胞外酸化对体外培养大鼠关节软骨细胞增殖与凋亡及组织蛋白酶K mRNA表达的影响

目的: 探讨不同胞外pH环境对体外培养的大鼠关节软骨细胞增殖、凋亡的影响,以及大鼠关节软骨细胞中组织蛋白酶K的表达与胞外酸化的关系。方法: Ⅱ型胶原酶消化法从大鼠关节软骨中分离软骨细胞;细胞传代培养后分为4组分别在pH7.4、pH6.5、pH6.0、pH5.5不同的胞外酸化环境下培养3 h,MTT法检测软骨细胞活力,Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态,Annexin-V/PI双染法检测软骨细胞的凋亡率,实时荧光定量PCR检测组织蛋白酶K基因的表达。结果: 与pH7.4 组比较其他各组软骨细胞增殖均受到抑制,其中pH5.5、pH6.0与pH7.4相比差异有重要的统计学意义(P<0.01),pH5.5和pH6.0组可见较多的凋亡细胞,且流式细胞仪检测的凋亡率明显高于pH7.4组(P<0.01);组织蛋白酶K的表达与酸性程度成正相关。结论: 胞外酸化环境下能明显抑制体外培养软骨细胞增殖、促进软骨细胞凋亡,并且酸性环境能增加组织蛋白酶K的表达,这为类风湿关节炎中关节软骨的破坏发生机制提供了实验依据。     

鬼针草总黄酮对急性炎症的保护作用及可能机制研究

目的: 研究鬼针草总黄酮(TFB)对急性炎症的保护作用与可能机制。方法: 二甲苯诱导急性小鼠耳肿胀,检测耳肿胀度和血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8含量;氟氏完全佐剂诱导佐剂性关节炎(AA)大鼠原发性炎症,检测足肿胀度和血清TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8含量,HE染色观察炎症关节病理学变化,免疫组织化学法检测关节软骨组织ASIC1a蛋白。结果: 小鼠急性耳肿胀和AA大鼠原发性炎症中,模型组动物血清TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8含量均明显升高,TFB(100、200 mg/kg) 灌胃给药能降低小鼠耳肿胀度和血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8含量,TFB(67、133 mg/kg)可以升高AA大鼠血清IL-2的含量。TFB灌胃给药可以使AA大鼠关节炎性细胞减少,改善病理变化。在AA大鼠原发性炎症中模型组大鼠关节软骨组织ASIC1a表达明显升高,TFB(67、133 mg/kg)组ASIC1a的表达明显降低。相关性分析结果显示,AA大鼠原发性炎症中ASIC1a与血清TNF-α、IL-1、IL-8含量呈正相关。结论: TFB对急性炎症具有保护作用,其抗炎机制可能与调节炎症介质释放有关。     

几种抗类风湿性关节炎药物对佐剂性关节炎大鼠关节软骨细胞酸敏感离子通道的表达影响及作用

目的:观察几种抗类风湿性关节炎(RA)药物对佐剂性关节炎(AA)大鼠关节软骨中的酸敏感离子通道(ASICs)表达的影响, 探讨抗RA药物对关节软骨的保护作用。方法:将大鼠随机分成正常组、AA模型组、阿司匹林(50 mg/kg)组、地塞米松(0.2 mg/kg)组、雷公藤多苷(50 mg/kg)组和左旋咪唑(10 mg/kg)组。弗氏完全佐剂(CFA)致炎后第10天起,AA大鼠出现继发性炎症, 此时地塞米松组腹腔注射地塞米松, 其它用药组分别灌胃相应的受试药物, 正常组与模型组灌胃等容量的无菌注射用水, 连续7d。实验结束后, 光学显微镜观察关节病理变化;用半定量RT-PCR和Western blotting分析常用药物对AA大鼠关节软骨细胞中ASICs表达的影响;用半定量RT-PCR方法分析常用药物对AA大鼠关节软骨中的蛋白聚糖体(aggregate proteoglycan, aggrecan)表达的影响;免疫组织化学技术检测常用药物对AA大鼠关节软骨中的Ⅱ型胶原蛋白合成的影响。结果:经过治疗后, 各用药组能明显抑制AA大鼠的继发性足肿胀。阿司匹林能显著抑制AA大鼠关节软骨细胞ASICs的表达, 其它用药组对ASICs无明显抑制作用。各用药组能明显升高AA大鼠关节软骨细胞基质成分Ⅱ型胶原和aggrecan表达量, 其中阿司匹林作用显著。结论:阿司匹林可能通过抑制ASICs的表达而抑制AA大鼠关节软骨的破坏。     

C2-神经酰胺诱导大鼠脑胶质瘤细胞C6 的早期凋亡作用

目的: 研究外源性C2-神经酰胺对大鼠脑胶质瘤细胞C6活力的抑制作用以及早期凋亡诱导作用。方法: 采用MTT 法测定C2-神经酰胺对C6 细胞活力的影响;倒置荧光显微系统观察细胞形态变化;AnnexinⅤ PI 双染色流式细胞术对细胞早期凋亡进行定量分析。结果: C2-神经酰胺可显著抑制C6 细胞的活力, IC₅₀为2.2×10^-5 mol·L^-1;荧光染色可见核浓染等细胞凋亡特征形态改变;流式细胞术分析表明C2-神经酰胺可诱导C6 细胞发生早期凋亡作用,且凋亡百分率呈时间及浓度依赖性, C2-神经酰胺2×10^-5 mol·L^-1处理24 h 后平均早期凋亡率高达49.3 %。结论: C2-神经酰胺主要通过诱导早期细胞凋亡对大鼠脑胶质瘤C6 细胞发挥细胞毒作用, 提高神经酰胺水平有望成为肿瘤化疗的新途径。     

灯盏乙素抑制过氧化氢诱导PC12 细胞凋亡及机制

目的 观察灯盏乙素对过氧化氢(H2O2) 诱导PC12 细胞凋亡的抑制作用及其作用机制。 方法 采用H2O2 诱导PC12 细胞凋亡模型, 用碘化丙啶(PI) 单染和PI Annexin V 双染检测细胞凋亡, 用DNA 琼脂糖凝胶电泳观察DNA 断裂, 并采用RTPCR检测Bcl-2 mRNA 表达、荧光光度法检测caspase-3 活性。 结果 灯盏乙素可以抑制H2O2 诱导的膜磷脂酰丝氨酸外翻, 增加Bcl-2 mRNA 表达, 减小caspase-3 活性, 并降低DNA 片段化和细胞凋亡率。 结论 灯盏乙素显著抑制H2O2 诱导的细胞凋亡, 其抗细胞凋亡作用可能与其增加Bcl-2表达、抑制caspase-3 活化有关。     

酸性条件下神经生长因子对大鼠关节软骨细胞酸敏感离子通道1a表达的影响

目的: pH6.0培养条件下观察神经生长因子（NGF）对大鼠关节软骨细胞酸敏感离子通道1a（ASIC1a）基因和蛋白表达的调控作用及其机制。方法: 体外提取培养原代大鼠膝关节软骨细胞,酸性环境下观察细胞NGF高亲和力受体Trk-A的表达情况;不同浓度NGF刺激观察ASIC1a的表达变化;10 ng/mL NGF刺激不同时间胞外信号调节激酶（ERK1/2）及c-fos磷酸化的时效关系,阻断ERK1/2（PD98059 30 μmol/L）后观察c-fos磷酸化水平和ASIC1a的表达;RT-PCR检测ASIC1a基因的表达,Western Blot检测Trk-A、ASIC1a、ERK1/2、pc-fos蛋白的表达。结果: 在酸性环境下NGF的高亲和力受体Trk-A表达比正常环境可高出3倍,ASIC1a的表达随着NGF的浓度升高而升高,10 ng/mL 时趋于稳定;NGF刺激后,ERK1/2及c-fos活化增强,4 h 达到最大水平;阻断了ERK1/2之后,p-c-fos和ASIC1a蛋白表达下降,差异具有显著性(P<0.01)。结论: 在酸性环境下,NGF促进了大鼠关节软骨细胞ASIC1a表达的上调,并且ERK1/2信号通路的活化可能参与了这一过程。     

抗氧化作用可能是人参皂甙Rg1 抗细胞凋亡的机制1

目的 探讨人参皂甙Rg1 对MPP⁺诱导SHSY5Y 细胞凋亡的保护作用及其可能的机制。 方法 用吖啶橙溴化乙锭染色观察SHSY5Y 细胞凋亡率, 流式细胞仪检测线粒体跨膜电位及细胞内活性氧(ROS) 水平, Western Blot 法检测bcl-2、bax 蛋白表达水平。 结果 经10 μmol·L^-1 Rg1 预处理后,MPP⁺诱导的SHSY5Y 细胞凋亡受到明显的抑制, 虽然线粒体跨膜电位无明显改变, 但细胞内ROS 下降, 而bcl-2 蛋白表达水平增加, bax 蛋白表达水平减少。 结论 Rg1 可抑制MPP⁺诱导的SHSY5Y 细胞凋亡,其作用机制可能是通过清除ROS、调节bcl-2、bax 蛋白表达水平起作用。     

pFLAG-AMPKα2真核表达质粒构建及对心肌缺氧/复氧损伤的作用

目的: 构建大鼠pFLAG-AMPKα2真核表达质粒,分析AMPKα2过表达对心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。方法: 提取H9c2心肌样细胞的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增AMPKα2基因的cDNA全长,并将其克隆至pFLAG-CMV-4构建pFLAG- AMPKα2重组质粒。转染pFLAG-AMPKα2至H9c2细胞,Western Blot测定AMPKα2的蛋白表达情况,建立缺氧/复氧(A/R)损伤模型,MTT法检测心肌细胞的存活率,生物自动分析仪检测LDH活性,流式细胞术检测各实验组心肌细胞凋亡程度、细胞内ROS的变化,试剂盒检测细胞内抗氧化酶(SOD、GSH-Px)活性。结果: AMPKα2全长基因序列克隆至真核表达载体pFLAG-CMV-4,酶切鉴定片段大小为1700 bp,Western blot检测转染pFLAG-AMPKα2后,AMPKα2蛋白在H9c2细胞中高表达。H9c2细胞遭受A/R损伤,心肌细胞存活率下降,LDH活性增加,细胞凋亡加重,ROS生成增加,SOD及GSH-Px的酶活性下降,pFLAG-AMPKα2重组质粒的导入可明显逆转、改善上述各项指标,从而对抗A/R损伤。结论: 构建成功的pFlAG- AMPKα2重组质粒能对抗A/R所致的心肌细胞损伤,其机制与改善心肌细胞的氧化应激作用有关。     

天麻素通过抑制细胞凋亡保护谷氨酸诱导的PC12细胞损伤

目的: 研究天麻素(Gastrodin)对谷氨酸诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞损伤的影响及可能机制。方法: 以谷氨酸建立体外培养PC12细胞损伤模型并采用MTT比色法测定细胞存活率;AO/EB双染法经荧光显微镜观察细胞凋亡形态;采用流式细胞术检测细胞内活性氧含量以及Annexin V/PI染色后的细胞凋亡率;Western blot法检测细胞内Caspase-3蛋白表达。结果: 天麻素可明显抑制谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡,在 0.1~10 μmol/L 剂量呈一定的量效关系;同时,天麻素可明显抑制谷氨酸引起的活性氧(ROS)的累积,降低谷氨酸诱导的活性Caspase-3蛋白的表达,降低PC12细胞的凋亡率,在 0.1~10 μmol/L 剂量呈量效相关性。结论: 在一定剂量范围内,天麻素对谷氨酸损伤的PC12细胞具有保护作用,其机制可能与减少ROS的生成,阻止氧化损伤的发生,抑制Caspase-3途径依赖的细胞凋亡相关。     

青蒿琥酯诱导肿瘤细胞凋亡与抑制存活蛋白表达有关

目的 探讨青蒿琥酯(artesunate, Art)诱导肿瘤细胞凋亡与存活蛋白(survivin protein)表达的关系。 方法 采用细胞荧光染色、流式细胞术、琼脂糖凝胶电泳法和测定细胞浆Caspase-3 的活性等手段检测肿瘤细胞暴露于不同浓度的Art 时, 对肿瘤细胞凋亡的诱导作用;用RT-PCR、Western Blotting 法,检测不同浓度的Art 作用于肿瘤细胞时, 对survivinmRNA 和survivin 蛋白表达的影响。 结果 HL60 细胞暴露于Art 时, 呈现典型细胞凋亡特征, 如:胞核固缩、形成凋亡小体;凋亡细胞的比例呈浓度依赖性增高;琼脂糖电泳出现明显的“ 梯状” 条带;细胞浆Caspase-3 的活性呈浓度依赖性增高等。RT-PCR 检测表明, A549 细胞暴露于Art 10 和50 g·L^-1 72 h后, survivin mRNA 的表达呈浓度依赖性降低, 对照组、10 和50 mg·L^-1 处理组的survivin 条带和内标GAPDH 条带灰度的比值分别为1.745、0.390 和0.023;Western Blotting 法也检测到Art 抑制Survivin蛋白的表达。 结论 Art诱导肿瘤细胞发生凋亡, 激活Caspase-3 途径, 可能与抑制survivin 基因表达有关。     

生存素反义寡核苷酸诱导HL-60 细胞凋亡的实验研究

目的: 探讨特异性靶向生存素的反义寡核苷酸(ASODN) 对急性早幼粒细胞系HL-60 细胞凋亡的影响。方法: 应用四唑盐(MTT) 比色法分析细胞增殖;倒置显微镜观察细胞形态学变化;原位末端标记(TUNEL) 法检测细胞凋亡指数(AI);流式细胞术(FCM) 定量检测细胞凋亡;RT-PCR 半定量检测生存素mRNA 的表达。结果: 5～20 μmol·L^-1生存素ASODN 对HL-60 细胞增殖均有抑制作用, 且呈时间和剂量依赖性。ASODN 组凋亡率和生存素基因表达抑制率明显高于对照组。结论: 生存素ASODN 能有效抑制HL-60 细胞生存素mRNA 的表达并诱导细胞凋亡, 表明生存素对维持肿瘤细胞的增殖具有非常重要的作用。     

巨噬细胞移动抑制因子siRNA对肺泡上皮细胞Toll样受体及其下游信号转导通路的影响

目的: 研究巨噬细胞移动抑制因子siRNA对脂多糖刺激的肺泡上皮细胞Toll样受体(TLR)及其下游信号转导通路的影响和作用机制。方法: 用LPS刺激A549细胞,脂质体法分别将巨噬细胞移动抑制因子(MIF) siRNA和非特异性siRNA加入A549细胞进行干预。RT-PCR法检测MIF和TLR2、TLR4 mRNA的表达,Western Blot法分析TLR下游信号转导通路元件髓样分化因子88(MyD88)和干扰素调节因子3(IRF3)蛋白表达,细胞免疫荧光法观察NF-κB核迁移,ELISA法测定细胞培养上清炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6,免疫介质IFN-β分泌水平。结果: MIF siRNA对LPS刺激诱导的MIF和TLR2、TLR4 mRNA高表达有显著的下调作用和部分阻断NF-κB(p65)核迁移。LPS刺激诱导后,MIF siRNA显著降低MyD88蛋白表达和炎症介质TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平,但MIF siRNA对IRF3蛋白表达和免疫介质IFN-β分泌水平无影响。结论: MIF siRNA能抑制A549细胞的炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6过度分泌,其机制可能是MIF siRNA降低了LPS刺激A549细胞诱导的MIF和TLR2、TLR4高表达,及阻断TLR下游信号转导通路元件MyD88和NF-κB核迁移。     

珠子参总皂苷对H2O2诱导新生大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用

目的: 观察珠子参总皂苷对H₂O₂诱导新生大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用,并探讨其作用机制。方法: Wistar乳鼠心肌细胞原代培养,用H₂O₂建立氧化应激损伤模型,然后用珠子参总皂苷(100, 200 μg/mL)孵育 24 h后,MTT法检测珠子参总皂苷对细胞活力的影响,流式细胞仪和Hoechst33258染色检测珠子参总皂苷对氧化应激诱导细胞凋亡及胞内ROS含量的影响,比色法测定心肌细胞Caspase-3、Caspase-9的活性,荧光定量PCR测定心肌细胞Bcl-2和Bax mRNA表达,并计算Bcl-2与Bax的比值。结果: 珠子参总皂苷(100, 200 μg/mL)能显著改善心肌细胞活性,有效保护线粒体膜电位的稳定,抑制心肌细胞凋亡和改善细胞形态,降低细胞内活性氧(ROS)含量;下调Bax mRNA表达,上调Bcl-2 mRNA表达及Bcl-2与Bax的比值;降低H₂O₂所致新生大鼠心肌细胞中Caspase-3、Caspase-9的活性。结论: 珠子参总皂苷对H₂O₂诱导心肌细胞凋亡有显著的抑制作用,其机制可能与其稳定心肌细胞膜、清除ROS及调节心肌细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3、Caspase-9表达有关。     

脱氢表雄酮对大鼠骨关节炎影响的实验研究

目的:;研究脱氢表雄酮(DHEA)对大鼠实验性骨关节炎(OA)的影响。方法: 40 只大鼠随机分4组:正常对照组、模型对照组、DHEA 大、小剂量组。除正常对照组外,其余3组右膝木瓜蛋白酶关节腔注射法建立OA 模型。然后DHEA 大、小剂量组两组右膝分别关节腔注射50 μmol· L^-1 和100μmol·L^-1 的DHEA 溶液150 μl,正常对照组、模型对照组两组右膝均注入生理盐水150 μl,每周2 次,注射5周。6周后处死大鼠,大体形态学、组织学、生化及免疫组化的方法评价关节软骨情况。结果: 手术显微镜下观察,见DHEA 大、小剂量组两组软骨损害均较模型对照组明显减轻。DHEA 大、小剂量组Mankin's评分、关节腔冲洗液一氧化氮含量、滑膜丙二醛含量及关节软骨基质金属蛋白酶,1和9的表达均较模型对照、组显著降低, DHEA 大剂量组上述指标均较DHEA 小剂量组显著降低。且两组关节腔冲洗液和血清超氧化物歧化酶活性均较模型对照组显著升高, DHEA 大剂量组上述指标升高均较DHEA小剂量组更明显。结论: DHEA 对OA 软骨有保护作用,且存在剂量依赖性,保护机制可能是抑制关节软骨基质金属蛋白酶表达、减少一氧化氮释放和增强抗氧化作用。     

重组人白血病抑制因子体外诱导HL-60细胞凋亡与bcl-2及p5表达的关系

目的 探讨重组人白血病抑制因子(rh-LIF) 诱导HL-60 细胞凋亡的作用及其可能机制。 方法 不同剂量(10 ~ 4 000 U·ml^-1) 的rh-LIF 作用HL-60 细胞3 d 后, 用流式细胞仪观察分析细胞周期变化并检测细胞凋亡率, 用TUNEL 法检测原位细胞凋亡情况;分别用免疫组化法和原位杂交法检测rh-LIF 作用2、4、6 d 后P53 蛋白及p53 mRNA、bcl-2 mRNA 表达水平的改变。 结果 rh-LIF (10 ~ 4 000 U·ml^-1) 作用d 3, 细胞凋亡率较对照组显著增加, 其中以1 000 U·ml^-1组的作用最强;rh-LIF (800 U·ml^-1) 作用2 ~ 6 d,P53 蛋白和p53 mRNA 表达也同步增高,而bcl-2 mRNA 表达显著降低(P <0.01)。 结论 rh-LIF 能诱导HL-60 细胞凋亡, 该作用与P53 蛋白表达增加和bcl-2 表达降低有关。     

西红花酸对乙醛诱导的肝星状细胞增殖和胶原合成的影响

目的: 探讨西红花酸(Crocetin)对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cell, HSC)增殖和胶原合成的影响及其作用机制。方法: 培养大鼠肝星状细胞HSC-T6,建立乙醛诱导的HSC纤维化模型;用不同浓度的西红花酸(10^-6、10^-7、10^-8 mol/L)对乙醛刺激的HSC-T6进行处理,MTT法检测细胞增殖;羟脯氨酸测定检测HSC-T6胶原含量;流式细胞分析仪测定细胞凋亡;Western blot检测细胞ERK1/2、Bax、Bcl-2蛋白的表达;RT-PCR检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白、间质胶原酶(MMP-2)、组织金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)的基因表达。结果: 在一定浓度范围里,西红花酸能抑制乙醛引起的HSC增殖和胶原合成; 西红花酸诱导乙醛刺激的HSC细胞凋亡;西红花酸能增加Bax蛋白表达,降低乙醛刺激升高的ERK1/2、Bcl-2蛋白表达;西红花酸能明显降低Ⅰ型、Ⅲ型胶原、TIMP-1的表达,提高MMP-2的表达。结论: 西红花酸通过抑制乙醛诱导的HSC增殖和胶原合成以及促进活化的HSC凋亡起到抗肝纤维化作用,其机制可能与ERK信号传导通路和对基质金属蛋白酶的调节有关。