RNA干扰P115基因对胃癌细胞巨噬细胞移动抑制因子表达的抑制作用

目的构建高尔基体转运蛋白P115基因shRNA表达载体,探讨P115基因沉默对胃癌细胞株BGC-823中巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)表达的影响。方法设计4对针对P115基因的shRNA序列,构建重组表达质粒,转染高表达P115的胃癌细胞株BGC-823。RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学检测P115及MIF的mRNA和蛋白的表达。结果 4个P115基因shRNA质粒经单酶切和测序证实构建正确;转染BGC-823细胞后,均能抑制P115基因的表达,其中以pGPU6/GFP/Neo-shP115-2的沉默效果最好,其对P115基因mRNA表达的抑制率为75.07%,对P115蛋白表达的抑制率为70.97%;转染pGPU6/GFP/Neo-shP115-2后,MIF基因的mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。结论 P115基因沉默后,BGC-823细胞MIF的表达明显降低,提示P115可能参与调节胃癌细胞MIF的表达,P115基因可作为研究胃癌发生发展分子机理的新靶点。     

α-甘露糖苷酶Ⅱ基因沉默对人胃癌BGC-823细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨沉默高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)基因的表达对人胃癌BGC-823细胞增殖与凋亡的影响。方法根据GenBank中登录的人GMⅡ基因mRNA序列及siRNA设计原则,设计了4条siRNA,并构建4个针对靶点的重组表达质粒pGPU6/GFP/Neo-1140、pGPU6/GFP/Neo-1303、pGPU6/GFP/Neo-1406和pGPU6/GFP/Neo-1817,同时合成阴性对照质粒pGPU6/GFP/Neo-shNC,经Lipofectamine 2000分别转染BGC-823细胞,通过RT-PCR及Western blot检测转染细胞中GMⅡ基因mRNA和蛋白的表达,筛选沉默效果最佳的质粒;经MTT试验、细胞周期分布分析、Hoechst33258和Annexin V-FITC/PI双染试验分别检测沉默GMⅡ基因对人BGC-823细胞增殖与凋亡的影响。结果 pGPU6/GFP/Neo-1303组GMⅡ基因mRNA和蛋白的表达明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05),表明pGPU6/GFP/Neo-1303组沉默效果最好;与空白对照组和阴性对照组相比,pGPU6/GFP/Neo-1303组BGC-823细胞增殖抑制率明显升高(P<0.01),G1期细胞比例明显上升(P<0.05),S期细胞比例明显下降(P<0.01),细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。结论已成功沉默BGC-823细胞中GMⅡ基因的表达,从而抑制BGC-823细胞的增殖并促进其凋亡,GMⅡ可能成为防治胃癌的新靶点。     

抑癌基因WWOX对Lewis肺癌细胞c-jun蛋白表达及其转录活性的影响

目的研究抑癌基因WWOX对Lewis肺癌细胞c-jun蛋白表达及其转录活性的影响,探讨WWOX基因的抑癌机制。方法采用脂质体转染法将WWOX基因重组真核表达质粒转染Lewis肺癌细胞,RT-PCR和Western blot法检测WWOX基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;免疫组化法检测WWOX基因转染后Lewis细胞中c-jun蛋白的表达水平;半定量RT-PCR法检测c-jun调控的4种肿瘤相关基因p21、cyclinD1、FasL及VEGF mRNA的转录水平。结果重组真核表达质粒pcDNA4.0/Myc-His-WWOX转染Lewis细胞后,WWOX基因在mRNA和蛋白水平上均得到表达;与未转染细胞和空载体转染细胞相比,WWOX基因转染细胞胞浆中c-jun蛋白的表达量升高,而细胞核中c-jun蛋白的表达量未见明显差异;p21基因mRNA的转录水平升高,cyclinD1、FasL和VEGF基因mRNA的转录水平降低。结论WWOX基因可在Lewis细胞中表达,其转染Lewis肺癌细胞后,不直接调控c-jun蛋白的表达量,但可影响其转录活性。     

IQ结构域的GTP酶激活蛋白1基因短发卡RNA重组质粒的构建及表达

目的构建特异性针对人IQ结构域的GTP酶激活蛋白1(IQ-domain GTPase-activating protein 1,IQGAP1)基因短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)的重组质粒,检测其在人食管癌KYSE150细胞中的表达。方法以人IQGAP1 mRNA序列为靶向设计合成含有shRNA序列的寡核苷酸,克隆至真核表达载体GV102中,构建重组质粒IQGAP1-shRNA,转化DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆测序鉴定。用脂质体2000介导IQGAP1-shRNA转染KYSE150细胞作为IQGAP1-shRNA干扰组,同时设转染载体GV102为对照组,RT-PCR及Western blot法检测IQGAP1基因的干扰效果。结果经测序鉴定,重组质粒IQGAP1-shRNA构建正确。IQGAP1-shRNA干扰组及对照组转染KYSE150细胞均可见绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),两组转染效率分别为(76±5. 780)%和(83±3. 851)%。IQGAP1-shRNA干扰组IQGAP1 mRNA转录水平和蛋白表达水平与对照组比较差异均有统计学意义(P 0. 001),表达抑制率分别为(82±2. 424)%及(77±2. 791)%。结论成功构建了IQGAP1-shRNA真核表达质粒,能特异性降低食管癌KYSE150细胞中IQGAP1基因的表达,为进一步研究IQGAP1基因在食管癌中的功能及靶向治疗作用奠定了基础。     

ERK1/2抑制对沙门菌侵袭小鼠胃癌细胞后小鼠β-防御素-2表达的影响

目的探讨ERK1/2抑制对沙门菌侵袭小鼠胃癌(mouse forestomach carcinoma,MFC)细胞后小鼠β-防御素-2(mouseβ-defensin-2,m BD-2)表达的影响及作用机制。方法采用RNA干扰的方法抑制MFC细胞中ERK1/2的表达,并经G418筛选稳定细胞株,经RT-PCR和Western blot法检测ERK1/2基因的抑制效率。用10~3个/ml的沙门菌对干扰组及对照组(未转染)的MFC细胞分别作用4、8及12 h,通过Western blot法检测m BD-2蛋白表达及Rsk~(90)的磷酸化水平。同时采用MTT法检测沙门菌作用两组MFC细胞12、24及48 h时的生长情况。结果RT-PCR和Western blot法检测结果表明,ERK1/2基因抑制效果显著。沙门菌作用MFC细胞后4、8和12 h后,各时间点间干扰组细胞中m BD-2蛋白表达及Rsk~(90)蛋白磷酸化水平差异无统计学意义(P0.05),且均显著低于各时间点的对照组(P0.05)。沙门菌作用12和24 h,干扰组细胞的抑制率明显高于对照组(P0.05),作用48 h时,两组细胞的抑制率差异无统计学意义(P0.05),细胞几乎全部死亡,且干扰组细胞抑制率的增加速度较快,作用24 h时已达97.7%。结论ERK1/2抑制可明显降低沙门菌侵袭MFC后m BD-2的表达水平,表明ERK1/2可调控m BD-2的表达。     

FOXC1蛋白基因shRNA干扰质粒对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

目的探讨FOXC1蛋白基因RNA干扰质粒对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法采用RT-PCR及Westernblot法检测SGC-7901细胞和胃黏膜上皮细胞GES-1中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。构建3个FOXC1基因shRNA真核表达质粒pshRNA-FOXC1a、pshRNA-FOXC1b、pshRNA-FOXC1c,分别转染SGC-7901细胞,并设pGenesil-1空质粒转染组和未转染的细胞对照组,RT-PCR及Western blot法分别检测转染细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;MTT法检测转染细胞的增殖活力;流式细胞术检测转染细胞的细胞周期。结果 SGC-7901细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均显著高于GES-1细胞(P<0.05)。pshRNA-FOXC1a组、pshRNA-FOXC1b组和pshRNA-FOXC1c组SGC-7901细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均显著低于pGenesil-1组和SGC-7901组(P<0.01);细胞增殖抑制率显著高于pGensil-1组(P<0.05)。处于G1、G2期的细胞比例显著高于SGC-7901组(P<0.01),S期细胞比例显著低于SGC-7901组(P<0.01)。结论成功构建了FOXC1蛋白基因shRNA真核表达质粒。FOXC1在胃癌细胞SGC-7901中呈高表达,抑制其表达后,细胞周期被阻滞在G1～G2期,细胞增殖受到抑制。     

小脑症1基因过表达对人肺癌细胞A549凋亡的影响

目的探讨小脑症1(microcephalin 1,MCPH1)基因过表达对人肺癌细胞A549凋亡的影响。方法将质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1转染肺癌细胞株A549,并设阴性对照组[pcDNA3.1(-)质粒转染]和未转染组。转染48 h后,采用qRT-PCR法检测各组细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平;转染72 h后,Western blot法检测各组细胞中MCPH1蛋白的表达水平,流式细胞术分析细胞的凋亡情况。结果质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1转染A549细胞后,均可明显上调细胞中MCPH1基因mRNA和蛋白的表达,与阴性对照组和未转染组相比,差异均有统计学意义(P0.05);质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1转染组细胞凋亡率[(16.82±1.29)%]较阴性对照组[(6.27±0.88)%]和未转染组[(5.36±0.43)%]明显升高,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 MCPH1过表达后可明显促进A549细胞的凋亡,为进一步研究MCPH1基因在肺癌细胞凋亡中的作用及其机制奠定了基础。     

海兰褐鸡卵泡颗粒细胞微管去稳蛋白2过表达对Ras-MAPK信号通路的影响

目的探讨微管去稳蛋白2(stathmin-2-like protein,STMN2)过表达对海兰褐鸡卵泡颗粒细胞中Ras-MAPK(mitogen-activated protein kinase)信号通路的影响。方法将STMN2腺病毒过表达载体以MOI为350 pfu/cell转染原代培养的蛋鸡卵泡颗粒细胞模型,设培养液组和腺病毒空载体组为对照组,转染48 h后,收集细胞总RNA和总蛋白,荧光定量PCR法检测各组细胞STMN2 mRNA水平及STMN2过表达对颗粒细胞分泌的细胞外调节蛋白激酶1(extracellular regulated protein kinases1,erk1)、erk2、大鼠肉瘤蛋白(rat sarcoma,ras)和转录激活因子ETS样蛋白1(ets-like protein 1,elk-1)的影响,Western blot法检测各组STMN2蛋白水平及STMN2过表达对颗粒细胞分泌的erk1、erk2、磷酸化erk1(p-erk1)、p-erk2、ras和elk-1的影响。结果与培养液组和腺病毒空载体组比较,STMN2过表达载体组STMN2 mRNA及蛋白表达水平均明显升高(P0.01);除elk-1蛋白表达水平差异无统计学意义(P0.05)和elk-1 mRNA水平显著增加(P0.05)外,STMN2过表达使颗粒细胞分泌的目的基因mRNA与蛋白表达水平均极显著增加(P0.01)。结论 STMN2可通过Ras-MAPK信号通路影响蛋鸡卵泡颗粒细胞周期。     

人葡萄糖调节蛋白78shRNA真核表达质粒的构建及其稳定转染A549细胞系的建立

目的构建人葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 k D,GRP78)shRNA真核表达质粒,并建立其稳定转染A549细胞系。方法根据Gen Bank中登录的人GRP78基因序列(3309)设计3对互补寡聚单链DNA干扰序列(GRP78-mi R-1、GRP78-mi R-2、GRP78-mi R-3)及1对阴性对照,分别插入至载体pc DNA6.2TM-GW/Em GFP,构建shRNA真核表达质粒。在Lipofectamine 3000介导下将各shRNA真核表达质粒分别转染A549细胞,并经Blasticidin S HCl加压筛选稳定的转染细胞系。实时荧光定量PCR和Western blot法检测A549细胞中GRP78基因m RNA转录和蛋白表达水平。结果各shRNA真核表达质粒经测序鉴定证明均构建正确。稳定转染shRNA真核表达质粒的A549细胞,在荧光显微镜下可见均一表达绿色荧光。与空白对照组比较,A549细胞中GRP78基因m RNA转录和蛋白表达水平明显降低(P0.05),阴性对照组无统计学意义(P0.05)。结论成功构建了人GRP78的shRNA真核表达质粒,并建立了其稳定转染的A549细胞模型,为进一步研究GRP78在肺癌细胞的侵袭和转移中的作用机制奠定了基础。     

慢病毒介导siRNA对大鼠脊髓组织细胞外信号调节激酶1/2及核因子E2相关因子2基因的影响

目的评价慢病毒介导细胞外信号调节激酶1/2(extracellular-signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)-si RNA及核因子(nuclear factor,NF)E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)-si RNA进入大鼠局部脊髓组织的转染效果。方法采用NYU撞击法构建SD大鼠脊髓损伤模型(模型组),使用微量注射器将含荧光慢病毒载体(LV-Nrf2-RNAi和LV-ERK1/2-RNAi)稀释液注射至其脊髓T10水平背侧深约0.8 mm处,荧光显微镜下观察不同时间点(12 h、24 h、72 h、7 d及14 d)转染效果。以只切除椎板,不打击脊髓的大鼠作为假手术组,在模型组和假手术组中同时设转染组和未转染组。取大鼠脊髓组织,采用RT-PCR及Western blot法检测转染后7 d时ERK1/2及Nrf2基因m RNA转录及蛋白表达水平。结果与假手术组相比,模型组大鼠脊髓组织在慢病毒转染后各时间点均有较强的荧光表达,病毒转染7 d以内,荧光强度与时间呈正相关,在转染7 d后达到高峰。转染7 d后,假手术组与模型组中ERK1/2及Nrf2基因m RNA转录及蛋白表达水平均较未转染组明显降低(P均0.05)。结论慢病毒介导si RNA转染大鼠脊髓组织,能够有效沉默ERK1/2及Nrf2基因的表达。     

Curcumin Induced Human Gastric Cancer BGC-823 Cells Apoptosis by ROS-Mediated ASK1-MKK4-JNK Stress Signaling Pathway

The signaling mediated by stress-activated MAP kinases (MAPK), c-Jun N-terminal kinase (JNK) has well-established importance in cancer. In the present report, we investigated the effects of curcumin on the signaling pathway in human gastric cancer BGC-823 cells. Curcumin induced reactive oxygen species (ROS) production and BGC-823 cells apoptosis. Inhibition of ROS generation by antioxidant (NAC or Trion) significantly prevented curcumin-mediated apoptosis. Notably, we observed that curcumin activated ASK1, a MAPKKK that is oxidative stress sensitive and responsible to phosphorylation of JNK via triggering cascades, up-regulated an upstream effector of the JNK, MKK4, and phosphorylated JNK protein expression in BGC-823 cells. However, curcumin induced ASK1-MKK4-JNK signaling was attenuated by NAC. All the findings confirm the possibility that oxidative stress-activated ASK1-MKK4-JNK signaling cascade promotes the apoptotic response in curcumin-treated BGC-823 cells.     

人参皂苷单体Rh2(S亚型)对人急性髓系白血病细胞株KG1α增殖、凋亡的影响及其机制

目的探讨人参皂苷单体Rh2(S亚型)对人急性髓系白血病细胞株KG1α增殖、凋亡的影响及其机制。方法取对数生长期的KG1α细胞,分为两组:空白对照组(常规培养)和人参皂苷单体Rh2(S)组,采用MTT法检测细胞的增殖活力,倒置显微镜观察细胞的形态及数量,透射电镜观察细胞的超微结构,流式细胞仪检测细胞周期的分布,Real-time PCR检测细胞中β-catenin基因mRNA水平,免疫细胞化学法检测细胞中β-catenin、TCF4、CyclinD1蛋白的定位及表达,Western blot检测细胞中β-catenin、TCF4、CyclinD1蛋白的表达水平。结果人参皂苷单体Rh2(S)对KG1α细胞的增殖具有明显的抑制作用,且呈浓度和时间依赖性。与空白对照组比较,Rh2(S)作用48 h后,可见KG1α细胞分散生长,数量明显减少;可见数量不等,程度不同的凋亡细胞;G0/G1期细胞比例明显上升(P<0.05),G2+M和S期细胞比例明显下降(P<0.05);细胞中β-catenin基因mRNA水平明显降低(P<0.01)。β-catenin、TCF4、CyclinD1蛋白的表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论人参皂苷单体Rh2(S亚型)对KG1α细胞具有明显的增殖抑制作用,其机制可能抑制Wnt/β-catenin/TCF4/CyclinD1信号通路,使细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡。     

DAG/PKCδ and IP3/Ca2+/CaMK IIβ Operate in Parallel to Each Other in PLCγ1-Driven Cell Proliferation and Migration of Human Gastric Adenocarcinoma Cells,through Akt/mTOR/S6 Pathway

Phosphoinositide specific phospholipase Cγ (PLCγ) activates diacylglycerol (DAG)/protein kinase C (PKC) and inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3)/Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMK II) axes to regulate import events in some cancer cells, including gastric adenocarcinoma cells. However, whether DAG/PKCδ and IP3/Ca²⁺/CaMK IIβ axes are simultaneously involved in PLCγ1-driven cell proliferation and migration of human gastric adenocarcinoma cells and the underlying mechanism are not elucidated. Here, we investigated the role of DAG/PKCδ or CaMK IIβ in PLCγ1-driven cell proliferation and migration of human gastric adenocarcinoma cells, using the BGC-823 cell line. The results indicated that the inhibition of PKCδ and CaMK IIβ could block cell proliferation and migration of BGC-823 cells as well as the effect of inhibiting PLCγ1, including the decrease of cell viability, the increase of apoptotic index, the down-regulation of matrix metalloproteinase (MMP) 9 expression level, and the decrease of cell migration rate. Both DAG/PKCδ and CaMK IIβ triggered protein kinase B (Akt)/mammalian target of rapamycin (mTOR)/S6 pathway to regulate protein synthesis. The data indicate that DAG/PKCδ and IP3/Ca²⁺/CaMK IIβ operate in parallel to each other in PLCγ1-driven cell proliferation and migration of human gastric adenocarcinoma cells through Akt/mTOR/S6 pathway, with important implication for validating PLCγ1 as a molecular biomarker in early gastric cancer diagnosis and disease surveillance.     

黄芪多糖对胃癌细胞上清液中培养的树突状细胞分化成熟及功能的影响

目的探讨黄芪多糖对胃癌细胞SCG-7901上清液中培养的树突状细胞(Dendritic cells,DC)分化成熟及功能的影响,分析黄芪多糖抗癌的作用机制。方法将人外周血分离的单核细胞加入含重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF)和重组人白细胞介素的培养液中,随机分为空白组(以RPMI1640培养液培养)、干预组(以黄芪多糖干预后的胃癌细胞上清液培养)、对照组(以胃癌细胞上清液培养)。混合培养48h后,显微镜下观察DC成熟过程中的形态学变化,流式细胞术检测DC的表型(CD40、CD80),混合同种淋巴细胞增殖反应(Mixed lymphocyte reaction,MLR)检测DC的增殖效应。结果与对照组比较,空白组和干预组DC的CD40和CD80的表达均明显增加(P<0.05),刺激同种淋巴细胞增殖效应明显增强(P<0.05);干预组DC CD40和CD80的表达阳性率及刺激同种淋巴细胞增殖效应均明显低于空白组(P<0.05)。结论在体外,黄芪多糖可有效对抗胃癌细胞上清液引起的对DC分化成熟和功能的抑制。     

重组靶向毒素IL-6(23)-PE40_(KDEL)在毕赤酵母中的表达及其活性

目的利用毕赤酵母表达系统表达IL-6(23)-PE40KDEL重组靶向毒素,并检测其杀伤肿瘤细胞的活性。方法采用PCR技术,将目的基因IL-6(23)-PE40KDEL插入到pPIC9载体中SnaBⅠ与NotⅠ位点,电转化至巴斯德毕赤酵母GS115中,筛选Mut-型重组酵母;甲醇诱导表达,体外细胞试验检测其细胞毒性。结果获得12株Mut-重组酵母,其中8株具有细胞毒性,表达产物占上清液蛋白的9%～12.7%;15"l以上的表达产物在体外对SP2/0、HL-60、HepG2、BGC-832和HCT-116细胞具有高度杀伤活性,对CK、HeLa和NIH/3T3细胞无明显影响。结论IL-6(23)-PE40KDEL重组靶向毒素在毕赤酵母GS115中获得表达,并具有选择杀伤肿瘤细胞的活性。     

RNA干扰her-2基因对骨肉瘤细胞血管内皮生长因子-A和白细胞介素-8表达的影响

目的探讨her-2基因沉默对人骨肉瘤细胞株saos-2中血管内皮生长因子-A(Vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)和白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)表达的影响。方法构建her-2 shRNA重组表达质粒,转染至骨肉瘤细胞株saos-2,同时设空白对照组和shNC阴性对照组;RT-PCR检测her-2、VEGF-A和IL-8基因mRNA的转录水平;Western blot检测her-2蛋白表达的变化;ELISA法检测细胞培养液中VEGF-A和IL-8的分泌水平。结果构建的her-2 shRNA表达载体能抑制her-2基因的表达,对her-2基因mRNA的转录和蛋白表达的抑制率分别为63.05%和62.59%;转染重组质粒her-2 shRNA后VEGF-A和IL-8基因mRNA的转录水平及蛋白分泌水平均显著降低(P<0.01)。结论 her-2基因沉默后,VEGF-A和IL-8基因mRNA的转录水平和蛋白表达水平明显降低,her-2基因参与了骨肉瘤细胞VEGF-A和IL-8基因的表达调控,提示her-2基因可作为研究骨肉瘤血管生成分子机理的新靶点。     

Silencing of Ether à Go-Go 1 by shRNA Inhibits Osteosarcoma Growth and Cell Cycle Progression

Recently, a member of the voltage-dependent potassium channel (Kv) family, the Ether à go-go 1 (Eag1) channel was found to be necessary for cell proliferation, cycle progression and tumorigenesis. However, the therapeutic potential of the Eag1 channel in osteosarcoma remains elusive. In the present study, a recombinant adenovirus harboring shRNA against Eag1 was constructed to silence Eag1 expression in human osteosarcoma MG-63 cells. We observed that Eag1-shRNA inhibited the proliferation and colony formation of MG-63 cells due to the induction of G1 phase arrest. Moreover, in vivo experiments showed that Eag1-shRNA inhibited osteosarcoma growth in a xenograft nude mice model. In addition, selective inhibition of Eag1 significantly decreased the expression levels of cyclin D1 and E. Taken together, our data suggest that the Eag1 channel plays a crucial role in regulating the proliferation and cell cycle of osteosarcoma cells, and represents a new and effective therapeutic target for osteosarcoma.