葡萄糖作辅助碳源对klebsiella pneumoniae发酵生产1,3-丙二醇的影响

在Klebsiella pneumoniae发酵甘油生产1,3 丙二醇的种子培养及发酵实验中,考察了葡萄糖作辅助碳源对菌体生长及1,3 丙二醇生成的影响. 结果表明,在种子培养期,以葡萄糖和甘油为混合碳源可缩短种子培养周期;在批次发酵和流加发酵中,葡萄糖作辅助碳源可使1,3 丙二醇产率及得率明显提高,但不同的葡萄糖加入方式对产率及得率促进的效果不同. 在初始发酵培养基中添加5 g/L葡萄糖、并在4 40 h进行葡萄糖与甘油混合液连续流加的条件下,1,3 丙二醇浓度、产率及得率较单一甘油为底物的流加发酵结果分别提高41.2 , 38.6 和8.3 .     

若干因素对发酵法生产1,3-丙二醇的调控作用

利用一株新筛选的克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae ZJU 5205)对发酵法生产1,3-丙二醇进行了研究,考察了 pH、溶氧及添加辅助底物葡萄糖对发酵过程的调控作用。实验结果表明,相比于未调控 pH 发酵,恒定 pH 值发酵得到的菌体浓度明显增高,甘油消耗加快,1,3-丙二醇的最终浓度以及甘油到丙二醇的转化率(Y_(P/S))明显提高,分别达16.39g/L和0.51mol/mol;厌氧发酵时的菌体浓度和甘油消耗速率均高于微氧发酵,但1,3-丙二醇最终浓度和转化率低于微氧发酵;添加葡萄糖为辅助底物能够有效促进菌体生长,但1,3-丙二醇最终浓度和转化率却低于以甘油为单一底物时的发酵结果。     

1,3-丙二醇分批发酵动力学模型

在分批发酵中，研究了Klebsiella pneumoniae的生长、底物甘油消耗及1,3-丙二醇的产生特性. 基于Logistic方程和Luedeking-Piret方程，得到了描述1,3-丙二醇分批发酵过程的动力学模型及模型参数，该组模型能很好地拟合发酵过程，并在初始甘油浓度变化较大的范围内表现出很好的适用性. 同时，所建立的模型也基本反映了Klebsiella pneumoniae分批发酵过程的动力学特征. 基于分批发酵动力学模型，提出了以甘油为单一碳源时的底物流加策略，通过与其他流加策略条件下的发酵对比实验表明，通过基于动力学模型的流加策略可获得更高的1,3-丙二醇浓度及生产强度.     

以粗甘油为原料高产1,3-丙二醇菌株的等离子体复合诱变

为提高克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)以粗甘油为底物发酵生产1,3-丙二醇的水平,尝试使用大气压介质阻挡放电等离子体与LiCl进行复合诱变,结合FeCl3和产物耐受的筛选方法,得到一株产量较高的突变菌株KpM30.经批式流加发酵,1,3-丙二醇的产量、摩尔转化率分别达到70.2 g/L和0.5...     

两段双底物发酵生产1,3–丙二醇

利用Klebsiella pneumoniae生长与催化耦合的特点，将好氧生长与厌氧转化两个过程耦合，开发了两段双底物发酵生产1,3-丙二醇的新工艺，并对其工艺特点进行了初步研究. 结果表明，采用两段双底物发酵工艺，发酵过程菌体浓度明显高于传统的厌氧转化工艺，OD650最大值达到9.37，发酵60 h, 1,3-丙二醇的浓度达到50.16 g/L，生成速率达0.836 g/(L×h)，比传统工艺提高了45%.     

产1，3-丙二醇菌株克雷伯氏肺炎杆菌的诱变与筛选研究

为提高克雷伯氏肺炎杆茵Klebsiella pneumoniae产1,3-丙二醇的能力,尝试使用紫外线和氯化锂对菌种进行复合诱变,利用产酸圈和产物耐受相结合的平板筛选方法,获得可耐受高质量浓度1,3-丙二醇且副产物中乙醇及乳酸含量较少的优良突变菌株2株.与出发茵株相比,2株高产突变菌株Klebsiella pneumoniaw Kc和Klebsiella pneumoniae Kd发酵最终1,3-丙二醇质量浓度分别提高了34.7%和35.2%,达到66.7 g/L和67.1 g/L;乙醇质量浓度分别降低了49.3%和47.1%,降低至8.1 g/L和8.4 g/L;乙酸质量浓度分别提高了61.5%和68.1%,达到14.7 g/L和15.3 g/L.结果表明,该诱变和筛选方法目标明确、易操作、效率高,在1,3-丙二醇工业规模的生物法生产中将具有良好的应用价值,而且对于其它具有工业应用价值的菌株筛选工作也具有一定的借鉴意义.     

有氧条件下Klebsiella pneumoniae发酵生产1,3-丙二醇的研究

探讨了有氧条件下利用Klebsiella pneumoniae发酵生产1,3-丙二醇的可能性,研究了通气量、初始底物浓度、pH和3-羟基丙醛等因素对发酵过程的影响.当空气通量为0.25vvm时,1,3-丙二醇的得率和生产强度与厌氧时相近.有氧条件下,当初始甘油质量浓度大于50g/L时,发酵中后期出现3-羟基丙醛的长期积累,甘油不能消耗完全.控制pH为7.75～8.00可以促进3-羟基丙醛的转化使甘油完全消耗.     

重组甲酸脱氢酶对合成1,3-丙二醇的促进作用

在甘油厌氧发酵生产1,3-丙二醇的过程中，需要消耗还原当量NADH，NADH的有效供给决定了1,3-丙二醇的产量。本文从Candida boidinii基因组DNA中克隆了甲酸脱氢酶基因fdh，利用表达质粒pMAL TM-p2X-fdh转化到1,3-丙二醇生产菌 Klebsiella pneumoniae YMU2中，构建了具有NADH再生系统的重组菌Klebsiella pneumoniae F-1。在5 L发酵罐培养中，F-1合成1,3-丙二醇浓度和产率分别达到了78. 6 g·L-1 和1. 33 g·L-1·h-1，分别比YMU2提高了12. 5% 和41. 2%。根据F-1和YMU2菌株的主要代谢产物的生成情况比较了二者的代谢流分布。     

1,3-丙二醇有氧分批发酵动力学模型

在1,3-丙二醇有氧分批发酵中,研究了Klebsiella pneumoniae的生长、底物甘油消耗及1,3-丙二醇的产生特性.基于Logistic方程和Luedeking-Piret方程,得到了描述1,3-丙二醇有氧分批发酵过程的动力学模型及模型参数,该组模型能很好的拟合发酵过程,并在初始甘油浓度变化较大的范围内表现出很好的适用性.同时所建立的模型也基本反映了Klebsiella pneumoniae分批发酵过程的动力学特征.     

3-羟丙醛对Klebsiella pneumoniae发酵产 1,3-丙二醇的影响及其调控

中间产物3-羟丙醛在发酵液中的积累对Klebsiella pneumoniae细胞生长及1,3-丙二醇的合成有显著的抑制作用,而调节发酵的起始甘油浓度及控制发酵pH值可调控发酵液中3-羟丙醛的积累.当起始甘油质量浓度分别为20、30、50、70g/L的批式发酵中,发酵液中3-羟丙醛的积累的高峰分别为4.31、6.87、11.48及13.49mmol/L,当起始甘油质量浓度大于50g/L时,3-羟丙醛在到达积累高峰后不能被菌体有效转化,在发酵后期维持较高浓度,抑制了细胞生长及1,3-丙二醇的合成,发酵不能继续进行.控制发酵pH值为7.75～8.0可促进发酵液堆积的3-羟丙醛被迅速转化.在流加发酵中起始甘油质量浓度采用30g/L,发酵pH值控制为7.75条件下,发酵32 h,1,3-丙二醇质量浓度可达37.16g/L,1,3-丙二醇的生产强度和质量得率分别达到1.16g/(L·h)和52.66%.     

控制氮源浓度提高1,3-丙二醇的发酵水平

通过对克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)甘油发酵生产1,3-丙二醇(1,3-PD)发酵过程的研究发现,氮源浓度对菌体生长、产物和副产物的代谢有着重要影响.氮源浓度较低时,菌体生长和产物生成都会因氮源不足受到影响;氮源浓度较高时会导致菌体过度生长和副产物的大量生成,降低1,3-PD的最终浓度和甘油到1,3-丙二醇的转化率.控制合适的氮源浓度可以提高1,3-PD的发酵水平,1,3-PD的最终浓度达到61.20 g·L-1、甘油到1,3-丙二醇的转化率达到0.72 (mol·mol-1),分别比对照提高了10%和20%.     

重组肺炎克雷伯菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇

对表达了高效醛脱氢酶的重组肺炎克雷伯氏菌以甘油为底物生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的过程进行优化,将发酵过程中补料阶段甘油浓度分别控制为0~10, 10~20, 20~30 g/L,并分3次间歇性补加甘油. 结果表明,发酵过程中补料阶段控制甘油浓度在20~30 g/L,发酵26 h得到47.20 g/L 3-羟基丙酸和43.90 g/L 1,3-丙二醇;而间歇性补加甘油产物得率最高,发酵26 h时3-羟基丙酸和1,3-丙二醇相对甘油的得率分别为0.35和0.38 mol/mol. 3-羟基丙酸和1,3-丙二醇联产可实现辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的再生平衡,从而提高碳回收率.     

Klebsiella pneumoniae发酵菊芋生产2,3-丁二醇的初步研究

对Klebsiella pneumoniae发酵菊芋块茎生产2,3-丁二醇进行了初步研究,通过摇瓶实验考察了不同碳源及培养基中微量元素对发酵的影响. 结果表明,菊芋是良好的发酵2,3-丁二醇的底物,以其为底物时产物浓度和生产强度比葡萄糖发酵提高了42%以上,培养基中不添加微量元素对菊芋发酵基本没有影响,因而可简化培养基成分以降低生产成本. 在发酵罐批式流加实验中,发酵56 h菊芋发酵的产物浓度和生产强度分别为81.47 g/L和1.45 g/(L×h),与葡萄糖发酵结果相当.     

氧对Klebsiella pneumoniae产1,3-丙二醇代谢的影响

考察了氧对Klebsiella pneumoniae发酵产1,3-丙二醇(PDO)代谢的影响. 研究结果表明,在厌氧或供氧条件下,K. pneumoniae都能利用甘油产PDO. 起始甘油浓度20 g/L,发酵时间4 h,在充分供氧条件下,PDO产量仅为1.1 mmol/L;但在微量供氧条件下,PDO产量为16 mmol/L,是厌氧发酵时的1.28倍. 在微量供氧条件下,调控PDO合成的关键酶甘油脱氢酶、甘油脱水酶及1,3-丙二醇氧化还原酶的活性分别为7.28, 1.14, 0.52 U/mg,高于厌氧或充分供氧条件下的相应酶活性. 氧对细胞内NADH的合成也有影响,厌氧及微量供氧条件下菌体内NADH含量分别为3.78及3.72 μmol/g (DCW),高于充分供氧发酵时的0.85 μmol/g (DCW).     

利用氧化还原电位调控基因工程菌株Klebsiella pneumoniae F-1合成1,3-丙二醇

基因工程菌株Klebsiella pneumoniae厌氧发酵过程中,氧化还原电位(ORP)是一个监控发酵过程的重要指标. 考察了K. pneumoniae F-1在不同ORP(-190, -210, -240和-290 mV)下菌体生长和代谢产物合成的情况. 在ORP为-240 mV时,1,3-丙二醇的发酵终浓度和得率分别为81.5 g/L和0.423 mol/mol,分别为4种ORP条件下的最高值. 这说明ORP=-240 mV是菌株K. pneumoniae F-1的最适ORP. 此ORP既不同于野生菌株K. pneumoniae M5aL的最适ORP(-190 mV),也不同于经过诱变的菌株K. pneumoniae YMU2的最适ORP(-280 mV). 另外,通过研究发酵体系ORP对甘油代谢流的影响,发现还原性氛围较有利于甘油向1,3-PD、乙醇、2,3-丁二醇等还原性较高的代谢物转化. 首次报道了ORP调控发酵过程在基因工程改造菌株中的应用,这对于进一步研究ORP调控厌氧发酵过程具有一定的意义.     

两株Klebsiella pneumoniae菌发酵生产2,3-丁二醇的比较

对两株克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)批式流加发酵生产2,3-丁二醇进行了研究,结果表明,K. pneumoniae CICC 10011代谢产生的各种有机酸和乙醇浓度均明显低于K. pneumoniae DSM 2026,发酵56 h,目标产物(2,3-丁二醇+乙偶姻)浓度为85.61 g/L,生产强度为1.53 g/(L×h),葡萄糖质量转化率为45%. 对2株克雷伯氏菌发酵的代谢流量分析表明,K. pneumoniae CICC 10011是生产2,3-丁二醇的优良菌株.     

分段通气对Klebsiella pneumoniae生产1,3-丙二醇关键酶和辅酶的影响

通过考察1,3-丙二醇合成中关键酶、辅酶的变化,研究了分段通入空气对Klebsiella pneumoniae厌氧发酵生产1,3-丙二醇的影响. 与对照组相比,在发酵前期(12 h)通入空气4 h后,甘油脱氢酶酶活提高1.5倍,1,3-丙二醇氧化还原酶酶活提高18%,1,3-丙二醇浓度提高16%;发酵后期(28和48 h)通入空气后,甘油脱氢酶酶活不变,1,3-丙二醇氧化还原酶酶活下降,1,3-丙二醇浓度降低. 发酵前期,通气对辅酶NADH和NAD的浓度无影响;发酵后期,菌体生长停滞,辅酶的浓度也随之下降.     

醛脱氢酶基因敲除对克氏肺炎杆菌合成1，3-丙二醇的影响

利用Klebsiella pneumoniae厌氧发酵甘油生产1,3-丙二醇时，一部分甘油通过氧化代谢途径大量合成副产物乙醇，降低了1,3-丙二醇的得率.醛脱氢酶ALDH是乙醇合成途径的关键酶之一，其催化作用不仅消耗了大量甘油，还将还原型辅酶NADH氧化为NAD⁺，降低了同为NADH依赖型的1,3-PD合成途径的效率.本文以醛脱氢酶ALDH为改造目标，以K.pneumoniae为宿主，通过同源重组技术在K.pneumoniae M5aL的ALDH基因中成功地插入了四环素抗性基因，经抗性筛选和基因水平鉴定，得到两株ALDH基因敲除的重组菌0623-1hb及0623-1hc.本文研究了这两株重组菌的生长代谢特性，结果表明两株重组菌的ALDH酶活基本检测不到，菌体生长受到明显抑制，乙醇合成浓度比出发菌株K.pneumoniae M5aL降低了43%～53%，1,3-PD合成浓度及摩尔得率分别提高了27%～42%和19%～24%.     

能量驱动对Klebsiella pneumoniae发酵甘油合成1,3-丙二醇的影响

考察了外加能量对Klebsiella pneumoniae合成1,3 丙二醇的影响,结果表明,外加0.6 0.8 g/L三磷酸腺苷 ATP 可以有效促进Klebsiella pneumoniae发酵甘油的还原代谢,1,3 丙二醇产量提高了50 70 ,得率在发酵后期仍能维持在较高水平. 利用休止细胞研究了甘油脱水酶催化失活后能量刺激复活的情况,结果表明外加三磷酸腺苷(ATP)对休止细胞中甘油脱水酶的复活有明显的驱动作用,经多次失活/驱动复活后甘油脱水酶活性可维持不变.     

代谢副产物对Klebsiella pneumoniae生长及合成1,3-丙二醇的影响

研究了Klebsiella pneumoniae在厌氧摇瓶中的生长代谢特性和基质消耗情况,发现主要副产物乙醇是抑制菌体持续生长及1,3-丙二醇合成的主要因素,外源添加实验表明,8 g/L乙醇可使K. pneumoniae比生长速率、1,3-丙二醇比合成速率、最大菌体浓度及1,3-丙二醇终浓度分别下降21.6%, 22.1%, 59.6%及33.5%;指数生长期加入乙醇对菌体生长代谢的抑制作用更加明显. 其他代谢副产物乙酸、乳酸、2,3-丁二醇对K. pneumoniae生长代谢也有不同程度影响,乙酸浓度仅2 g/L即可对菌体生长产生抑制,乙酸浓度达到5 g/