技术贸易

β-甘露聚糖酶一、项目简介β-甘露聚糖酶可广泛应用于食品、保健和医药、饲料、造纸和纺织等工业领域中。在保健食品和医药方面,利用β-甘露聚糖酶水解含甘露聚糖的来源丰富的植物胶(如角豆胶、瓜儿豆胶、魔芋粉和田菁胶等)生产含有由不同单糖分子(2-10个)组成的甘露低聚糖,其     

β-甘露聚糖酶

β-甘露聚糖酶可广泛应用于食品、保健、医药、饲料、造纸和纺织等工业领域中。在保健食品和医药方面，利用β-甘露聚糖酶水解含甘露聚糖的来源丰     

高酶活性β-甘露聚糖酶定向进化及其用于制备甘露寡糖

为了提高β-甘露聚糖酶的活性,本研究采用易错PCR将来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)KD-1的β-甘露聚糖酶基因manBl进行分子进化,并在枯草芽孢杆菌(B. subtilis)中进行表达,以定向筛选酶活性提高的β-甘露聚糖酶突变体。筛选得到的突变体ManBl (I91N/L211I),其比酶活性为 15554.7 U/mg,是野生型ManBl的4.2倍,食品级表达的胞外酶产量达17601.3 U/mL。应用AlphaFold2对该酶的三维结构进行预测,结果表明,尽管β-甘露聚糖酶的2个位点(I91N 和 L211I)位于催化中心之外,但在很大程度上影响酶活性。β-甘露聚糖酶ManBl (I91N/L211I)水解魔芋胶产物主要由甘露六糖、甘露三糖和甘露二糖组成。该研究首次报道I91N/L211I 2个位点联合突变能够提高β-甘露聚糖酶活性；ManBl (I91N/L211I)食品级表达,为该酶绿色安全地应用奠定了基础。     

甘露聚糖酶促进纤维素酶水解转化马尾松聚糖至可发酵单糖

由于形态结构和化学组成等原因,针叶材原料利用纤维素酶水解法转化聚糖至可发酵单糖一直存在着难水解、总糖转化率低的问题。采用硫酸盐(KP)蒸煮联合氧脱木素和机械打浆对马尾松木片进行预处理,基于针叶材原料中含有较多的甘露聚糖的特点,研究在纤维素酶水解预处理后的浆料过程中添加甘露聚糖酶对酶解效率的影响。研究结果显示,添加甘露聚糖酶对纤维素酶水解具有促进作用,其作用效果因原料预处理方法和程度的不同而不同。KP蒸煮后再经氧脱木素或打浆处理,则甘露聚糖酶对纤维素酶水解的促进作用比单独KP蒸煮效果更加明显。当KP蒸煮至样品木素含量相对于原料为4.1%时,再对原料进行氧脱木素,将木素含量降至相对于原料为1.9%时,分别用10 FPU/g和15FPU/g的复合纤维素酶CTec2对预处理后的样品进行酶解,酶解总糖得率分别为66.0%和83.6%;添加5U/g甘露聚糖酶,上述样品酶解总糖得率分别提高至70.6%和89.2%;相对于原料中聚糖含量,上述条件下酶解总糖转化率分别为53.9%和68.1%。纤维素酶水解至3小时左右再添加甘露聚糖酶,其促进纤维素酶水解效果更好。     

瓜尔胶酶解法制备半乳甘露低聚糖及其产物表征

用β-甘露聚糖酶水解瓜尔胶制备了半乳甘露低聚糖(Galacto-mannan-oligosaccharides,GMOS),用时间飞行质谱(MALDI-TOF)、13CNMR表征了产物结构.以底物酶解率为指标,通过L16(43)正交实验,确定在底物质量分数为0.3%、50℃下的最佳酶解条件为:pH值7.0、酶解时间10 h、加酶量40 U·(g瓜尔胶)-1.MALDI-TOF 质谱分析证明,GMOS主要由2～10个单糖组成;13CNMR分析证明,GMOS主链的D-甘露糖基C6上通过糖苷键连接有1个半乳糖残基支链.     

半乳甘露聚糖的提取纯化、结构特征以及应用研究进展

半乳甘露聚糖是中性多糖,具有优异的增稠、稳定和胶凝能力,广泛应用于食品、制药、生物医学和化妆品行业。有关半乳甘露聚糖的研究文献近年来逐渐增多,对半乳甘露聚糖的提取纯化技术、结构特征以及应用等方面进行了总结和概括,为半乳甘露聚糖的进一步深入研究和产品开发提供了参考。     

温度对β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中表达的影响

β-甘露聚糖酶已经广泛的在毕赤酵母中异源表达,为了提高β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的产量,本文研究了培养温度对β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中表达的影响。通过比较不同温度下β-甘露聚糖酶在转录和蛋白表达水平的差异,发现降低温度虽然降低了mRNA表达量,但是外源蛋白得到积累增加;降低培养温度可以显著提高重组菌株的活性,从而减少细胞死亡带来的胞内蛋白酶的释放,最终使得低温下发酵液中的蛋白酶活力显著下降。研究结果表明降低培养温度能显著提高β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的表达量。     

羟基-炔点击化学改性半乳甘露聚糖薄膜的制备及性能研究

以植物源半乳甘露聚糖(GM)为原料，1-苯基-2-丙炔-1-酮(PPK)为醚化试剂，通过绿色高效的羟基-炔点击化学改性技术，成功地在室温条件下制备得到兼具优异力学性能、疏水性能和紫外屏蔽性能的半乳甘露聚糖苯丙基烯酮醚(GMPPK)薄膜。结果表明：羟基-炔点击化学可以实现GM表面羟基的高效醚化。与未改性的GM薄膜相比，由于PPK分子的引入，GMPPK薄膜表现新的紫外屏蔽性(GMPPK2在275 nm处的屏蔽率高达98.86%)、疏水性(水接触角从74.9°增加至96.5°)和耐水溶胀性。此外，随—OH∶PPK的反应摩尔比增加，GMPPK2薄膜的力学性能进一步增加，其拉伸应力为44.7 MPa，韧性为1.7 MJ/m³，杨氏模量为25.3 MPa，分别是未改性GM薄膜的2.2倍、1.9倍和2.4倍。研究结果可为开发高性能半乳甘露聚糖包装薄膜材料的应用研究奠定理论基础。     

β-甘露聚糖酶催化水解栀子苷制备京尼平

京尼平是一种环烯醚萜类天然生物交联剂,具有降血糖、调血脂、保肝利胆等生物活性。天然存在的京尼平较少,且质量分数约为0.005%~0.01%。采用β-甘露聚糖酶催化水解栀子苷制备京尼平的工艺路线,通过单因素实验、正交实验确定了β-甘露聚糖酶水解栀子苷的最佳工艺条件:p H为4.5,温度为50℃,底物与酶质量比例1∶2,时间为1 h,产率高达84.49%,纯度达到80%以上。该方法安全、快速、可靠,是一种生产京尼平的新途径。     

地衣芽孢杆菌中性β-甘露聚糖酶的分离纯化

采用絮凝、超滤及离子交换对地衣芽孢杆菌中性β-甘露聚糖酶进行了分离纯化,纯化倍数为33倍,酶活收率达42%,所得纯化的β-甘露聚糖酶比活为4341 U/mg蛋白质.本文提出的分离纯化工艺易于工业放大.     

中性β-甘露聚糖酶分批发酵动力学研究

以魔芋粉为碳源,研究了10 L自控发酵罐中枯草芽孢杆菌TJ-200603分批发酵产中性β-甘露聚糖酶的过程动力学。实验数据表明,菌体生长呈现典型S型曲线,而酶的合成与菌体生长同步进行,属于生长耦联型。基于这些过程曲线的变化规律,构建了β-甘露聚糖酶分批发酵过程的动力学模型。并经非线性拟合和优化,获得了最佳的模型参数值,最终确定了能够较好表征实际发酵过程中菌体细胞生长、产物β-甘露聚糖酶合成以及基质总糖消耗的3个动力学方程。     

地衣芽孢杆菌发酵生产b-甘露聚糖酶的代谢通量分析

基于代谢通量分析理论研究了地衣芽孢杆菌生物合成b-甘露聚糖酶的胞内代谢活动. 首先构建了地衣芽孢杆菌产b-甘露聚糖酶的代谢网络,并依据代谢物质量平衡原则建立了反应网络的代谢流模型;进一步采用线性规划的优化方法分别以b-甘露聚糖酶合成反应通量最大和菌体生长速率最大为目标函数对模型进行求解,由此计算得到b-甘露聚糖的最大理论转化率为57.87%. 最后对代谢网络中的5个关键节点进行了比较分析,得到了2个类似非刚性的代谢节点(5-磷酸核酮糖节点和草酰乙酸节点),为利用基因工程方法提高b-甘露聚糖酶的生产能力提供了理论依据.     

羧甲基半乳甘露聚糖的制备及表征

通过对半乳甘露聚糖(GG)进行羧甲基化改性,制备出不同取代度的羧甲基半乳甘露聚糖,并确定其最佳工艺条件。采用Box-Behnken设计对影响羧甲基产物取代度的3个相关因素进行研究,建立此三因素对羧甲基产物取代度影响的二次回归模型,优化得到最佳制备条件是:NaOH与GG的质量比为2、醚化温度为65℃、醚化时间为6. 5 h,并利用扫描电镜、红外光谱、X射线分析等对制得样品进行表征,结果表明,成功制备得到羧甲基半乳甘露聚糖,取代度为0. 44。     

生物酶破胶剂产生菌的物理诱变及酶学性质研究

为了提高生物酶破胶剂β-甘露聚糖酶的活性,以产β-甘露聚糖酶的Bacillus subtilis W为出发菌株,经紫外线照射35～40s,酶活提高了8.63%;再经60Co诱变酶活提高了11.3%。粗酶液的最适p H值是6.2,最适温度是60℃,盐浓度在10%以下有促进酶促反应的作用。     

水溶性多糖酶解过程分子量变化与动力学建模

以魔芋葡甘聚糖-β-甘露聚糖酶水解体系为例,研究了水溶性多糖酶解过程中产物的分子量变化与动力学行为.利用凝胶排阻色谱法和特性粘度法,分别测定了酶解物的分子量分布和重均分子量(-Mw),结果表明:随着反应的进行,酶解物分子量分布先变宽再逐渐变窄,这是由酶在底物反应体系中的镶嵌式分布,不均一的底物分子序列结构与酶分子的选择性剪切,酶剪切的多种途径以及酶与底物的结合模式等四种因素共同作用的结果;初始阶段酶解物(-Mw)先快速下降再逐渐趋于平缓,其速率与底物浓度有关;基于酶解产物重均分子量变化规律而建立的(1/-Mw)随反应时间t变化的动力学模型,确定了常见的水溶性多糖浓度下酶解过程为零级降解,并与实验结果相当一致.     

双水相萃取直接从枯草芽孢杆菌发酵液中提取β-甘露聚糖酶

研究了聚乙二醇(PEG)平均相对分子质量、PEG浓度、(NH4)2SO4浓度、NaCl浓度对β-甘露聚糖酶和总蛋白分配系数、相体积比和萃取率的影响。实验表明PEG100020%(m/m)和(NH4)2SO415%(m/m),NaCl为2%(m/m)组成的双水相体系,室温下直接对含菌体的枯草芽孢杆菌发酵液抽提β-甘露聚糖酶,可纯化2.76倍,萃取率达98.79%。     

红酵母细胞壁中主要多糖含量和类胡萝卜素产量的相关性研究

对红酵母菌株不同培养条件下类胡萝卜素产量和红酵母细胞壁中主要多糖β-1,3-D-葡聚糖、甘露聚糖含量进行了分析.结果表明:当葡萄糖作为碳源、(NH4)2SO4作为氮源且添加量为10 g·L-1、培养时间为72 h、pH值为5时,类胡萝卜素产量、β-1,3-D-葡聚糖含量和甘露聚糖含量均达到最大值,分别为(14.98±0.12)mg·L-1、(38.89±0.21)%和(6.12±0.13)%.同时发现红酵母细胞壁中β-1,3-D-葡聚糖、甘露聚糖的含量与类胡萝卜素产量间均存在正相关关系,这表明类胡萝卜素合成代谢途径和这两种多糖的合成代谢途径间存在一定的关系.     

兴安落叶松阿拉伯糖基半乳聚糖化学结构的研究

木粉在室温下用冷水所得到的提取液，经离心除去沉淀后首先用聚酰胺柱纯化，然后再用乙醇沉淀而制得高纯度阿拉伯糖基-半乳聚精（AG），HPLC分析表明AG聚糖D-半乳糖和L-阿拉伯糖组成，其摩尔比为7．41：1。高碘酸盐消耗为1．12摩尔，甲酸生成量为0．53摩尔，数值与文献值基本一致。13C－NMR研究表明：AG聚糖主链由1～3连接的β-D-吡喃型半乳糖基构成，每个主链半乳精基C—6上有两个或一个1-6连接的β-D-吡喃型半乳糖基和3（2）-O-α－L-呋喃型拉伯糖基-L-呋喃型阿拉伯糖。     

表面活性剂辅助重组蛋白质复性

以重组人溶菌酶（rhLys）与重组β-甘露聚糖酶（rMan）为体系,综合采用活性测定、非还原性SDS-PAGE以及荧光发射光谱分析等方法研究了十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、CTAB与β-环糊精（β-CD）组成的人工分子伴侣以及其他种类复性助剂对重组蛋白质复性过程的影响.结果表明CTAB及人工分子伴侣均可有效地辅助rhLys复性,且rhLys与鸡卵清溶菌酶（Lys）呈现出类似的复性过程特性;人工分子伴侣可显著地提高rMan在高浓度下的复性率;表面活性剂带电性质、表面活性剂与蛋白质的摩尔比以及变性蛋白质的浓度等是影响复性率及复性产品分布的主要因素.这些结果对于此类复性技术应用于重组蛋白体系时的工艺选择和优化提供了重要的依据和参考.     

响应面法优化费氏新萨托菌G5产β-甘露聚糖酶

采用响应面法对费氏新萨托菌G5产β-甘露聚糖酶发酵过程进行优化分析。在单因素实验的基础上选取8个因素,采用Plackett-Burman法进行筛选,确定NaCl和CaCl2浓度对β-甘露聚糖酶产量影响较大。用最速上升实验和中心组合实验进一步优化,利用Design-expert软件进行二次回归分析,得到最适宜发酵培养基配比为：瓜尔胶13.0 g/L,蛋白胨11.0 g/L,酵母粉5.0 g/L,MgSO4 1.0 g/L,KH2PO4 0.5 g/L,NaCl 0.6 g/L,CaCl2 0.6 g/L,pH值为4.0,此时酶产量为采用初始培养基发酵时酶产量的2.5倍。