抗犬瘟热病毒VHH抗体噬菌体库的构建与筛选

为构建特异性犬瘟热病毒(CDV)的纳米抗体库,获得抗CDV的VHH抗体,本试验利用CDV免疫羊驼,四免后采集外周血淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,利用巢式PCR扩增纳米抗体序列。将目的片段连接至pComb3x噬菌体展示载体,并电转至TG1宿主菌,挑取40个克隆进行菌液PCR验证,随机挑选13个阳性单克隆进行测序,计算抗体库库容量,加入辅助噬菌粒拯救获得的噬菌体展示抗体库。经过3轮淘选,富集对CDV结合力高的噬菌体。利用毕赤酵母系统表达两株结合力高的噬菌体,经Ni柱纯化后,利用ELISA进行噬菌体结合力的鉴定。结果表明,四免后羊驼血清效价达1∶25 000,达到建库要求,构建的噬菌体展示文库库容量达3.41×10~9 PFU。经过3轮淘选,特异性抗体库经稀释100倍后,ELISA检测仍为阳性,表明特异性结合CDV的噬菌体得到明显的富集。ELISA结果表明,两株纯化的纳米抗体与CDV的反应性显著高于对照组。以上结果提示,本研究成功筛选出2株特异性结合CDV的VHH抗体,为VHH抗体在犬瘟热的诊断和治疗方面的应用奠定了基础。     

抗犬瘟热病毒VHH抗体噬菌体库的构建与筛选

为构建特异性犬瘟热病毒（CDV）的纳米抗体库,获得抗CDV的VHH抗体,本试验利用CDV免疫羊驼,四免后采集外周血淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,利用巢式PCR扩增纳米抗体序列。将目的片段连接至pComb3x噬菌体展示载体,并电转至TG1宿主菌,挑取40个克隆进行菌液PCR验证,随机挑选13个阳性单克隆进行测序,计算抗体库库容量,加入辅助噬菌粒拯救获得的噬菌体展示抗体库。经过3轮淘选,富集对CDV结合力高的噬菌体。利用毕赤酵母系统表达两株结合力高的噬菌体,经Ni柱纯化后,利用ELISA进行噬菌体结合力的鉴定。结果表明,四免后羊驼血清效价达1：25 000,达到建库要求,构建的噬菌体展示文库库容量达3.41×10⁹ PFU。经过3轮淘选,特异性抗体库经稀释100倍后,ELISA检测仍为阳性,表明特异性结合CDV的噬菌体得到明显的富集。ELISA结果表明,两株纯化的纳米抗体与CDV的反应性显著高于对照组。以上结果提示,本研究成功筛选出2株特异性结合CDV的VHH抗体,为VHH抗体在犬瘟热的诊断和治疗方面的应用奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒NS5A蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

为防控牛病毒性腹泻的流行，淘选得到抗BVDV-NS5A的纳米抗体序列，并探究其结合活性。通过重组质粒pET30a-NS5A诱导表达并纯化蛋白，免疫羊驼，获得重组质粒pCANTAB 5E-VHH,构建了一个初始的抗BVDV-NS5A纳米抗体展示文库。利用3轮固相亲和筛选，对筛选后的单克隆抗体通过ELISA验证其特异性与结合力并测序、分析。构建出具有较好多样性的噬菌体展示文库，测得库容为5.3×10⁷ CFU/mL,插入率73.9%。通过评价和分析显示，得到20株不同氨基酸序列的纳米抗体，其中7株与NS5A蛋白具有较好反应性。针对抗BVDV-NS5A蛋白淘选纳米抗体，并证明得到的纳米抗体有较好的结合力。研究结果有望用于研发BVDV诊断试剂盒、抗BVDV的候选药物，同时也为后续BVDV的致病机制研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体的筛选及其鉴定

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(Nsp2)的纳米抗体,本研究将截短表达的Nsp2重组蛋白免疫骆驼后分离骆驼外周血淋巴细胞,利用RT-PCR扩增其VHH基因,将VHH基因插入pCANTAB5E噬菌体载体,构建双峰驼重链抗体可变区文库。利用噬菌体展示技术经过3轮淘选,共筛选得到44株Nsp2特异性纳米抗体;经ELISA检测,结果显示44株Nsp2特异性纳米抗体均能与Nsp2蛋白特异性反应。本研究首次筛选到PRRSVNsp2特异性纳米抗体,为Nsp2蛋白的相关研究提供了必要的研究工具,同时为开发新型抗PRRSV药物奠定一定的基础。     

抗非洲猪瘟病毒NP419L蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是猪的一种高度传染性疾病，严重威胁全球养猪业的发展。本研究旨在筛选抗非洲猪瘟病毒(ASF virus, ASFV)NP419L蛋白的纳米抗体并对其在ASF抗体检测中的应用进行初步评价。大肠杆菌表达和Ni-NTA亲和层析纯化等技术表达纯化重组NP419L蛋白；将纯化的重组蛋白免疫双峰驼，5次免疫采集外周血淋巴细胞提取总RNA,经反转录、巢式PCR、酶切、连接和电转化等构建抗NP419L蛋白的噬菌体展示文库；利用噬菌体展示筛淘技术，经三轮筛淘获得抗NP419L蛋白的纳米抗体；构建纳米抗体与辣根过氧化物酶(HRP)融合蛋白的真核表达载体，转染HEK293T细胞，ELISA和间接免疫荧光(IFA)等鉴定融合蛋白的分泌表达及其与NP419L蛋白的结合；竞争ELISA初步评价获得的纳米抗体与HRP融合蛋白在ASF抗体检测中的应用。结果显示，成功制备了纯度较高的预期大小为48 ku的重组NP419L蛋白；构建获得了阳性率为89.5%,库容量为6×10⁸的噬菌体展示文库；筛淘获得了6株抗NP419L蛋白的纳米抗体；分泌表...     

1株抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳(N)蛋白的抗原表位,本研究通过原核表达N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合和亚克隆技术,筛选出1株稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体的杂交瘤细胞9B4。经鉴定单克隆抗体9B4的亚型为IgG1型,轻链为Kappa链。腹水抗体ELISA效价为10~6以上。ELISA、Western blot和免疫荧光鉴定结果显示该单克隆抗体反应原性和特异性良好。利用噬菌体展示技术对单克隆抗体9B4进行抗原表位鉴定,获得4个N蛋白的模拟抗原表位(C11、C12、C14和C26)。随后分别以噬菌体阳性克隆为模拟抗原,对临床PEDV血清样品进行检测,发现其均能与猪PEDV阳性血清发生特异性结合,而与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)阳性血清不反应,说明本研究获得的N蛋白模拟表位可用于PEDV抗体的检测,有助于PED流行病学调查和PEDV疫苗免疫效果的评价。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白纳米抗体的筛选及其对病毒复制的抑制效应

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并探究其对病毒复制的抑制效应。使用原核表达系统将PRRSV-GP5蛋白大量表达后经镍柱亲和层析法纯化,使用所获的重组GP5蛋白免疫羊驼,并于第0、14、28、42天时采血,检测羊驼体内抗体效价后分离全血淋巴细胞,提取细胞总RNA,反转录后使用巢式PCR扩增出重链抗体可变区(VHH)片段,并与pCANTAB-5E载体相连后转化入TG1感受态细胞,利用噬菌体展示技术构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库。经连续三轮特异性噬菌体的筛选与富集后,淘选出与PRRSV-GP5蛋白高结合力的纳米抗体,通过间接ELISA方法鉴定其反应原性,后将所获的纳米抗体基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,利用Lipofectamine3000转染至Marc-145细胞内,与PRRSV分别共孵育0、24、36、48、60、72 h,以探究所筛针对PRRSV-GP5蛋白的纳米抗体于胞内对病毒复制与转录产生的影响。结果表明,成功对PRR...     

绵羊肌肉生长抑制素(MSTN)双价纳米抗体构建与表达

为了研究如何提高纳米抗体颉颃肌肉生长抑制素(MSTN)作用,试验采用构建绵羊MSTN纳米抗体双价表达载体的方法,将免疫双峰驼构建的MSTN特异性纳米抗体噬菌体文库筛选得到的特异性抗MSTN纳米抗体,扩增目的序列,利用linker进行链接,将序列构建到原核表达载体p ET-30a,转化进BL21(DE3),经过SDS-PAGE电泳以及Western-blot检测,利用Ni柱纯化双价抗MSTN蛋白纳米抗体。结果表明:经过诱导的表达菌,SDS-PAGE验证以及Western-blot检测,条带清晰。说明成功构建了颉颃MSTN的双价纳米抗体原核表达系统;通过纳米抗体技术制备MSTN的颉颃物,阻断其分子作用通路,可有效地促进绵羊肌肉的生长和发育。     

牛病毒性腹泻病毒纳米抗体文库构建与筛选

旨在获得牛病毒性腹泻病毒(BVDV)特异性纳米抗体。通过用BVDV-E0重组蛋白对羊驼进行免疫,分离血液中的淋巴细胞。利用噬菌体展示技术,构建噬菌体展示文库,经过连续3次生物淘筛获得与BVDV-E0蛋白结合的噬菌体,对所得VHH序列进行测序和基因比对。用ELISA筛选出抗BVDV-E0的高亲和力纳米抗体,并验证纳米抗体的亲和力和活性。结果成功构建了插入率为86%、库容量为1.3×1011 cfu的噬菌体表达文库,经过筛选获得5个BVDV-E0阳性单克隆,将这些基因克隆至原核表达体系,表达和纯化后获得了高纯度的BVDV-E0纳米抗体,经亲和力的鉴定获得2个不同的高亲和力的VHH基因,并且能结合人工抗原E0,还能够被竞争抗体所阻断。研究结果为用于组装检测BVDV试剂盒和研制BVDV疫苗奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3(P80)非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体(VHH)克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×1014 CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）NS3（P80）非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体（VHH）克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×10¹⁴ CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白纳米抗体筛选及反应原性检测

通过噬菌体展示技术筛选牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白特异性纳米抗体,验证纳米抗体反应原性。使用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,分别在第0、21、49及70天采集全血,测得抗体效价后分离全血中淋巴细胞,提取总RNA,反转录后PCR扩增目的片段。目的片段和pCANTAB5E使用限制性内切酶酶切连接后转至TG1感受态细胞中,应用噬菌体展示技术构建VHH噬菌体展示文库。再经过3轮"吸附-洗脱-筛选"后得到与BVDV-E2结合的噬菌体,用ELISA鉴定其反应性。结果获得插入率为90.8%,库容为1.02×107 CFU/mL的文库。ELISA结果和序列分析显示,得到2条与E2蛋白具有良好反应性的纳米抗体且与VHH同源性较高的序列。研究结果为BVDV的防控和新型疫苗的研制奠定基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白特异性纳米抗体的原核表达研究

为利用大肠埃希菌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白特异性纳米抗体,并对其抗原结合活性进行鉴定,以Cap蛋白特异性纳米抗体基因(vhh cap)序列为模板,利用Primer 5.0软件设计一对通用vhh cap特异性扩增引物,通过PCR方法扩增vhh cap基因片段,经双酶切处理后分别克隆到pCold-SUMO和pET-32a(+)载体上,转化宿主菌E.coli BL21(DE3),使用IPTG进行诱导表达,表达产物通过Ni 2+亲和层析柱进行纯化,经SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,同时使用ELISA方法对两种载体表达的纳米抗体ELISA效价进行检测和对比分析。SDS-PAGE结果显示pCold-SUMO和pET-32a(+)载体均能实现VHH cap纳米抗体重组蛋白的原核可溶性表达,Western blotting表明纳米抗体重组蛋白可通过6×His-Tag进行检测;ELISA结果显示pCold-SUMO载体表达的纳米抗体重组蛋白效价为1∶500,ELISA效价明显高于pET-32a(+)载体表达产物。PCV2 Cap特异性纳米抗体成功表达为PCV2检测及治疗用新型的抗体开发奠定了基础。     

Selection and identification of single-domain antibody against Peste des Petits Ruminants virus

BackgroundPeste des petits ruminants (PPR) is an infectious disease caused by the peste des petits ruminants virus (PPRV) that mainly produces respiratory symptoms in affected animals, resulting in great losses in the world''s agriculture industry every year. Single-domain variable heavy chain (VHH) antibody fragments, also referred to as nanobodies, have high expression yields and other advantages including ease of purification and high solubility.ObjectivesThe purpose of this study is to obtain a single-domain antibody with good reactivity and high specificity against PPRV.MethodsA VHH cDNA library was established by immunizing camels with PPRV vaccine, and the capacity and diversity of the library were examined. Four PPRV VHHs were selected, and the biological activity and antigen-binding capacity of the four VHHs were identified by western blot, indirect immunofluorescence, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) analyses. ELISA was used to identify whether the four VHHs were specific for PPRV, and VHH neutralization tests were carried out. ELISA and western blot analyses were used to identify which PPRV protein was targeted by VHH2.ResultsThe PPRV cDNA library was constructed successfully. The library capacity was greater than 2.0 × 10⁶ cfu/mL, and the inserted fragment size was approximately 400 bp to 2000 bp. The average length of the cDNA library fragment was about 1000 bp, and the recombination rate was approximately 100%. Four single-domain antibody sequences were selected, and proteins expressed in the supernatant were obtained. The four VHHs were shown to have biological activity, close affinity to PPRV, and no cross-reaction with common sheep diseases. All four VHHs had neutralization activity, and VHH2 was specific to the PPRV M protein.ConclusionsThe results of this preliminary research of PPRV VHHs showed that four screened VHH antibodies could be useful in future applications. This study provided new materials for inclusion in PPRV research.     

抗磺胺二甲氧嘧啶VHH抗体噬菌体库的构建和鉴定

旨在制备抗磺胺二甲氧嘧啶(SDM)驼源单域重链(VHH)抗体,用于检测动物源性食品中SDM的残留。采用重氮化法,SDM分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工免疫原(SDM-BSA)和包被抗原(SDM-OVA)。用SDM-BSA免疫骆驼,在第5次免疫后1周采集骆驼外周血液,分离外周血淋巴细胞,提取RNA,RT-PCR扩增VHH基因,将VHH基因插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,构建双峰驼单域重链抗体库。经本实验室前期测定其库容为1.08×10⁵ CFU,阳性率为96.6%。利用噬菌体展示技术经过4轮生物淘选,筛选获得特异性表达抗SDM抗体的重组噬菌体。结果:构建了SDM的驼源VHH抗体库,经生物淘选及phage ELISA检测获得了特异性的重组噬菌体。通过4轮生物淘选,获得了能够与SDM-OVA抗原有明显结合力且能够特异性表达抗SDM抗体的重组噬菌体,为后期检测SDM在动物源性食品残留奠定了良好的基础。     

流行性腹泻病毒分子生物学研究进展

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起猪的高度接触性肠道传染病,感染PEDV的猪群主要表现为腹泻、呕吐、厌食、脱水等临床症状。PEDV可感染各个阶段的猪群,临床上PEDV主要造成7日龄以内的仔猪高发病率及高死亡率(可达100%)。PEDV的迅速传播给养猪行业造成了巨大的经济损失。本文针对PEDV的病原学、病毒编码蛋白及其生物学功能、感染细胞机制进行综述,以期为深入研究PEDV的致病机制提供参考。     

抗犬细小病毒纳米抗体的制备及其中和活性鉴定

【目的】 建立抗犬细小病毒（CPV）纳米抗体（Nb）库,从中筛选出具有中和活性的Nb。【方法】 以高免比格犬脾脏组织cDNA进行重链可变区（VH）扩增,与pBSD载体连接,构建pBSD-Nb库。结合细菌展示、流式细胞仪检测,在pBSD-Nb库中筛选高亲和力的Nb,获得阳性克隆并测序。利用Primer Premier 5.0软件设计Nb基因的上、下游引物,将阳性克隆质粒中Nb基因片段进行PCR扩增。利用pET-27b表达目的蛋白,通过变性、复性手段纯化目的蛋白,用SDS-PAGE分析纯化后的蛋白。将Nb包被96孔板,采用ELISA法检测Nb对CPV的亲和力。通过病毒微量中和试验检测Nb抑制CPV感染猫肾细胞（F81）的情况。【结果】 PCR扩增结果显示,在384 bp处可见明显条带,与预期大小相符,证明pBSD-Nb库构建成功。细菌展示后,流式细胞术检测结果显示,有9株阳性峰偏移率高的Nb,分别命名为Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5、Nb6、Nb7、Nb8和Nb9。PCR扩增9株Nb基因片段,获得384 bp的条带。SDS-PAGE结果显示,在约14 ku处有一条带,说明成功获得纯化蛋白。ELISA检测结果表明,9株Nb中有6株Nb对CPV的亲和力较强。体外病毒中和试验检测发现,1株Nb能够中和病毒,抑制F81细胞病变,中和病毒的有效浓度为0.05 mg/mL。【结论】 本研究成功建立pBSD-Nb库,筛选出6株对CPV具有高亲和力的Nb,并成功获得1株具有中和活性的Nb,为CPV治疗性抗体制剂的开发提供了新的思路。     

猪流行性腹泻及新型疫苗研究进展

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是危害养猪业健康发展的重要疾病之一,具有急性、高度传染性的特征,给养猪业造成了严重的经济损失。猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）感染会破坏动物机体的消化系统,造成患病猪食欲下降、呕吐以及严重腹泻等,且药物治愈后的仔猪也会因为生长发育不良等因素严重影响生产,给养殖户带来巨大的困扰。2010年PEDV高致病变异毒株在中国暴发流行,导致PED的发病率和死亡率大幅升高,严重影响中国养猪生产。此次PED的暴发流行引起了养猪行业的密切关注,相关研究领域的学者对PEDV致病机制和PED新型疫苗进行了更加深入的研究,亚单位疫苗、病毒活载体疫苗、细菌活载体疫苗、转基因植物疫苗和核酸疫苗5种PED新型疫苗相继被开发,并取得全新的突破和进展。与传统的PED灭活苗和PED弱毒疫苗相比,PED新型基因工程疫苗具有安全性好、制备简单、免疫效果好等优点。文章着重对PEDV发病机理和5种PED新型疫苗的研究进展展开综述,从而加深对PEDV和PED新型疫苗的了解,以期为PEDV感染的预防和控制措施提供参考。