甘蔗细胞色素P450还原酶基因的RT-PCR扩增与表达分析

细胞色素P450基因在电子传递链、次生代谢物质合成和对外源化学药物毒性降解中发挥着重要作用,为了深入了解该基因在甘蔗中的功能,通过RT-PCR扩增获得甘蔗细胞色素P450还原酶基因的cDNA全长序列,命名为ScCPR450(Gen Bank Accession Number:KR864841).该基因全长999 bp,含有744 bp的完整开放阅读框,编码247个氨基酸.亚细胞定位结果显示,ScCPR450蛋白分布于细胞质中,与生物信息学预测结果相符.q RT-PCR表达分析表明,该基因在甘蔗中组成型表达,但有组织特异性,芽中表达量最高,其次是叶,而皮中表达量最低.在脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(Me JA)、聚乙二醇(PEG)和氯化铜(CuCl_2)胁迫诱导过程中,该基因的表达量呈现不同变化模式,其中SA胁迫6 h下,ScCPR450基因的表达量最高,约为对照的12.21倍;在PEG胁迫下,ScCPR450基因的表达量上调且表达量稳定,推测ScCPR450基因在甘蔗响应生物和非生物胁迫中发挥一定的作用.本研究可为该基因家族其它成员的克隆以及深入解析该基因的功能特性奠定基础,进而为基于基因工程技术对甘蔗品种进行定向改良提供基因资源.     

微囊藻毒素-LR对雄性黑斑蛙精巢中CYP46A1,CYP2H2和CYP2G1 mRNA表达的影响

微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)是分布最广泛和毒性最强的一种微囊藻毒素,对水生动物造成潜在的健康威胁。大量科学研究证实,动物体中的细胞色素P450酶(CYP)参与内源性物质及外源毒性物质的代谢过程。为探究两栖动物生殖器官中的CYP酶对低剂量MC-LR生殖毒效应的调节作用,选择雄性黑斑蛙(Rana nigromaculata)为受试动物,采用静态置换法和体内暴露方法,分别暴露于0、0.1、1和10μg·L~(-1)MC-LR溶液0、7和14 d;用实时荧光定量PCR方法检测精巢中CYP46A1、CYP2H2和CYP2G1的mRNA表达水平。结果表明,暴露于0.1、1和10μg·L~(-1)MC-LR 14 d后,CYP46A1在mRNA水平分别上调了1.86、1.65和1.22倍,CYP2H2在mRNA水平分别上调了4.62、1.80和1.04倍,CYP2G1的mRNA水平分别上调了2.63、2.16和1.56倍。MC-LR在1μg·L~(-1)剂量下暴露7 d后,CYP46A1、CYP2H2和CYP2G1 mRNA水平均出现显著上调。上述研究表明,微囊藻毒素对黑斑蛙精巢3种CYP基因在mRNA水平上都存在低剂量刺激效应。低剂量MC-LR能诱导黑斑蛙精巢中CYP46A1转录水平变化,促进胆固醇转化为24S-羟化胆固醇,潜在破坏雄性黑斑蛙精巢中胆固醇水平的平衡; MC-LR也能够诱导精巢中CYP2H2和CYP2G1转录水平的变化,潜在调节CYP2H2和CYP2G1转录水平,进而影响MC-LR的代谢作用。     

青蒿试管苗开花及用花器官为外植体诱导丛生芽生产青蒿素

将培养于MS培养基上5wk的青蒿试管苗置于光周期13，光强6000lx，温度为26℃（昼）和22℃（夜）的条件下，成功地诱导其开花，利用不同发育阶段的花蕾和花器官为外植体诱导丛生芽，发现不同浓度（ρ）的6－BA对丛生芽的诱导率和青蒿素的生物合成有重要影响。结果表明：以花蕾为外植体诱导丛生芽的最佳培养基是：MS附加4.0mg L^-1的6－BA和0.05mg L^-1的NAA；但当ρ（6－BA）在0－0.5mg L^-1之间时，有利于青蒿素的合成ρ（6－BA）=0.5-4mg L^-1时抑制青蒿素的生命合成，丛生芽中促进青蒿素合成的最佳ρ（6－BA）为0.5mg L^-1，用HPLC法测定发现用此法得到的丛生芽青蒿素的含量比直接利用叶片诱导的丛生芽青蒿素含量高1倍。     

AzaC预处理增加TCDD对特殊细胞P450基因的诱导

利用RT-PCR检测不同物质诱导细胞的CYP基因 mRNA的表达水平.在HepG2细胞,TCDD能诱导CYP1A1、CYP1B1及CYP1A2基因表达,CYP1A1、CYP1B1基因比CYP1A2基因更容易被诱导,用AzaC处理后CYP1B1基因表达无改变;在A549细胞和SPC-A1细胞,Azac预处理后增加了TCDD对CYP1家族的诱导.也就是AzaC增加了CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1基因表达水平.图1表1参10     

HgCl2对斑马鱼SOD,AChE酶活性和基因相对转录量的影响

以HgCl2为实验毒物,研究其对斑马鱼的毒性效应,经染毒后,分别在第1天和第7天取斑马鱼的肌肉测定超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰胆碱酯酶(AChE)活性,半定量RT-PCR检测肌肉中乙酰胆碱酯酶、细胞色素P450(CYP 1A)和超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的相对转录量.结果显示HgCl2对斑马鱼的毒性很强...     

青蒿无性系中青蒿素生物合成的相关因素

通过诱导丛生芽的方法得到青蒿高产无性克隆系S1,并用S1进行了青蒿素生物合成相关因素的研究 .发现在Hoagland培养液中添加 0 .4 4mg/L浓度的ZnSO4或者 5 .72mg/L的HBO3 时 ,能有效提高青蒿素的含量 .研究表明 ,青蒿素含量和青蒿各株系间的遗传差异存在很大关系 ,RAPD分析的结果表明 ,用OPA15能够在青蒿高产株系中扩增到OPA15 10 0 0 这一特异性片段 .另外 ,对青蒿素含量和青蒿生殖生长关系的研究表明 ,青蒿素含量最高的发育时期是现蕾期 .图 7表 1参 19     

氯化汞对大鲵心脏和胰腺CYP2亚家族成员CYP2K1、CYP2F3、CYP2F5和CYP2C19基因表达的影响

探究氯化汞(HgCl_2)对大鲵心脏和胰腺细胞色素P450 2(CYP2)亚家族成员细胞色素P450 2K1(CYP2K1)、P4502F3(CYP2F3)、P4502F5(CYP2F5)和P4502C19(CYP2C19)基因表达的影响,可为评价HgCl_2对大鲵的生态毒理影响提供基础数据.幼龄大鲵暴露于HgCl_2(1、10、100 ng/L)24、48、72 h后,采用qRT-PCR试验分析HgCl_2处理不同时间后CYP2亚家族成员CYP2K1、CYP2F3、CYP2F5和CYP2C19在心脏和胰腺中的表达变化模式.结果显示:HgCl_2对大鲵暴露24 h后,大鲵心脏CYP2K1、CYP2F3、CYP2F5和CYP2C19基因表达水平相对于对照组均呈现上升变化趋势,即1 ng/L HgCl_2显著诱导了大鲵心脏CYP2K1和CYP2C19基因表达水平(P 0.05),10 ng/L HgCl_2显著诱导了大鲵心脏CYP2F3和CYP2F5基因表达水平(P 0.05),100 ng/L HgCl_2均显著诱导了大鲵心脏CYP2K1、CYP2F3、CYP2F5和CYP2C19基因表达(P 0.05);大鲵胰腺CYP2K1、CYP2F3、CYP2F5和CYP2C19基因表达水平相对于对照组均呈现下降变化趋势,10、100 ng/L HgCl_2均显著抑制了大鲵胰腺CYP2K1、CYP2F3、CYP2F5和CYP2C19基因表达(P 0.05). HgCl_2对大鲵暴露48 h后,大鲵心脏CYP2F5基因表达水平相对于对照组均呈现显著下降变化趋势(P 0.05),并具有浓度梯度效应;大鲵胰腺CYP2F3基因表达水平受到显著诱导(P 0.05). HgCl_2对大鲵暴露72 h后,与对照相比大鲵心脏和胰腺CYP2K1、CYP2F3、CYP2F5和CYP2C19基因表达均无显著性变化.本研究表明随着HgCl_2暴露时间延长,CYP2亚家族基因表达无显著变化,大鲵心脏和胰腺CYP2亚家族基因CYP2K1、CYP2F3、CYP2F5和CYP2C19表达对HgCl_2刺激转变为慢性累积毒性效应;结果可为评价HgCl_2对大鲵的生态毒理影响提供基础数据.(图2表1参33)     

壬基酚聚氧乙烯醚对斑马鱼精巢组织的影响

采用半静态水体暴露的方式研究了非离子表面活性剂对成熟雄性斑马鱼精巢组织的影响。用荧光定量PCR(qRTPCR)方法检测试验鱼精巢雌激素受体α(ERα)、雄激素受体(AR)基因以及性激素合成相关细胞色素P450酶类基因(CYP17和CYP19a)的表达,通过组织学观察研究受试鱼精巢结构的变化。结果表明,壬基酚聚氧乙烯醚(NPEO)暴露可以引起雄性斑马鱼精巢组织结构的改变,并影响成年雄性斑马鱼ERα、AR基因和性激素合成相关细胞色素P450酶类基因的表达水平,且10.0 mg·L~(-1)的NPEO暴露可以显著上调CYP19a、ERα和AR基因的表达量,可显著下调斑马鱼精巢中CYP17基因的表达量。在组织学上,0.1 mg·L~(-1)组斑马鱼生精小管内不仅生精小囊数目减少,且管腔中精子数量减少,出现非细胞区域; 1.0和10.0 mg·L~(-1)组可见部分个体精子凝聚于生精小管管腔中央,管腔内空隙明显增大,表现出严重的精子浓缩效应。由此表明,NPEO暴露通过抑制CYP17基因的表达干扰睾酮的合成;同时,NPEO暴露通过诱导CYP19a和ER基因的表达增加内源雌激素的合成,导致斑马鱼精巢中性激素紊乱,最终损伤斑马鱼精巢组织。     

2种烷基多环芳烃对仿刺参CYP450和p53基因表达的影响研究

海洋环境中多环芳烃类(PAHs)主要来源于海洋溢油事故以及沿海石油化工企业的废水排放,国内外大量研究发现海洋中的多环芳烃对海洋生物造成了潜在的生态风险。为了揭示不同浓度多环芳烃类污染物对海参的生态毒理效应,将仿刺参(Apostichopus japonicus)分别暴露于不同浓度的2种烷基多环芳烃3-甲基菲(5、10、100μg·L~(-1))和2-甲基蒽(5、10、50μg·L~(-1))中,检测暴露3 d、7 d和14 d后,3-甲基菲和2-甲基蒽胁迫下仿刺参CYP450和p53基因的相对表达量。结果表明,3-甲基菲和2-甲基蒽胁迫下,仿刺参CYP450和p53基因的表达均对毒物产生了不同程度的响应。与对照组相比,3-甲基菲各处理组对仿刺参CYP450和p53基因的表达均产生显著的抑制作用(P0.05); 2-甲基蒽各处理组对仿刺参CYP450和p53基因的表达影响作用不同,暴露7 d后,2-甲基蒽各处理组对仿刺参CYP450基因的表达表现出抑制作用,对p53基因的表达表现出诱导作用。相同浓度与时间胁迫下,2-甲基蒽对仿刺参CYP450和p53基因表达的影响比3-甲基菲的影响大。上述研究结果表明,3-甲基菲和2-甲基蒽均可不同程度影响仿刺参CYP450和p53基因的表达,且与3-甲基菲相比,2-甲基蒽对仿刺参CYP450和p53基因表达的影响较明显。上述结果为多环芳烃类污染物对仿刺参的生物毒性评价提供了基础数据。     

甘薯LEA2基因的克隆与表达分析

胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant,LEA)是植物在逆境胁迫下产生的一种应激蛋白质,具有较高的亲水性和热稳定性,与植物抗逆功能密切相关,研究LEA家族基因对于甘薯抗逆性分子育种具有重要意义.通过对甘薯(徐薯18)转录组数据库搜寻时发现编码LEA2的转录本,随后对该转录本进行了克隆和测序分析,利用数字表达谱(Digital Gene Expression Profi ling,DGE)和半定量RT-PCR分析了Ib-LEA2在不同组织和不同发育阶段的表达图谱.为进一步了解Ib-LEA2在生物体响应盐胁迫中的作用,将Ib-LEA2连接原核表达载体pET-32a,用大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行盐胁迫的耐受分析.结果显示:Ib-LEA2完整的开放阅读框(ORF)长度为942 bp,编码313个氨基酸残基.进一步研究发现,在甘薯组织内同时存在3个高度同源的LEA 2基因型(核苷酸序列99%),分别命名为Ib-LEA2a、Ib-LEA2b和Ib-LEA2c.数字表达谱和半定量RT-PCR的结果显示Ib-LEA2在不同组织和发育阶段具有不同的表达图谱,在茎中的表达量远远高于叶和根.大肠杆菌BL21(DE3)菌株盐胁迫的结果显示,较之对照菌株,表达Ib-LEA2的菌株能够更好地耐受高浓度的NaCl.研究表明,Ib-LEA2对盐胁迫有一定的响应能力,能够保护细胞免受高盐的毒害.     

Nutzung der induzierbaren Genexpression des NematodenCaenorhabditis elegans als Biomonitor

The soil nematodeCaenorhabditis elegans is one of the simplest animals having the status of a laboratory model. Its already completely sequenced genome contains the remarkable number of 80 cytochrome P450 genes (CYP) and many further genes coding for enzymes involved in biotransformation. In order to study xenobiotically induced gene expression inC. elegans, liquid cultures were exposed to different, well-known xenobiotic inducers. The mRNA expression was detected by two different types of DNA arrays and semi-quantitative RT-PCR. β-naphthoflavone, PCB52 and lansoprazol were the most active and, in particular, induced almost all CYP35 isoforms strongly. In conclusion, the xenobiotic dependent gene expression ofC. elegans is a useful tool to reveal defense mechanisms against potential damaging substances as well as for developing a biomonitoring system.     

PFOS对多齿围沙蚕CYPs、GST基因转录及酶活性的毒性效应

多毛类沙蚕已经广泛应用于海洋环境污染的生物监测,但其对新型持久性有机污染物全氟辛烷磺酰基化合物PFOS的毒理学研究尚无报道。本研究以潮间带优势种多齿围沙蚕(Perinereis nuntia)为研究对象,以细胞色素P450(CYP)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)的基因和酶作为联合指标,研究了在PFOS亚致死浓度(4、8、16 mg·L-1)暴露第1、4、7、14天及净水恢复5 d后多齿围沙蚕CYP431A1、CYP424A1基因转录水平和EROD酶活性、GST omega基因转录水平和GST酶活性的响应情况。结果表明,PFOS暴露对EROD的抑制具有明显的时间-效应关系;CYP2系成员CYP431A1基因转录水平对PFOS的响应具有良好的剂量-效应关系并在胁迫第14天表现出最高的可诱导性;CYP4系基因CYP424A1的转录在4、8 mg·L-1处理组中与PFOS暴露时间正相关。II相解毒系统成员GST酶活和GST omega基因的响应均表现出随着PFOS胁迫时间的延长先下降,后上升的规律;多齿围沙蚕在高强度PFOS胁迫下仍可加速新陈代谢,表现出对PFOS的耐受性;净水恢复阶段,各指标都有向对照组水平恢复的趋势。总之,基因和蛋白的响应表明CYPs和GST在多齿围沙蚕PFOS新陈代谢中发挥重要作用,这些基因和酶具有作为生物标志物监测海洋潮间带PFOS污染效应的潜力。     

Effects of nonylphenol on the brain cytochrome P450 gene expression in F1 generation rats

In order to explore the effects of nonylphenol (NP) on brain cytochrome P450 gene expression in F1 generation rats microarray analysis techniques were used. mRNA were extracted from the brain of 2-day-old F1 generation rats whose F0 male generation were treated with NP, then reversely transcribed to cDNA and labeled with cy5 and cy3 for fluorescence. Subsequently, the cDNA probes were hybridized to the mouse 40S cDNA microarray; and fluorescent signals produced by cy5 and cy3 were scanned and analyzed. Sixteen identified genes were found to be expressed differently from control, including three cytochrome P450 genes, in which two were up-regulated and one down-regulated. Data suggest that NP affects the expression of some cytochrome P450 genes in rat brain when administered perinatally.     

五氯酚对土壤跳虫代谢转化酶基因和蜕皮相关基因表达的影响

五氯酚(PCP)是一种广泛存在于环境中的有机污染物。利用土壤跳虫(Folsomia candida)作为受试生物,研究了不同浓度的PCP暴露下细胞色素P450(CYP450)基因、谷胱甘肽转移酶(GST)基因和蜕皮相关基因表达水平的变化。结果显示,PCP暴露下,跳虫CYP450基因Fcc01651、Fcc02155、Fcc03650和GST基因Fcc04073、Fcc05260的表达水平未发生显著变化。在PCP浓度为240 mg·kg-1时,跳虫GST基因Fcc00494的表达显著上调。在PCP浓度为120 mg·kg-1和240 mg·kg-1时,几丁质酶基因Fcc00881和几丁质结合域基因Fcc01306的表达受到显著抑制。研究结果可为评价PCP暴露对跳虫的毒性提供一定依据。     

真鲷去毒相关基因cDNA序列的克隆与肝脏组成型表达分析

赤潮发生时产生的一些海洋生物毒素对人类和海洋动物的安全形成潜在的威胁甚至导致死亡.为从分子水平探讨鱼类中海洋藻毒素的去毒分子机理,采用RT-PCR法克隆了真鲷(Pagrus major)肝脏芳香烃受体核转位蛋白(ARNT)和I时相异生素代谢酶细胞色素P4501A(CYP1A)基因cDNA核心序列,同时,应用半定量RT-PCR方法,以β-肌动蛋白作为外参照,在其指数期增长的范围内研究了芳香烃受体(AHR)、ARNT、CYP1A、II时相异生素代谢酶alpha型谷胱甘肽S-转移酶(GSTA1、GSTA2)、rho型谷胱甘肽S-转移酶(GSTR)、热休克蛋白70(HSP70)基因组成型表达水平.结果发现,真鲷ARNT、CYP1A基因cDNA核心序列片段分别长438bp和908bp,分别编码146和302个氨基酸.序列同源性分析发现,真鲷与门齿鲷(Stenotomus chrysops)、石首鱼(Micropogon undulatus)ARNT基因氨基酸序列同源性高达97.2%、95.2%,与斑马鱼(Brachydanio rerio)、人、大鼠、小鼠ARNT同源性较低(77.2%～79.3%).真鲷与门齿鲷、金头鲷(Sparus auratus)、欧洲川鲽(Rhombus maximus)、欧洲海鲈(Dicentrachus labrax)CYP1A基因氨基酸序列同源性较高,为84.8%～94.0%,与斑马鱼、人、小鼠CYP1A同源性较低,为59.6%～77.8%.真鲷肝脏AHR、ARNT、CYP1A、GSTA1、GSTA2、GSTR和HSP70基因组成型表达水平分别为(25.32±6.56)%、(26.22±4.24)%、(146.5±16.06)%、(55.42±3.75)%、(48.82±10.89)%、(79.47±3.13)%、(107.42±14.34)%.     

中药青蒿的生理生化特征及其研究进展

中药青蒿即黄花蒿 (ＡｒｔｅｍｉｓｉａａｎｎｕａＬ .) ,与分类学上的青蒿 (Ａｒｔｅｍｉｓｉａａｐｉａｃｅａ)同属菊科 (ＡｓｔｅｒａｃｅａｅｏｒＣｏｍｐｏｓｉｔａｅ)蒿属(Ａｒｔｅｍｉｓｉａ) ,两者均为一年生草本植物且形态上非常相似 ,最明显的区别是黄花蒿的叶片为三回羽状全裂 ,而青蒿为二回羽状全裂 .青蒿广泛分布于全国各地 ,多生于海拔 40 0ｍ以下的丘陵平地[1] .现在这种植物广泛分布于世界各地[2 ] .青蒿在许多地区被用于编制花环 ,提取香料 ,更重要的是从青蒿中分离出的青蒿素是所有抗疟药中起效最快、疗效最好、毒性最低…     

五氯酚(PCP)对鸡肝癌细胞(LMH)毒性效应的机制研究

五氯酚(pentachlorophenol,PCP)是一种持久性有机污染物,广泛用于灭钉螺、木材防腐、除草剂等方面,由于PCP在环境中的持久性和生物累积性,其对生态环境和人类健康造成潜在危害。本文以鸡肝癌细胞系(chicken hepatoma cells,LMH)为受试对象,探讨了PCP对细胞色素P450(CYP450)和抗氧化系统的影响。MTT结果显示LMH细胞经不同浓度PCP暴露后,呈现出先促进细胞增殖后抑制的J-型曲线,PCP对LMH细胞24 h的半数效应浓度(24 h-EC50)为427.52μmol·L~(-1)。LMH细胞在1.56、6.25、25、100μmol·L~(-1)PCP染毒条件下可增加细胞EROD、MROD、PROD和BFC活性,并可使CYP1A、1B、1C、2H及3A家族基因mRNA表达水平升高。LMH细胞在0.4~100μmol·L~(-1)PCP染毒下可显著降低硫酸基转移酶(SULT1B1和SULT 1C1)基因mRNA水平。此外,LMH细胞在6.25、25、100μmol·L~(-1)PCP染毒下可引起细胞内ROS升高,同时PCP(1.56~100μmol·L~(-1))可显著增加细胞内MDA含量和降低GSH/GSSH比值。这些结果表明细胞色素P450(CYP450)基因及酶活性的变化、细胞内ROS和MDA含量及GSH/GSSH可作为评价LMH细胞PCP毒性效应的敏感性生物标志物。此研究在细胞水平上利用多个评价指标研究PCP对细胞的毒性效应,为PCP环境风险评价提供依据。