新城疫病毒F48E8株HN基因的克隆和序列分析及与国外NDV HN基因的同源性比较

目的 克隆NDV F48E8株HN基因,与国外NDV HN基因进行比较分析。方法 提取RNA,应用RT－PCR一次性扩增出NDV F48E8株的全长HN基因,将该HN基因插入pKS(-)后进行克隆并测序。结果 NDV F48E8株的HN基因核苷酸长度为1713bp,编码571个氨基酸,有5个糖基化位点,12个极保守的半胱氨酸残基,与国外发表的NDV序列相符。结论 NDV F18E8株HN蛋白基因与国外性遥NDV HN蛋白基因核苷酸同源性在83.3%-89.2%之间,的氨基酸同源性在87.6%-91.1%之间。     

中国狂犬病疫苗CTN-1-V株糖蛋白基因的克隆及序列分析

目的 研究CTN-1-V株糖蛋白(GP)基因结构特性。方法 利用RT-PCR反应从感染CTN-1-V病毒的Vero细胞中获得精蛋白全长cDNA片段,并克隆至PCR2.1载体,进行序列测定。结果 CTN-1-V株糖蛋白cDNA序列长度为1 575个核苷酸,编码524个氨基酸。与国外已测定的相应序列进行同源性比较,其核苷酸同源性为80.8％～92.4％,氨基酸同源性为82.9％～93.3％。结论 进一步了解CTN-1-V株的基因结构,为筛选特异性疫苗株提供理论依据。     

口蹄疫病毒衣壳蛋自前体P1基因和蛋白酶3C基因的克隆及序列分析

［摘 要］目的 对口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因进行PCR扩增、克隆和序列分析，了解FMDV基因型与血清型的相关性及分子免疫机理，便于疫苗株的选择。方法 应用RT－PCR方法扩增了 CC－1毒株的衣壳蛋白前体 P1基因和蛋白酶 3C基因，并将其克隆到pGEM-T easy载体上，分别构建含有P1基因和3C基因的两个重组质粒pGEMP1和pGEM3C，并进行核苷酸序列分析。结果CC-1株与相同血清型毒株P1基因核苷酸序列和氨基酸序列存在较高的同源性，与不同血清型毒株P1基因氨基酸序列的同源性差异显著，而不同血清型毒株的蛋白酶3C基因氨基酸序列的同源性均在 90％以上。结论 成功地克隆了 FMDV P1区基因和蛋白酶3C基因，为选择口蹄疫病毒疫苗株提供了背景材料。     

新分离5株狂犬病病毒街毒株N和G基因的序列分析

目的分析我国新分离的5株狂犬病病毒(RV)街毒株基因序列及分子流行病学状况。方法采用RT-PCR法从疑似狂犬的犬脑组织内获得N和G基因cDNA的全序列并进行测序,将所得结果与已发表的国内外代表性毒株相应基因进行核苷酸和推导氨基酸序列比较。结果5株均含有完整N基因序列,3株含有完整G基因序列。与国内外发表的部分毒株比较,5株街毒N基因的核苷酸同源性在98.1%～99.9%之间,推导氨基酸同源性在99.5%～100%之间。将5株街毒与人用疫苗株3aG、PV株的N基因进行比较,核苷酸同源性在86.2%～86.7%之间,氨基酸同源性在95.1%～95.5%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在89.4%～89.6%之间,氨基酸同源性在98.2%～98.6%之间。3株街毒G基因的核苷酸同源性在98.5%～99.4%之间,推导氨基酸同源性在99.6%～100%之间。将3株街毒与人用疫苗株aG、PV和兽用疫苗株ERA的G基因进行比较,核苷酸同源性在82.8%～83.1%之间,氨基酸同源性在88.0%～90.1%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在86.7%～87.1%之间,氨基酸同源性均为92.0%。结论新分离街毒株基因未发生较大变异,与CTN的同源性高于与aG株和PV株。     

鹅细小病毒VP3基因的克隆及序列分析

目的克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)黑龙江各分离株和疫苗株的VP3基因,并进行序列分析,为小鹅瘟的诊断与防治奠定理论基础。方法根据GenBank中登录的GPV B株全基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增、克隆VP3基因,并进行测序和同源性分析。结果克隆的VP3基因大小699 bp,编码233个氨基酸;7个分离株的VP3基因核苷酸序列同源性为99.4%～100%,各分离株与疫苗株的核苷酸序列同源性为98.7%～99.3%,与标准B株的核苷酸序列同源性为97.6%～97.7%,与MDPV核苷酸序列的同源性为80.8%～81.7%;各分离株之间亲缘关系较近,其中QTH分离株与疫苗株亲缘关系最近,氨基酸序列同源性为97.8%,其他分离株与疫苗株的亲缘关系相对较远,氨基酸序列同源性为96.6%～97.4%;所有分离株和疫苗株与标准B株亲缘关系相对较远,与MDPV的亲缘关系最远。结论黑龙江省各分离株与疫苗株的核苷酸和氨基酸序列存在一定的差异。     

口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因的克隆及序列分析

目的 对口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因进行PCR扩增、克隆和序列分析，了解FMDV基因型与血清型的相关性及分子免疫机理，便于疫苗株的选择。方法 应用RT-PCR方法扩增了CC-1毒株的衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因，并将其克隆到pGEM-T easy载体上，分别构建含有P1基因和3C基因的两个重组质粒pGEMP1和pGEM3C，并进行核苷酸序列分析。结果 CC-1株与相同血清型毒株P1基因核苷酸序列和氨基酸序列存在较高的同源性，与不同血清型毒株P1基因氨基酸序列的同源性差异显著，而不同血清型毒株的蛋白酶3C基因氨基酸序列的同源性均在90%以上。结论 成功地克隆了FMDV P1区基因和蛋白酶3C基因，为选择口蹄疫病毒疫苗株提供了背景材料。     

中国流行株HIV-1Gag与IFN-α2b重组质粒的构建与实验免疫研究

目的探讨中国流行株 ＨＩＶ－ １Ｇａｇ与 ＩＦＮ－ α２ｂ共表达重组核酸疫苗质粒的免疫效果。方法以 核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ为表达载体,构建重组核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１－Ｇａｇ、ｐＩＲＥＳ１－Ｇａｇ－ＩＦＮ,通过间接免疫荧光 试验、ＤｏｔＥＬＩＳＡ检测Ｃａｇ／ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６基因的表达产物。另将此重组核酸疫苗质粒免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,进行淋巴细 胞转化试验、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞数量测定、细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）特异性杀伤作用检测及血清抗体检测。 结果构建的重组质粒转染ＢＨＫ细胞后可表达目的基因,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖,诱导特异性 ＣＴＬ反应,当和 ＩＦＮ－α２ｂ共表达时免疫效果更加显著。结论与 Ｇａｇ蛋白共表达的 ＩＦＮ－ａ２ｂ能够进一步提高细胞 免疫与体液免疫水平,构建的重组质粒为ＨＩＶ－１ＤＮＡ疫苗的研究奠定了一定实验基础。     

水泡性口炎病毒核蛋白基因的克隆和序列分析

目的　对水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因进行PCR扩增、克隆和序列分析。方法　将水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因片段克隆至pMD18 T载体中 ,构建N基因重组质粒载体。进行PCR及限制性内切酶分析 ,筛选获得N基因插入的阳性克隆。经核苷酸序列分析 ,并与Genbank中的VSV编码核衣壳蛋白N基因序列进行比较。结果　该序列与VSVNewJersey型的 0 9/ 82 HD B株同源性最高 ,核苷酸和推测氨基酸的同源性分别为 98.9%和 98.8% ,有 13个核苷酸差异 ,伴有 5个氨基酸改变 ,第 72位的酪氨酸变为组氨酸 ,第 89位的缬氨酸变为异亮氨酸 ,第 183位的天冬氨酸变为天冬酰胺 ,第 2 0 5位的苯丙氨酸变为亮氨酸 ,第 4 18位的丙氨酸变为缬氨酸 ;与In diana型各株的同源性较低 ,与Glasgow株相比 ,核苷酸和氨基酸的同源性分别为 6 7.9%和 71.6 %。结论　已成功地克隆了水泡性口炎病毒N基因 ,为水泡性口炎免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础     

淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒核蛋白合成基因的表达及应用

目的 用合成基因表达产物取代淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（ＬＣＭＶ）或其他方法重组蛋白抗原, 用于ＬＣＭＶ感染的诊断。方法 采用Ｐｒｏｓｉｓ软Ｓ件对ＬＣＭＶ核蛋白（Ｎｐ）全长氨基酸序列进行亲疏水性分析,合成ＬＣ－ ＭＶ ｓＲＮＡ第１８１６－２１７８位核苷酸序列编码的Ｎｐ第３８０～５００位氨基酸基因,克隆在Ｈｉｓ－ｔａｇ ｐＥＴ－２８ａ融合表达,表 达产物经固定化金属配体亲和层析纯化,建立ＥＬＩＳＡ检测试剂。结果 表达产物主要以包涵体形式存在,表达量 达２０％以上。表达产物经Ｎｉ－ＮＴＡ－Ａｇａｒｏｓｅ纯化后纯度达到９０％以上。经检测９３份人血清．有６份病毒抗体阳 性,阳性率为６．５％（６／９３）,与全病毒抗原检测结果７．５％（７／９３）相近。结论 用合成基因表达产物取代ＬＣＭＶ抗原 检测病毒抗体,不仅可以消除病毒传播可能,而且特异性强。为ＬＣＭＶ感染诊断及生物材料质量控制提供有效方 法。     

类胰岛素生长因子I(IGF-I)基因的克隆及融合蛋白的表达

目的 扩增类胰岛素生长因子Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）２１０ｂｐ的ＤＮＡ片段,将其克隆到ＰＧＥＸ－１ λＴ质粒,并转化到 Ｅ．ｃｏｌｉ　ＮＨ５２２中高效表达。方法 用改进的ＲＴ－ＰＣＲ法合成人肝脏ｃＤＮＡ,然后从该ｃＤＮＡ文库中扩增出ＩＧＦ－Ｉ基 因。将扩增的ＩＧＦ－Ｉ ｃＤＮＡ用 ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲ　Ｉ双酶切后,插入到同样双酶切处理的ｐＧＥＸ－１λＴ载体中,连接转化 Ｅ． ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２,筛选克隆,酶切鉴定后,进行了核苷酸序列分析及表达。结果 将ＩＰＴＧ诱导表达的菌体离心收集,经 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,在相对分子质量３４０００处可见明显高表达带,表达量可占菌体蛋白总量的２０％以上。免疫印迹表 明重组蛋白具有ＩＧＦ－Ｉ的抗原性。结论　重组人ＩＧＦ－Ｉ的成功克隆与表达,将为进一步研究人ＩＣＦ－Ｉ的生物学特性 打下基础。     

新城疫病毒F_(48)E_8株 HN基因在杆状病毒系统中表达

目的 采用新型杆状病毒表达系统(Bac to Bac系统)在昆虫细胞Sf-9中进行新城疫病毒F48 E8株HN基因表达。方法NDV F48 E8株 HN基因插入到转座载体 pFast Bac Ⅰ,构建重组转座载体 pFast HN,转化到感受态细胞 DH10后,将目的基因转座到穿梭载体Bacmid中,经筛选获得重组Bacmid HN转染到Sf-9昆虫细胞,并进行检测。结果 表达产物经SDS-PAGE、Westem blot检测获得蛋白特异带,相对分子质量约63000。结论NDVF48E8株HN基因能通过新型杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf-9中进行表达,表达量约为细胞总蛋白的10％。     

新城疫病毒TL1株F、HN蛋白基因共表达对细胞融合的影响

目的分析新城疫病毒TL1株F、HN蛋白基因共表达对细胞融合的影响。方法在6孔细胞培养板上将4种重组表达质粒以pCI-M+pCI-NP+pCI-F和pCI-M+pCI-NP+pCI-F+pCI-HN两种组合分别共转染BHK-21细胞,转染后48h,光镜观察细胞融合现象。在25cm2细胞培养瓶中,将4种重组表达质粒以上述两种组合分别共转染BHK-21细胞,转染后48h,收集细胞上清,离心后,电镜观察有无病毒样颗粒。结果以pCI-M+pCI-NP+pCI-F+pCI-HN组合共转染BHK-21细胞,可以观察到明显的细胞融合现象,而以pCI-M+pCI-NP+pCI-F组合共转染的BHK-21细胞则未出现细胞融合现象。两种组合共转染均形成了新城疫病毒样颗粒,包含HN蛋白基因的4种重组质粒组合共转染形成的病毒样粒子更接近于真实的新城疫病毒粒子。结论HN蛋白基因具有促进细胞融合的功能,新城疫病毒样颗粒的成功表达为新城疫病毒致病机理和新型疫苗的研究奠定了基础。     

新城疫病毒TL1株L基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的对新城疫病毒TL1株L基因进行克隆、序列分析及真核表达载体构建。方法根据GenBank登录的新城疫病毒L基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR对内蒙古分离株TL1的L基因进行整体扩增。将扩增产物提纯后,克隆入pGEM-Teasy载体,再亚克隆至真核表达载体pCI-neo上,通过酶切、PCR鉴定及测序进行验证。结果测序拼接得出L基因的全序列长度为6704bp,该基因的ORF总长为6615bp,编码2204个氨基酸。与GenBank登陆的12株参考毒株比较L基因编码区全核苷酸序列和氨基酸序列,发现TL1株与鹅源新城疫NA-1株、ZJ1株和SF02株的同源性极高,说明四者亲缘关系较近。结论已成功构建L基因真核表达载体,为对该株病毒进行反向遗传操作以及有关功能基因组研究奠定了基础。     

人3型副流感病毒HN基因的克隆、表达及其免疫原性

目的克隆人3型副流感病毒(HPIV-3)HN基因,构建原核表达质粒,并检测表达蛋白的免疫原性。方法从呼吸道感染患儿呼吸道分泌物中提取HPIV-3RNA,用套式RT-PCR扩增HN基因,克隆至pGEM-T载体上,进行核苷酸序列分析,并用生物信息软件分析HN蛋白的二级结构,构建截短的HN基因原核表达载体pET-28a-HN,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达蛋白经SDS-PAGE和Western blot检测后,进行纯化和复性。并以此蛋白免疫昆明小鼠,检测小鼠血清中HN抗体效价。结果扩增出的HPIV-3的HN基因核苷酸序列与参考序列的同源性为95%,氨基酸序列同源性为97%,有16处发生了突变。截短的HN基因的原核表达载体经酶切鉴定及测序,证明构建正确。重组HN蛋白的表达量占菌体总蛋白的30%以上,且具有良好的反应原性。复性的重组HN蛋白免疫的小鼠可产生高效价的抗HN抗体。结论原核表达的截短的HN蛋白具有良好的免疫原性,能够刺激小鼠产生较高水平的抗体应答。     

新城疫强毒株F蛋白裂解位点串联基因的构建及其原核表达

目的构建鸡新城疫(ND)强毒株多裂解位点串联基因表达载体,为建立NDV强弱毒株的ELISA鉴别方法奠定基础。方法人工合成一段包含4种不同NDV强毒株裂解位点的基因Fe(F prote in multitude epi-position),其中各裂解位点之间用Linker(GGGGS)使其串联,然后进行2倍和4倍拷贝,并定向克隆至原核表达质粒pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a(+)/2Fe和pET-28a(+)/4Fe,进行表达和Western blot鉴定。结果构建的原核表达重组质粒pET-28a(+)/2Fe和pET-28 a(+)/4Fe测序正确。Western blot检测结果表明,2Fe、4Fe蛋白均与新城疫强毒株F48E9阳性血清呈阳性反应,而与新城疫弱毒株V4阳性血清呈阴性反应。结论已成功构建NDV强毒株F蛋白裂解位点串联基因表达载体,为建立NDV强弱毒株的ELISA鉴别方法提供理论依据。     

NA-1株鹅源副粘病毒M、F和HN蛋白基因的真核表达

目的获得鹅源副粘病毒(GPMV)NA-1株M、F和HN基因真核表达蛋白。方法将NA-1株GPMV经SPF鸡胚增殖、纯化,提取病毒基因组RNA。参考GenBank登录的NA-1株GPMV基因组序列,设计3对特异性引物,利用RT-PCR法,分别扩增M、F和HN基因开放阅读框(ORF),将目的基因克隆至pMD18-T-Simple载体,并进行酶切和序列测定。将目的片段克隆至pCI-neo表达载体,酶切鉴定正确的重组质粒,分别命名为pCI-M、pCI-F和pCI-HN。将重组表达质粒分别转染Vero细胞,用间接免疫荧光试验鉴定目的蛋白的表达。结果RT-PCR法分别扩增出M、F和HN基因,大小与预期一致。克隆载体及表达载体酶切及测序鉴定正确;重组真核表达质粒转染Vero细胞后,荧光显微镜下可见特异性荧光。结论利用pCI-neo真核表达载体在Vero细胞中成功表达了NA-1株GPMV M、F和HN基因,为下一步研究该病毒的出芽机制以及各结构蛋白的功能奠定了基础。     

流行性腮腺炎病毒疫苗株WM84六代次基因序列分析

目的分析6个代次流行性腮腺炎病毒疫苗株WM84融合蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)和疏水蛋白(SH)的基因序列,并与Jery-Lynn(JL)株和ME株进行比较。方法WM84株病毒在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传代至12代,观察各代病毒的培养特性,测定2、7、9、10、11、12代主要结构蛋白基因及高变区SH基因序列,与GenBank中参考毒株JL2、JL5和ME株进行比对,分析其核苷酸序列及相应氨基酸序列的差异,并构建系统进化树。结果WM84株病毒在CEF上连续传代至12代,其培养特性及病毒滴度基本稳定。与WM84株2代相比,其各代在主要蛋白基因区域有散在的核苷酸变化。7～12代病毒HN、F和SH基因与2代相比,核苷酸同源性分别为97.0%～100%、97.0%～100%及94.0%～100%;氨基酸同源性分别为98.3%～100%、97.2%～100%及94.1%～100%。2～7代病毒,HN、F和SH基因氨基酸与JL2株同源性为98.8%～99.5%,与JL5株同源性为94.1%～98.3%,传至11、12代,与JL5株同源性达99.8%～100%。结论WM84株2～7代病毒蛋白基因与JL2株十分相似,但在后续传代过程中出现了JL2株向JL5株转化的倾向。WM84株病毒在传代过程中HN及F基因结构基本稳定。     

新城疫病毒自然宿主细胞膜受体的鉴定

目的鉴定鸡源副黏病毒F48E9株的自然宿主细胞膜受体。方法采用蛋白膜提取试剂盒提取鸡胚成纤维细胞膜蛋白,用改进的间接ELISA方法检测鸡源副黏病毒分离株F48E9与细胞膜的结合活性,利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)鉴定新城疫病毒(NDV)的自然宿主细胞膜受体。结果NDV与鸡胚成纤维细胞膜有很强的结合力,在转印鸡胚成纤维细胞膜蛋白的PVDF膜上有几条明显的疑似受体条带,相对分子质量介于35000～60000之间。结论初步鉴定了NDV自然宿主细胞膜的受体,其疑似受体蛋白的性质及在新城疫病毒致病中的作用尚有待进一步研究。     

在大肠杆菌K99(中国QH株)菌毛形成亚单位基因(fanC)的克隆和测序中发现IS1 插入序列

目的 构建大肠杆菌K99菌毛表达载体。方法 通过逐级亚克隆的方法克隆k99菌毛形成亚单位基因（fanC），并进行序列测定和fanC亚单位的抗原决定簇模拟，以确定突变部位。结果 克隆了包括K99菌毛形成亚单位基因（fanC）和部分fanD基因在内的一段基因，该基因与国外报道相比明显偏大。序列测定表明：在fanC尾部多出 24bp，在fanC与 fanD，的结合部有一 800bp左右的新基因。经与基因库中大肠杆菌基因作同源性比较发现，该新基因为768bp的插入序列IS1。其他基因为K99自身fonC与fanD片段之间的过渡基因。IS1的插入未改变fanD，基因的阅读框架，只是使fanD片段末端增加了 8个氨基酸。fanC亚单位的抗原决定簇模拟结果显示，K99 fanC片段具有一个非常突出的亲水区域，根据经验它应是抗原决定簇所在的部位。结论 首次发现大肠杆菌K99基因中含有插入序列IS1。     

口蹄疫病毒WFL株2C-P3-3′NCR片段的克隆及适于设计siRNA的序列分析

目的筛选出口蹄疫病毒(FMDV)基因组上适于设计siRNA的基因片段。方法以FMDV WFL株RNA为模板,用3′RACE法扩增出2C-P3-3′NCR序列,将PCR扩增片段克隆到pMD18-T载体上,转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,进行序列测定,并与参考毒株序列比较。结果扩增的基因片段大小为4033bp,其2C、P3和3′NCR序列的核苷酸序列与参考毒株的同源性分别为87·11%～94·23%、84·91%～96·66%和66·98%～82·35%,2C和P3与参考毒株的氨基酸同源性分别为94·97%～99·39%和91·84%～98·55%,WFL株P3基因的第1150～1270、1680～1840和2080～2490bp以及2C基因的第354～470bp范围内与参考毒株具有高度保守的特性。因此,可以依据siRNA设计原则,在这4个区域内筛选抑制效果好的siRNA。结论成功克隆了FMDV WFL株2C-P3-3′NCR基因的序列,并筛选出4个适于设计siRNA的基因区段。