VEGF、TNF-α、IL-6、PI3K、AKT及mTOR磷酸化水平高于桑黄多糖组及环磷酰胺组，瘤体质量及IL-1β水平低于桑黄多糖组及环磷酰胺组(P<0.05)。结论:桑黄多糖联合环磷酰胺可有效抑制肝癌腹水荷瘤小鼠肿瘤的增殖，发挥减毒增效作用，其机制可能与下调PI3K/AKT/mTOR通路的表达有关。     

PI3K/AKT/mTOR信号通路对甘氨鹅脱氧胆酸钠诱导的肝细胞凋亡的机制研究

目的: 探讨PI3K/AKT/mTOR信号通路对甘氨鹅脱氧胆酸钠（GCDC）诱导的人肝正常细胞HL-7702增殖、凋亡的影响。方法: 将HL-7702细胞分为对照组、GCDC组（1 mmol/L的GCDC预处理细胞4 h）、GCDC+LY294002组（GCDC处理细胞4 h后,使用15 μmol/L的LY294002处理细胞24 h）和GCDC+IGF-1组（GCDC处理细胞4 h后,使用20 nmol/L的IGF-1处理细胞24 h）。处理结束后,通过Western blot检测PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、Bcl-2、Bax和Nrf2蛋白表达;MTT法及Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞增殖和凋亡率;DCFH-DA探针法检测细胞活性氧（ROS）含量。结果: GCDC可明显下调HL-7702细胞PI3K、p-AKT、p-mTOR、Bcl-2和Nrf2表达,上调Bax表达,抑制细胞增殖,诱导凋亡,诱导细胞ROS产生（P<0.05）,LY294002可增强GCDC对HL-7702细胞增殖、凋亡、ROS水平及PI3K、p-AKT、p-mTOR、Bcl-2、Bax和Nrf2表达影响,IGF-1反之。结论: 激活PI3K/AKT/mTOR信号通路可改善胆汁性肝纤维化,机制可能与抗凋亡和抗氧化有关。     

ERK1/2和p38MAPK在介导CGRP和Ang II诱导血管平滑肌细胞Nox1表达中的作用

目的:探讨胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2) 和p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)在降钙素基因相关肽（CGRP）和血管紧张素II(Ang II) 诱导血管平滑肌细胞NADPH氧化酶-1（Nox1）表达中的作用。方法: 体外培养鼠源性A10血管平滑肌细胞株（A10VSMC）,用Ang II或/和CGRP作为处理因素,MTT法检测细胞增殖活力;流式细胞术检测细胞周期分布;Western blot检测ERK1/2和p38MAPK总蛋白和磷酸化蛋白以及Nox1蛋白的表达水平。结果: 与对照组和CGRP组相比,Ang II在诱导A10VSMC活力和增殖的同时,亦能增加磷酸化ERK1/2和p38MAPK信号激酶和Nox1的表达。CGRP预孵育细胞30 min 却能显著抑制Ang II诱导的细胞增殖活力、Nox1蛋白、磷酸化ERK1/2和p38MAPK的表达;二苯基碘（DPI）能抑制Ang II诱导的细胞增殖、磷酸化p38MAPK及Nox1表达,但不能抑制Ang II诱导的ERK1/2磷酸化。p38MAPK阻断剂SB203580不但能抵消Ang II诱导的Nox1表达作用,而且能协同CGRP抑制Ang II诱导的Nox1表达。而ERK1/2阻断剂PD98059对CGRP和/或Ang II诱导Nox1表达作用的影响无统计学意义。结论:Ang II诱导A10VSMC增殖与激活Nox1有关,CGRP抑制Ang II诱导的Nox1表达,可能主要通过抑制p38MAPK信号途径发挥作用,而与ERK1/2信号途径无显著关系。     

联用芝麻素和维生素E抑制PI3K/AKT信号通路改善自发性高血压大鼠的左室纤维化

目的：观察芝麻素（Ses）和维生素E（VitE）联用对自发性高血压大鼠（SHRs）左心室纤维化的影响，并探讨其可能机制。方法：14周龄雄性SHRs随机分为Ses和VitE联用组（160+10 mg·kg-1·d-1、Ses组（160 mg·kg-1·d-1）、VitE组（10 mg·kg-1·d-1）及SHRs组，另设正常对照WKY组，每组7只，1次/d持续灌胃给药10周。采用尾袖法测定大鼠给药前和给药10周后的收缩压。末次给药后取左心室，计算脏器指数，Masson染色观察胶原沉积，分析心肌胶原容积分数（CVF），Western blot 观察Ⅰ型胶原（collagenⅠ）、Ⅲ型胶原（collagen Ⅲ）、转化生长因子β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、蛋白激酶B（AKT）和磷酸肌醇3激酶（PI3K）蛋白的表达。结果：SHRs+Ses+VitE组的收缩压、HW/BW、LVW/HW、CVF明显下降，且下降幅度分别高于SHRs+Ses和SHRs+VitE组（P<0.01或P<0.05）。SHRs+Ses+VitE组的collagenⅠ、collagen Ⅲ、TGF-β1、CTGF、MMP-9、TIMP-1、p-AKT和PI3K蛋白表达明显下降，且下降幅度分别高于SHRs+Ses和SHRs+VitE组（P<0.01或P<0.05）。 结论：联用芝麻素和维生素E通过抑制AKT/PI3K信号通路的激活，减少TGF-β1、CTGF、MMP-9及TIMP-1表达，从而发挥降压和改善左心室纤维化的作用。     

三叶青总黄酮逆转吉非替尼耐药肺腺癌细胞的耐药性

目的：探讨三叶青总黄酮（FTH）逆转吉非替尼（GEF）耐药肺腺癌细胞的耐药性及其初步机制。方法：采用MTT法,检测FTH对GEF耐药A549/GR细胞增殖的影响;采用流式细胞技术检测FTH对A549/GR细胞凋亡及周期的影响;建立A549/GR细胞荷瘤小鼠模型,观察两药联用后的体内抑瘤效果;采用Western blot法检测瘤组织PI3K/Akt信号通路关键蛋白（PTEN、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT）的表达情况。结果：与单用GEF相比,FTH联合GEF给药可显著抑制A549/GR细胞增殖（P<0.05）,诱导A549/GR细胞凋亡（P<0.05）,使细胞停滞在G0/G1期。体内实验结果表明,两者联合可显著抑制裸鼠A549/GR移植瘤的生长（P<0.05）,并显著降低瘤组织p-PI3K和p-AKT表达（P<0.05）,升高PTEN蛋白表达（P<0.05）。 结论：FTH可逆转A549/GR细胞对GEF的耐药性,其作用机制可能与调控PTEN/PI3K/AKT通路有关。     

柚皮素对K562/A02细胞MDR1 mRNA/P gp的影响及机制研究

目的: 研究柚皮素对MDR1 mRNA与P-糖蛋白（P-gp）表达的影响及其分子生物学机制。方法: 将不同浓度的柚皮素（50、100、250、500 μmol/L）单独或联合阿霉素 （5 μmol/L）作用于K562/A02细胞48 h,RT-PCR法检测MDR1 mRNA的表达水平,Western-blot法检测P-gp的表达水平,并以NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）为对照,比较柚皮素与PDTC间的差异。结果: 系列浓度柚皮素作用于K562/A02细胞48 h后能显著抑制MDR1 mRNA（IC50=460.3 μmol/L）及P-gp的表达 （IC₅₀=286.3 μmol/L）,抑制作用随浓度的增加而增强;无毒剂量的柚皮素抑制强度与PDTC相近（P＞0.05）;经阿霉素诱导后二者抑制效应仍然相仿（P＞0.05）。结论: 柚皮素明显抑制K562/A02细胞MDR1 mRNA及P-gp的表达,可能与PDTC的作用机制相同,即限制IκB-α磷酸化,阻抑NF-κB的活化,从而抑制MDR1的转录,导致MDR1 mRNA及P-gp的表达量下调,最终使得药物外排转运效应下降。     

南赤瓟醇提物通过PI3K/Akt/mTOR信号通路促进人宫颈癌Caski细胞凋亡

目的: 研究南赤瓟醇提物影响PI3K/Akt/mTOR信号通路促进人宫颈癌Caski细胞凋亡的作用机制。方法: 用南赤瓟醇提物(0.062 5、0.125、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/mL)作用Caski细胞 24 h 后,检测其对细胞增殖的影响;然后用南赤瓟醇提物(0.25、0.50 和 1.00 mg/mL)作用Caski细胞 24 h 后,流式细胞术测定细胞周期DNA含量及亚G₁凋亡峰,ELISA试剂盒检测Caski细胞中Caspase-9和Caspase-3活性及线粒体和胞浆中细胞色素C（Cyt C）含量,Real-time PCR测定P53、Bcl 2和Bax mRNA表达,并计算Bcl-2/Bax比值,Western blot测定PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平(p-PI3K、p-Akt、p-mTOR),并计算p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值。结果: 南赤瓟醇提物对Caski细胞生长抑制作用呈明显的剂量依赖性;南赤瓟醇提物(0.25、0.50 和1.00 mg/mL)能显著抑制Caski细胞增殖,并将其阻滞于G₂/M期;可抑制p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平,降低p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值;上调P53和Bax mRNA表达,下调Bcl-2 mRNA及Bcl-2与Bax比值;降低线粒体中Cyt C含量,升高胞浆中Cyt C含量;增强Caspase-9和Caspase-3活性(P<0.05, P<0.01)。结论: 南赤瓟醇提物诱导Caski细胞凋亡的作用机制与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路磷酸化有关。     

PI3K/AKT/GSK3β信号通路参与腺苷A1R介导异丙酚对缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用

目的：探讨PI3K/AKT/GSK-3β信号通路参与异丙酚对缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及机制。方法：健康雄性SD大鼠72只，所有大鼠参照Zea Longa法建立局灶性脑缺血再灌注损伤的模型。随机分成6组（n=12），A-假手术组，B-模型组（MCAO），C-异丙酚组，D-异丙酚+腺苷A1R拮抗剂组（DPCPX），E-异丙酚组+PI3K特异性抑制剂（LY294002），F-异丙酚+GSK-3β抑制剂组（SB216763），观察大鼠术后24 h神经功能评分情况；LDF监测插栓前后脑血流变化；采用TTC染色法检测各组大鼠的脑梗死体积；用HE染色方法观察大鼠脑组织形态学改变；免疫组织化学法检测Bcl-2阳性细胞表达；采用TUNEL检测各组大脑脑皮质缺血周围神经元凋亡细胞的百分率。结果：与A组比较，B、C、D、E及F组大鼠行为学、脑梗死体积、细胞凋亡率、Bcl-2蛋白表达量均增加（P<0.05）；与C组比较，B、D、E组大鼠行为学评分，脑梗死体积及细胞凋亡率均明显增加，Bcl-2蛋白表达量均明显减少（P<0.01），F组Bcl-2蛋白表达量却增加，细胞凋亡率降低（P<0.05），行为学评分减少、梗死体积减少（P<0.05）。 结论：腺苷A1R介导的异丙酚对缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用可能与PI3K/AKT/GSK-3β信号转导通路有关。     

车前子提取物通过调控PI3K/AKT通路改善糖尿病大鼠神经源性膀胱病的作用研究

目的:探讨车前子提取物对糖尿病大鼠神经源性膀胱病的改善作用以及对PI3K/AKT通路的影响。方法:选取50只7周龄的SD大鼠,随机分为5组：对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组10只,非对照组的4组进行糖尿病神经源性膀胱病的造模,观察4周,记录血糖、食量、尿量、饮水量、体质量等变化。造模完成后,低、中、高剂量组分别接受由低到高相应浓度为0.1、0.4、1.6 mg/mL的车前子提取物进行治疗,观察第5到第9周的血糖变化,第8和第9周的代谢以及第9周尿动力学指标的变化。荧光定量PCR和Western blot法检测PI3K/AKT通路相关基因的表达情况。结果:与对照组相比,模型组从造模后第1周开始血糖含量高于对照组（P<0.05）,随后的3周血糖含量仍然高于对照组（P<0.05）。在第3周和第4周模型组的食量、饮水量和尿量均高于对照组（P<0.05）,体质量从第1周开始低于对照组（P<0.05）。第9周的时候中、高剂量组的血糖水平恢复到正常水平,与对照组比较无统计学差异（P>0.05）,高剂量组在食量、饮水量、尿量以及尿动力学方面已趋近于正常水平,与对照组比较无统计学差异（P>0.05）。与对照组相比,模型组、低剂量组和中剂量组的PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT的表达量均较低（P<0.05）,高剂量组与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。结论:一定剂量的车前子提取物可以调节PI3K/AKT通路中相关因子的表达,对糖尿病大鼠神经源性膀胱病有明显的改善作用。     

多维度碳纳米相增强铝基复合材料研究进展

目的: 研究微小RNA（miR-136）通过靶向CD163抑制CD68+M0巨噬细胞向CD68+CD163+M2巨噬细胞极化的作用机制。方法: 采用流式细胞术检测20例肝细胞肝癌患者肿瘤组织及癌旁组织中CD68+CD163+M2巨噬细胞的比例,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测肿瘤及癌旁组织中miR-136的水平。分离人脾脏中CD68+M0巨噬细胞,将细胞分为对照组（Control）,miRNA模拟物组（miRNA mimic）和miRNA抑制物组（miRNA inhibitor）。IL-4和IL-13 10 ng/mL诱导巨噬细胞M2型极化。采用流式细胞术检测CD68+CD163+M2巨噬细胞比例,Western blot检测细胞中CD163、TNF-α、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达以及M2巨噬细胞标志物精氨酸酶（Arg1）的表达,机制研究中检测JAK/STAT信号中蛋白酪氨酸激酶1（JAK1）、信号转导子与转录激活子1（STAT1）和STAT6的水平,PI3K/AKT信号中磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）的表达。荧光素酶报告基因法确定miR-136与CD163的靶向关系。结果: 肝癌组织中M2型巨噬细胞比例显著高于癌旁组织,而miR-136的表达显著低于癌旁组织,两者表达具有负相关。荧光素酶报告基因结果显示CD163是miR-136的靶基因。miRNA mimic组中CD68+CD163+M2巨噬细胞比例显著低于miRNA inhibitor组,与Control组比较无统计学差异。机制检测中发现miRNA mimic中JAK1、STAT6、PI3K、AKT1低表达,说明miR-136可以间接抑制JAK1-STAT6以及PI3K-AKT1的表达,抑制M2巨噬细胞极化。结论: miR-136可以靶向CD163抑制M2型巨噬细胞极化,其作用机制与JAK1-STAT6以及PI3K-AKT1抑制有关,这是M2巨噬细胞在肝癌免疫中的调节机制之一。