人血白蛋白琼脂培养基在A、C、Y、W_(135)群脑膜炎球菌培养中的应用

目的比较A、C、Y、W_(135)群脑膜炎球菌冻干菌种在羊血琼脂培养基和人血白蛋白琼脂培养基中的复苏培养效果,为人血白蛋白琼脂培养基代替羊血琼脂培养基进行复苏培养提供依据。方法将A、C、Y、W_(135)群脑膜炎球菌冻干菌种分别接种至羊血琼脂培养基和人血白蛋白琼脂培养基中,待长满琼脂培养基后转至相同体积、相同成分的基础培养基中,培养过程中取样测定A600。结果 A、C群脑膜炎球菌在人血白蛋白琼脂培养基中复苏培养效果优于羊血琼脂培养基,而Y、W_(135)群脑膜炎球菌在人血白蛋白琼脂培养基与羊血琼脂培养基复苏培养中效果相当。结论人血白蛋白琼脂培养基能够很好地应用于A、C、Y、W_(135)群脑膜炎球菌的复苏培养。     

流感嗜血杆菌的培养、检定及免疫血清的试制

用氯化血红素及辅酶I作为X、V因子来源、用心脑没液作为基础液制备的培养基，所试12个菌株6个血清型流感嗜血杯曲均生长良好，该培养基适于大量培养。应用该培养基培养新分离的三株流感嗜血杆菌，均生长良好，与b型血清产生凝集，属b型。采用死菌抗原（b～f型）及新鲜死菌加佐剂方法免疫（a型）健康家兔，获得较高抗体水平，每种抗原各制备三批血清，其抗体滴度基本上一致。     

AC群脑膜炎球菌与b型流感嗜血杆菌联合疫苗多糖含量免疫速率比浊检测方法的建立及验证

目的建立AC群脑膜炎球菌与b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)联合疫苗(Men AC-Hib)多糖含量免疫速率比浊检测方法,并进行验证。方法采用免疫速率比浊法测定联合疫苗中A群、C群脑膜炎球菌及Hib多糖含量,绘制不同多糖抗原含量的标准曲线,并对方法的检测低限、精密度、准确度和特异性进行验证。结果 3种不同多糖抗原浓度在2~8μg/ml之间具有良好的线性关系,相关系数均大于0.98;建立的方法检测A群、C群脑膜炎球菌和Hib多糖的检测低限分别为0.847、0.043和0.507μg/ml;检测各组分多糖抗原含量的批内和批间变异系数均小于5%,平均回收率在88.30~104.40%之间;各组分特异性多糖抗体仅与各自多糖抗原反应,且各组分多糖抗原共同存在时无相互干扰。结论成功建立了准确、特异的AC群脑膜炎球菌与Hib联合疫苗的多糖含量检测方法。     

在无血清无蛋白培养基中培养Vero细胞

目的开发在无血清无蛋白培养基(PF)中培养Vero细胞的技术。方法在DMEM/F12培养基中添加酵母提取物和大豆水解物,配制成无血清无蛋白培养基。使用配制好的无血清无蛋白培养基,分别在玻璃、聚乙烯醇缩丁醛(PVB)和聚苯乙烯(PS-TC)培养面上培养Vero细胞,观察细胞生长情况,并绘制细胞生长曲线,以含血清培养基BM为对照。结果与BM培养基比较,在玻璃培养面上,PF培养基不支持Vero细胞生长和分裂;在PVB培养面上,PF培养基支持Vero细胞生长,但不支持分裂;在PS-TC培养面上,PF培养基支持Vero细胞的生长和分裂。结论在PS-TC培养面上,PF培养基适合培养Vero细胞。     

W_(135)和Y群脑膜炎球菌培养和多糖纯化

目的培养W135和Y群脑膜炎球菌及荚膜多糖的纯化。方法采用综合培养基代替半综合培养基在75L生物反应器中对两群脑膜炎球菌进行培养,研究培养基处方、发酵、多糖提取及纯化工艺。结果综合培养基可代替半综合培养基对两群脑膜炎球菌进行培养。在培养过程中补加葡萄糖溶液、优化搅拌速度及通气量均有利于两菌群生长;在多糖纯化过程中,通过对比试验选择25%乙醇沉淀核酸,2～8℃的酚溶液,萃取蛋白的次数控制在3～4次为好。结论所研制的综合培养基及多糖纯化的工艺具有较好的可行性,为四价脑膜炎球菌多糖疫苗的研制提供了试验基础。     

无血清培养基与含血清培养基培养CHO细胞的比较

目的对无血清培养基与含血清培养基培养CHO细胞进行比较。方法应用两种培养基采用小方瓶培养CHO细胞,观察细胞维持时间、培养过程的形态变化及对血凝效价的影响。结果应用无血清培养基(A)培养CHO-C28细胞虽然可维持细胞正常生长,但贴壁不好,逐渐降低(A)加量情况可得到相应改善。结论 目前无血清培养基尚不能完全取代含血清培养基用于培养CHO细胞。     

b型流感嗜血杆菌疫苗及新型疫苗或联合疫苗的免疫原性评价方法

b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza type b,Hib)是全球范围内引起3个月到5岁龄儿童肺炎、脑膜炎和败血症等严重疾病的重要病原菌。接种疫苗是唯一有效的预防和控制Hib引起疾病的公共卫生措施,将Hib结合疫苗纳入儿童常规免疫程序的国家,Hib发病率和携带率均明显降低。本文现对Hib疫苗种类、免疫学特性、临床效力以及Hib新型疫苗或联合疫苗的免疫原性评价方法作一综述。     

W135群脑膜炎球菌培养基优化

目的试验设计法优化W135群脑膜炎球菌培养基,以期提高荚膜多糖产量。方法配制流脑半综合培养基(1、2、3号)及改良TSB培养基,以W135群脑膜炎球菌为试验菌株,菌密度为响应值,采用全因子试验、最陡爬坡试验、中心组合设计及响应面分析试验对碳氮比进行优化,采用正交试验对硫酸镁、氯化钙、L-胱氨酸、氯化铵、谷氨酸钠、硫酸亚铁6种培养基添加成分进行筛选及优化。结果 1号流脑半综合培养基确定为基础培养基;葡萄糖及酸水解酪蛋白为影响菌密度的主效应因素,两者的最适浓度为7. 84和10. 04 g/L;培养基6种添加成分对W135群脑膜炎球菌生长影响作用大小依次为硫酸镁、L-胱氨酸、硫酸亚铁、氯化铵、氯化钙、谷氨酸钠。优化的1号流脑半综合培养基不仅成分更加简单,且提高了W135群脑膜炎球菌密度。结论优化的培养基增加了W135群脑膜炎球菌密度,为荚膜多糖产量的提高奠定了基础。     

A、C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗免疫学效果观察

目的观察A、C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌(Meningococcal group A&C/Haemophilus influenzae type b,ACHib)多糖结合疫苗的免疫原性。方法采用开放、完全随机、盲态观察的方法,将1 800名观察对象分为临床试验组和对照组,每组各900名,两组又按3个年龄段分为3～5、6～11和12～71月龄组。试验组仅经上臂三角肌肌内注射试验疫苗(ACHib多糖结合疫苗),对照组分别经左右上臂同时注射两种对照疫苗(A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗和Hib结合疫苗)。3～5月龄组免疫3针,每针间隔1个月;6～11月龄组免疫2针,每针间隔1个月;12～71月龄组免疫1针。分别于免疫前、全程免疫后30～35 d采集静脉血,分离血清,采用功能性抗体杀菌力法检测A、C群脑膜炎球菌血清杀菌抗体滴度,间接ELISA法检测Hib抗体水平,并计算抗体阳转率及抗体增长倍数。结果免疫后,3个年龄段的试验组与对照组血清A、C群脑膜炎球抗体和Hib抗体阳转率差异均无统计学意义(P>0.05)。3个年龄段试验组与对照组易感和非易感人群A、C群脑膜炎球菌抗体滴度差异均无统计学意义(P均>0.05),而试验组Hib抗体水平低于对照组,且差异有统计学意义(P<0.001)。结论 ACHib多糖结合疫苗具有良好的免疫原性,可作为上述3种病原菌的预防制剂推广使用。     

无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒工艺的建立

目的建立无血清培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株的工艺。方法分别采用VP-SFM和含5%牛血清DMEM于方瓶中培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株,比较无血清培养基培养不同代次Vero细胞间及无血清与含血清培养基培养Vero细胞间制备的狂犬病病毒滴度及效力。将2 g/L微载体cytodex-1加至250 ml spinner flask中,加入Vero细胞,37℃培养3 d,按MOI=0.02接种狂犬病病毒CTN-1V株,检测病毒收获液的病毒滴度及效力,每天显微镜下观察细胞生长情况,计算细胞比生长速率。结果无血清培养基培养不同代次Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度和效力差异无统计学意义(P0.05);无血清和含血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度差异无统计学意义(P0.05),但无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒效力明显高于含血清的培养基(P0.05)。搅拌瓶微载体系统培养Vero细胞制备狂犬病病毒,细胞贴壁均匀,生长良好,收获病毒液的平均病毒滴度为6.50 lg FFU/ml,平均病毒效力为6.77 IU/ml。结论初步建立了微载体系统无血清培养Vero细胞制备狂犬病病毒的工艺,为无血清规模化制备狂犬病疫苗奠定了基础。     

b型流感嗜血杆菌多糖间接竞争ELISA检测方法的建立

目的建立b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)多糖间接竞争ELISA检测方法,并进行验证及初步应用。方法以Hib多糖—酪胺结合物(PRP-Ty)作为包被抗原,待测PRP作为竞争抗原,与Hib抗血清反应,建立间接竞争ELISA检测方法。采用棋盘法确定最佳包被多糖抗原浓度及Hib抗血清稀释倍数,绘制标准曲线,并确定最低检测限;对建立的方法进行批内和批间精密性验证;取Hib发酵液,在培养温度、接种量等因素相同的情况下,分别将培养液初始p H调至6.0±0.02、7.0±0.02和8.0±0.02,培养不同时间取样,采用建立的方法检测培养液内PRP含量。结果 PRP-Ty的最佳包被浓度为1.25μg/ml,Hib抗血清的最佳稀释倍数为300倍。该方法检测的线性范围为6.25~200 ng/ml,最低检测限为6.25 ng/ml,回归方程为y=-23.12 x+99.62,R2=0.996。采用该方法分别重复检测3次高浓度(200 ng/ml)和低浓度(20 ng/ml)PRP多糖的变异系数(CV)分别为1.608%和3.344%;采用该方法及传统化学检测法分别检测6次同一批Hib成品分装疫苗的多糖,该方法检测结果的CV值为5.75%,传统化学法检测结果的CV值为1.98%,均符合要求;该方法检测不同初始p H培养液培养的Hib发酵液,培养时间为8 h左右时,PRP产量最高;当初始p H为8.0±0.02时,培养液内PRP含量增长最快,所达到的浓度最高。结论建立了Hib多糖间接竞争ELISA检测方法,该方法灵敏度较高,精密性良好,可应用于Hib多糖含量的定量检测。     

淋病奈瑟氏菌培养基和保护剂的研究

本文报告了淋病奈瑟氏菌生长培养基、糖发酵生化培养基、保存培养基和真空干燥保护剂的研究。应用27株淋病奈瑟氏菌进行试验表明,全部菌株在特殊蛋白胨血琼脂和多种蛋白胨血琼脂上24小时生长良好;26株菌在NGCM-1生化培养基中发酵葡萄糖产酸(96.3％),保存培养基在27℃可保存菌种30天左右,10％脱脂奶粉作为保护剂真空干燥菌种可保存20个月以上。     

Sf9细胞的高效扩增及类病毒颗粒高效自组装的培养工艺

目的优化SFX-Insect培养基及类病毒颗粒(virus like particles,VLPs)的自组装培养工艺,提高Sf9细胞的扩增效率及VLPs的自组装效率。方法以SFX-Insect培养基作为基础培养基,添加不同营养物(HyPep~(TM) 1510及葡萄糖),优化培养基。分别在摇瓶及WAVE生物反应器中培养Sf9细胞,同时补加不同倍数(1、2、5、8倍)的补料浓缩液,观察细胞培养效果;将重组戊型肝炎杆状病毒分别加入SFX-Insect及优化培养基培养的Sf9细胞中,分析目的蛋白表达量;根据细胞的不同生长阶段、接毒时是否补料及不同接毒MOI值,将优化培养基培养的Sf9细胞进行分组,分析各组细胞中目的蛋白的表达量并观察VLPs的形成。结果 SFX-Insect基础培养基中同时添加10 g/L葡萄糖和10 g/L HyPep~(TM)1510为Sf9细胞最佳培养基。优化培养基摇瓶培养Sf9细胞,活细胞密度高达2×10~7个/ml以上;在细胞对数生长中后期进行1及2倍补料可延长细胞平台生长期至20 d以上;将摇瓶培养的细胞放大至WAVE生物反应器中培养,密度高达107个/ml以上,且传代培养后,可维持10 d以上的平台生长期。优化培养基培养的Sf9细胞目的蛋白的表达量比SFX-Insect培养基提高了6倍;优化培养基培养Sf9细胞至对数生长中前期,进行补料接毒(MOI=2),VLPs的组装效率大幅提高,镜下可见形态均一的VLPs。结论成功优化了SFX-Insect培养基及VLPs的自组装培养工艺,提高了Sf9细胞的扩增效率及VLPs产量。     

Vero细胞无血清培养基的筛选及其培养流感病毒H5N1条件的优化

目的筛选适宜Vero细胞培养的无血清培养基,并优化其培养流感病毒H5N1的条件。方法取VP-SFM培养的Vero细胞(SFM-Vero),以增殖速率为指标,筛选无血清培养基[VP-SFM、EX-CELL~(TM) VERO、Virus Pro ~(TM) VERO、自制无血清培养基1(SFM-1)和2(SFM-2)];采用中心组合实验(Box-Behnken)优化SFM-Vero培养流感病毒H5N1的pH、TPCK-Trypsin浓度和病毒接种MOI。结果 Vero细胞在VP-SFM和自制SFM-1培养基中生长情况好于其他无血清培养基;H5N1病毒株能够感染无血清适应的Vero细胞;SFM-Vero培养流感病毒H5N1较优条件为:p H 7.64,TPCK-Trypsin浓度0.68μg/ml,MOI 0.01。在该条件下培养的流感病毒HA滴度可达768 HAU/50μl,为正常培养基培养的Vero细胞的2.33倍。结论筛选出适宜Vero细胞生长的无血清培养基,优化了流感病毒H5N1 Vero细胞适应株无血清培养的条件。     

用于丝状菌固态培养研究的膜培养技术

提出了一种改进的膜转移培养技术,并以盾壳霉(Coniothyrium minitans)的固态培养为例,从菌体生长、孢子产量及培养基中pH变化等方面对该培养技术的应用价值进行了分析与研究.结果表明,这种培养体系可以将菌丝体与培养基完全分开,但不影响菌体的正常生长与孢子形成;通过膜转移培养技术可将盾壳霉的孢子产量提高1.8倍以上;用浸有液体培养基的脱脂棉支撑体培养体系可达到与琼脂培养体系相同的研究目的,但其操作更为简单,更利于连续培养研究.这种培养体系在实验室条件下研究其他丝状菌的固态连续培养方面也具有很大的应用潜力.     

无血清培养MDCK细胞生产狂犬病病毒条件的初步优化

目的开发一种适应于MDCK细胞生长和狂犬病病毒生产的无血清培养基MDCK-SFM,并对MDCK细胞生产狂犬病病毒的条件进行初步优化。方法方瓶培养MDCK细胞,考察混合脂类、微量元素、氢化可的松、酵母抽提物和鱼胨水解物对MDCK细胞生长的影响。转瓶微载体批培养MDCK细胞,以获得细胞在不同培养基中的生长动力学。以不同的感染量(MOI)和感染时间(TOI)接种狂犬病病毒,确定MDCK细胞感染狂犬病病毒的最佳MOI与TOI。比较含10%NCS的DMEM、VP-SFM和MDCK-SFM培养基培养MDCK细胞生产狂犬病病毒的效果。结果混合脂类有利于细胞贴壁,酵母抽提物和鱼胨水解物可不同程度地促进MDCK细胞生长。以MDCK-SFM培养基培养的MDCK细胞最高密度可达14.3×105个/ml。在MOI=0.5、TOI=72h的条件下,可得到最高的病毒滴度。MDCK-SFM培养基培养MDCK细胞生产狂犬病病毒,可获得较高的病毒滴度(5.13lgFFU/ml)。结论MDCK-SFM培养基适于MDCK细胞生长和培养狂犬病病毒,且成本低,成分比较明确,在MDCK细胞高密度培养生产狂犬病疫苗方面具有较高的应用价值。     

培养基对小球藻Chlorella sp.KM-201305生长及产油的影响

研究了SE、BG11、BG11-N、BBM 4种培养基对小球藻Chlorella sp.KM-201305的生长、油脂积累的影响。结果发现,BG11-N培养基更有利于小球藻的快速生长,SE培养基更有利于小球藻对油脂的积累。培养10 d后,Chlorella sp.KM-201305在SE、BG11、BG11-N、BBM 4种培养基中的生物量分别为0.542 g·L~(-1)、0.641 g·L~(-1)、0.701 g·L~(-1)和0.534 g·L~(-1),BG11-N培养基中小球藻生物量最高;Chlorella sp.KM-201305在SE、BG11、BG11-N、BBM 4种培养基中的油脂含量分别为26.73%、24.97%、24.04%、25.44%,SE培养基中小球藻的油脂含量最高。不同的培养基对小球藻Chlorella sp.KM-201305的生长及产油都有显著影响,利于小球藻产油的条件会抑制小球藻的生长。     

环氧树脂废水耐盐菌株的筛选及其降解特性

取环氧树脂生产废水及城镇污水生化池中的活性污泥进行驯化,筛选出3株能在高盐度环境中生长良好的耐盐菌,并进行分子生物学鉴定,考察其生长曲线及降解特性。结果表明,3株耐盐菌株分别为X1产碱菌(Alcaligenes)、X2假单胞菌(Pseudomonas)、X3芽孢杆菌(Bacillus)。将该组合菌用于Fenton预处理后盐度为5%～8%的废水处理,3株耐盐菌株最佳投配比为V(X1)∶V(X2)∶V(X3)=2∶2∶3,最佳投加量为10%,pH为7,37℃条件下摇床反应时间24 h,COD去除率较高。     

培养基中氯化钠对百日咳杆菌CS株生长及百日咳毒素表达的影响

目的探讨培养基中氯化钠(Na Cl)对百日咳杆菌CS株生长及百日咳毒素(pertussis toxin,PT)表达的影响,确定最适PT表达的Na Cl加入方式。方法以MSS为起始培养基,补加不同浓度的Na Cl溶液,接种生产用百日咳杆菌Ⅰ相CMCC58003(CS株)后,分别于不同时间取样;分别于接种菌种后不同时间补加Na Cl至7.5 g/L,于培养结束时(39 h)取样;分别于接种菌种后0和25 h时补加Na Cl至7.5 g/L,培养不同时间取样。上述样品分别测定菌浓度及PT表达量。结果起始培养基中Na Cl浓度越高,细菌生长越缓慢,菌浓度增加时间也越长,起始培养基中Na Cl浓度为7.5 g/L时,培养上清中PT表达量最高,达6.61μg/ml,比对照培养基(MSS)提高了15.6%。培养过程中在25 h时补加Na Cl,培养结束时PT表达量最高,为8.64μg/ml,比对照培养基(MSS)提高了43.28%,比0 h时补加Na Cl提高了26.13%。在25 h时补加Na Cl后,细菌的菌浓度增长期比MSS培养基培养延长了2~3 h,比0 h时补加Na Cl缩短了1~2 h,菌浓度在培养的中后期明显高于0 h时补加Na Cl,PT表达周期与生长曲线基本平行,当细菌生长进入衰退期时,PT也随之开始逐步降解。结论在培养前期,可采用含2.5 g/L Na Cl的MSS培养基使菌体快速生长,当进入抗原PT表达期后,可通过补加Na Cl来提高PT转录活性,从而提高PT的产量。     

不同分子大小b型流感嗜血杆菌结合物免疫原性的比较

目的评价不同分子大小b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)结合物的免疫原性,确定结合物的最适分子大小。方法制备不同活化度的Hib多糖,分别与载体蛋白CRM197以胺还原法制备不同分子大小(K_D)的Hib结合物;此外,利用凝胶过滤层析分离Hib结合疫苗原液,收集K_D于0.05~0.25、0.25~0.45之间及大于0.45的结合物组分;分别免疫小鼠,采用间接ELISA法测定小鼠血清中抗Hib多糖IgG抗体滴度,以市售Hib疫苗作为对照。结果不同分子大小Hib结合物第2针及第3针免疫后,K_D0.35组与K_D0.01组诱导的抗体水平相当(P=0.166和0.882),显著高于K_D0.53组(P=0.008和0.031),也高于对照疫苗组;同样K_D0.25组第2针免疫后诱导的抗体滴度也显著高于K_D0.48组(P=0.037)。不同分子大小片段的Hib结合物组分第2针及第3针免疫后,K_D0.05~0.25组抗体水平最高,K_D0.25~0.45组次之,K_D0.45组最低。结论较高分子大小Hib结合物的免疫原性优于较低分子大小的结合物,在制备Hib结合疫苗时,以分子大小K_D0.20~0.35为宜。