黑曲霉ZF-34脂肪酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

为了使黑曲霉脂肪酶基因在毕赤酵母中表达并实现高密度发酵生产,采用PCR方法从黑曲霉基因组DNA中扩增出脂肪酶基因Lip A,测序结果表明Lip A基因编码区全长894 bp,编码297个氨基酸,与其他黑曲霉脂肪酶基因列序相似性高达99%。将Lip A基因连接到质粒p PIC9K上,构建了p PIC9K-LipA重组载体。将该重组载体转化到毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导,该酶基因在酵母细胞中获得活性表达,并能将酶蛋白分泌到胞外。重组菌株GS115/p PIC9K-LipA经100 L发酵罐发酵144 h,菌体湿重高达100. 5 g/L,发酵液中酶活性达1 950 U/m L。     

重组毕赤酵母产匍枝根霉内切葡聚糖酶Ⅱ的分离纯化及其酶学性质研究

将来源于匍枝根霉的endoglucanaseⅡ(egⅡ)在毕赤酵母中实现异源表达,对构建完成的重组毕赤酵母进行高密度发酵,制备目标酶蛋白.发酵液经Ni柱分离纯化,得到分子量大小约为38kDa,比酶活为37.8IU/mg的蛋白.酶学性质研究表明:该酶最适反应温度为55℃,最适反应pH为4.8;Mn2+、Zn2+、Fe2+对egⅡ的酶活力有一定的激活作用,Cu2+对egⅡ酶活有抑制作用,Mg2+、Co2+、Na+和K+等离子对该酶的催化活力没有明显影响;该酶以CMC-Na为底物时其反应米氏常数为2.04mg/ml.     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性检测

将PCR扩增的人溶菌酶编码基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,双酶切和测序鉴定表明,重组载体构建正确.电转化毕赤酵母GS115菌株,通过G418筛选获得高拷贝重组菌株后,用甲醇诱导表达;通过SDS-PAGE检测证明上清中有目的蛋白,表达产物与预期大小的人溶菌酶蛋白分子质量15 ku一致,其表达量占分泌总蛋白...     

脂肪酶产生菌的筛选及产酶条件优化

从不同土样中分离获得36株脂肪酶产生茼,其中zj-5菌株产酶活性最高,通过对zj-5进行形态学观察,初步确定其属于酵母茵.通过正交试验设计,对zj-5的产脂肪酶条件进行优化,在摇瓶培养条件下,其最适产酶条件为:葡萄糖10.0 g/L,蛋白胨6.0 g/L,反应起始pH值为6.0,发酵温度为42℃,在此条件下的产酶可达245 U/mL.     

响应面法优化褐藻酸降解菌的培养条件

通过响应面法对褐藻酸降解菌ZGR-13发酵产酶的培养条件进行了优化。该株褐藻酸降解菌ZGR-13的最适培养条件为:玉米浆质量分数1.85%,酵母膏质量分数0.92%,褐藻酸钠质量分数0.4%,NaCl质量分数3%,FeSO4质量分数0.01%,混合碳源质量分数3%,接种量9%。在最适条件下,菌株的最大酶活理论上可达57.61U/mL。     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性检测

将PCR扩增的人溶菌酶编码基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,双酶切和测序鉴定表明,重组载体构建正确。电转化毕赤酵母GS115菌株,通过G418筛选获得高拷贝重组菌株后,用甲醇诱导表达;通过SDS-PAGE检测证明上清中有目的蛋白,表达产物与预期大小的人溶菌酶蛋白分子质量15ku一致,其表达量占分泌总蛋白的32%。体外抑菌实验证实重组人溶菌酶蛋白对溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌均有明显的抑菌作用,表明在毕赤酵母中成功表达了重组人溶菌酶。     

天然油脂和表面活性剂对发酵性丝孢酵母产油脂及脂肪酶的影响

通过摇瓶发酵,研究了天然油脂(大豆油、猪油)和表面活性剂(Tween80、洗洁精)对发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)发酵生产油脂和胞内脂肪酶的影响。结果表明,大豆油对细胞产油和产酶的促进效果好于猪油,最适添加量为体积分数1.0%,发酵60h最大脂肪酶活力为347.5U/mL,发酵72h最大细胞油脂质量分数可达30.7%。低浓度表面活性剂对促进细胞产酶有利;Tween 80对细胞产油和产酶的提高效果好于洗洁精,最适添加量为体积分数0.5%,发酵60h最大脂肪酶活力为297U/mL,发酵72h最大细胞油脂质量分数可达30%。对于发酵性丝孢酵母,细胞内脂肪酶活力增加对油脂积累有促进作用。     

响应面法优化重组毕赤酵母表达纤维素酶EG27的研究

为优化重组毕赤酵母表达动物内源性纤维素酶EG27的培养基条件,在单因素实验基础上,以培养基中酵母粉、蛋白胨、葡萄糖的含量为自变量,EG27的酶活为响应值,采用Box-Behnken设计的方法,研究各自变量及其交互作用对毕赤酵母产EG27收率的影响。利用Design-Expert软件和响应面分析相结合的方法对毕赤酵母产动物内源性纤维素酶EG27的培养基条件进行优化,确定了最佳的培养基条件。在该培养条件下,获得最高产酶量为354U/L。     

响应面法优化重组毕赤酵母表达纤维素酶EG27的研究

为优化重组毕赤酵母表达动物内源性纤维素酶EG27的培养基条件,在单因素实验基础上,以培养基中酵母粉、蛋白胨、葡萄糖的含量为自变量,EG27的酶活为响应值,采用Box-Behnken设计的方法,研究各自变量及其交互作用对毕赤酵母产EG27收率的影响。利用Design-Expert软件和响应面分析相结合的方法对毕赤酵母产动物内源性纤维素酶EG27的培养基条件进行优化,确定了最佳的培养基条件。在该培养条件下,获得最高产酶量为354U/L。     

黑曲霉发酵产柚苷酶的工艺优化及热激对提高酶活的影响

对多种产柚苷酶菌株进行筛选,确定黑曲霉FFCC uv-11为发酵菌株,并进行发酵工艺优化,得到最佳条件为发酵时间120 h,接种量10%,培养基初始pH 6.0,碳源种类为柚皮苷,此条件下发酵酶活达到765.85 U/mL。研究热激对黑曲霉发酵产柚苷酶过程的影响,确定热激温度为35℃,热激时机为接种后30 h,热激时长为30 min,此条件下柚苷酶酶活可达970.90 U/mL,是未进行热激处理的1.27倍。     

海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化

研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopus japonicuslysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA,根据已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession No.EF036468)设计引物,以总RNA为模板经RT-PCR获得目的基因,并将该基因与表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-SJL,再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株进行甲醇诱导表达液体发酵,其上清液经硫酸铵沉淀、透析后得到溶菌酶粗品,再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。结果显示,共筛选到7株有抑菌活性的重组酵母菌株,诱导72 h时表达量最高。SJL在毕赤酵母中得到成功表达。     

植酸酶毕赤酵母基因工程菌高密度发酵

高密度发酵是提高发酵产品、产量的一个非常有效的手段。对一株巴斯德毕赤酵母的植酸酶工程菌Gs115 /phyAⅡ ,采用酵母高密度发酵方法 ,葡萄糖的补加采用逐渐增加的方式 ,控制溶氧和还原糖浓度 ,获得细胞密度为 80g/L。甲醇诱导后 ,最高植酸酶活力达到 4 .1× 10 4U/mL。     

海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化

研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopus japonicuslysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA,根据已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession No.EF036468)设计引物,以总RNA为模板经RT-PCR获得目的基因,并将该基因与表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-SJL,再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株进行甲醇诱导表达液体发酵,其上清液经硫酸铵沉淀、透析后得到溶菌酶粗品,再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。结果显示,共筛选到7株有抑菌活性的重组酵母菌株,诱导72 h时表达量最高。SJL在毕赤酵母中得到成功表达。     

人源血管紧张素转化酶-N结构域基因片段在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR方法从食管癌细胞TE-1中反转出cDNA,PCR扩增得到血管紧张素转化酶N结构域(ACE-N)基因片段,构建pPIC9K-ACE-N表达载体,转化毕赤酵母GSll5,阳性克隆再次电转,并从转化菌株中筛选出多拷贝转化子进行表达.经Ni2+亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化,获得的目的蛋白表达量为0.11 g/L,其纯度大于99％.为今后选择性抑制血管紧张素转化酶两个同源结构域的体外研究奠定基础.     

胰岛素原基因的高效分泌表达系统——甲醇酵母Pichia pastoris

为了提高重组人胰岛素的表达效率，使用了近年发展起来的真核表达系统-甲醇酵母Pichia
pastoris.　Pichia pastoris以甲醇为其惟一碳源，而乙醇氧化酶基因的启动子是强启动子，可用来调控
异源蛋白的表达.该系统具有操作技术简单，可进行高水平的胞内或胞外表达，及对表达产物进行翻译后
修饰与加工等显著优点.将含有小C肽或不含有C肽的人胰岛素原类似物基因整合到酵母基因组上来发酵生
产人胰岛素原，在表达量上，每升发酵液中可以得到胰岛素原250～300 mg，分泌水平约占总蛋白量的20%
，重组人胰岛素具有与猪胰岛素相同的受体结合能力和生物活性.     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶在毕赤酵母中的分泌表达

以嗜酸乳杆菌AS1.1854来源的亚油酸异构酶基因为模板,用PCR方法扩增目的片段,并克隆到pMD19T载体.经双限制性酶切的pMD19T-LAI和载体pPICZαA连接转化得到重组质粒pPICZαA-LAI.将阳性重组质粒用sac Ⅰ进行线性化后,经化学法转化毕赤酵母GS115.提取重组酵母GS 115/pPICZαA - LAI基因组,利用交叉引物通过PCR方法筛选重组子.阳性毕赤酵母GS115/pPlCZαA-LAI经1％甲醇诱导,分泌表达出相对分子质量为69 000亚油酸异构酶.经测定发酵上清酶活力为0.107 U,未破碎重组酵母酶活力0.08 U.     

人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的亚克隆及表达

将人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K,再将构建后的表达载体电转化到毕赤酵母GS115中,并诱导表达该基因。结果显示,重组酵母菌在甲醇体积分数为0.5%,72 h培养后,所提取的酶蛋白经酶活性检测,发现具有人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的活性,经SDS-PAGE分析,确定其分子质量为52 ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。     

燕麦β-葡聚糖水解酶发酵条件的优化及其应用

通过单因素实验和均匀实验确定由黑曲霉3112s产β-葡聚糖水解酶的最佳条件,并初步应用该水解酶水解燕麦β-葡聚糖。结果表明,最佳产酶培养基组成为麸皮15g、豆粕5g、葡萄糖1.2g、硫酸铵0.16g、水20mL。最佳发酵条件为pH 6.5、29℃、发酵6d,此时水解酶的酶活力达到183.27U/mL。用最优条件制备的β-葡聚糖水解酶对燕麦β-葡聚糖进行水解,水解之后燕麦β-葡聚糖的相对分子质量由1.69×106降为6.71×104。