鸭坦布苏病毒包膜蛋白的原核表达和间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立特异性和敏感性高的检测鸭坦布苏病毒感染的方法,采用原核表达系统对鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因进行了克隆与表达,SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白大小为54.3 ku.Western blot结果表明,经亲和层析法纯化后的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应.以纯化的重组E蛋白作为包被抗原,初步建立了检测E蛋白抗体的间接ELISA方法.对ELISA各种反应条件进行了优化,确定了最适工作条件.优化后确定的抗原最适包被浓度为7 μg/mL,血清的最佳稀释度为1;320,酶标抗体最适稀释度为1:1 000.在优化条件下,阴性和阳性临界值判定标准为0.324 4.本研究建立的快速检测DT-MUV抗体的间接ELISA方法为该病的检测和流行病学调查提供了技术手段.     

鸭坦布苏病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的初步应用

为了开发鸭坦布苏病毒间接ELISA抗体检测试剂盒,研究利用灭活纯化的鸭坦布苏病毒(DTMUV)FX2010株作为包被抗原,由瑞普(保定)生物药业有限公司连续制备了5批次鸭坦布苏病毒间接ELISA抗体检测试剂盒中试产品。该试剂盒对禽流感病毒、鸭瘟病毒、鸭细小病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒阳性血清和5份SPF阴性质控血清进行的检测均无交叉反应,表明具有较好的特异性。批内和批间重复性试验的变异系数为1.5%~4.2%和2.2%~5.3%,表明产品具有很好的稳定性。应用该试剂盒及中和试验对300份疑似DTMUV阳性血清样品进行检测,结果显示:二者阳性样品符合率为90.12%,阴性样品符合率为93.6%,总符合率为92.7%。研究结果表明,该试剂盒具有操作简便、敏感性高和特异性强的特点,可以为鸭坦布苏病毒病的快速诊断及其流行病学调查提供有力的工具。     

鸭坦布苏病毒JM株E蛋白的截断表达及间接ELISA方法的建立

本研究利用RT-PCR扩增鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)JM株E基因截断片段(822 bp),并将其克隆至原核表达载体p ET32a(+),成功构建了重组质粒p ET32a-E。重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,经IPTG诱导得到了高效表达。Western blot分析表明,重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应。将纯化好的DTMUV E蛋白作为包被抗原,建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法。经过条件优化,确定了抗原最适包被浓度为0.093μg/孔,血清的最佳稀释度为1∶100。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为3.53%和9.73%。用建立的ELISA方法对免疫鸭坦布苏病毒灭活疫苗的鸭血清和对照鸭血清进行抗体检测,同时与攻毒保护试验进行比较,两者的阳性符合率为86.67%,阴性符合率为100%。     

鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测鸭坦布苏病毒(DTV)的血清学方法,本研究利用纯化的DTV奉贤株(FX2010)作为包被抗原,建立了检测DTV血清抗体的间接ELISA方法,并且对各种检测条件进行了优化。优化后确定的抗原最适包被浓度为1.675μg/孔,抗原最佳包被条件为37℃放置2 h后,4℃下过夜,血清的最佳稀释度为1∶200,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000。在优化条件下,阴阳性临界值判定标准为0.432。用建立的间接ELISA方法对禽流感病毒、新城疫病毒、网状内皮增生病病毒、I型鸭肝炎病毒、呼肠孤病毒、禽白血病病毒阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为2.9%和3.9%,显示该方法具有很好的稳定性。用间接ELISA方法对140份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,有108份样品呈现阳性,而琼扩试验只有32份呈阳性结果,而且用该方法检测的阳性样品包括了琼扩试验的阳性样品,证明该方法具有较高的敏感性和特异性。本研究快速检测DTV抗体间接ELISA的建立为该病的诊断和流行病学调查提供了新的方法。     

检测鸭坦布苏病毒NS1抗体ELISA方法的建立

为了检测鸭群中鸭坦布苏病毒的血清学流行情况,本研究在前期成功表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的基础上,建立了检测鸭血清中鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法。棋盘法确定了当纯化的NS1蛋白包被量为0.188μg/孔,待检血清1:200稀释,HRP标记的兔抗鸭二抗1:16000倍稀释时反应条件最佳。在最佳反应条件下,阴阳性临界值判定标准为0.467。用建立的间接ELISA方法对番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭肝炎病毒、鸭疫里默氏杆菌阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为6%和10%,显示该方法具有很好的稳定性。用建立的ELISA方法检测临床鸭坦布苏病毒感染鸭及攻毒蛋鸭的55份临床血清样品,测得52份为阳性,阳性率为94.5%,对36份阴性鸭群血清样品进行检测,36份为阴性,阴性率为100%。该方法为鸭坦布苏病毒的诊断和流行病学监测奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒病EDⅢ-ELISA方法的建立

为建立鸭坦布苏病毒抗体ELISA检测方法,采用RT-PCR扩增鸭坦布苏病毒ZJSBL01株E蛋白结构域III(EDIII)基因,将其克隆至原核表达载体p ET-28a,转化到BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,获得了重组EDIII蛋白。利用EDIII蛋白作为包被抗原,建立了检测DTMUV Ig G抗体的间接ELISA方法,并对反应条件进行优化。最终确定抗原包被浓度为4μg/m L、血清稀释度为1:40、抗原包被条件为37℃包被4 h、封闭液为含3%BSA的PBST、封闭条件为37℃封闭2 h、酶标二抗稀释度为1:1 000、底物反应时间为15min作为ELISA的最佳反应条件。当检测样品S/P大于0.306判定为阳性。建立的ELISA检测方法特异性强、重复性好,对开展鸭坦布苏病毒抗体检测及血清学调查具有重要意义。     

鸭坦布苏病毒E蛋白结构域III原核表达产物诱导中和抗体的研究

黄病毒E蛋白结构域Ⅲ能够介导病毒与宿主受体结合以及诱导产生中和抗体,本研究利用原核表达系统表达了鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ,并研究了其免疫原性。按照大肠杆菌偏好性密码子对鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ核苷酸序列进行优化并合成后,克隆至pCold-TF载体构建重组质粒pCold-TF-optiEDIII。Western blot证实重组蛋白能与鸭坦布苏病毒特异性血清发生反应。用纯化的重组蛋白免疫BLAB/c小鼠3次,间接ELISA和间接免疫荧光实验证实E蛋白结构Ⅲ诱导了鸭坦布苏病毒特异性的体液免疫反应。中和实验证实鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ可诱导产生中和抗体。本研究为进一步研制鸭坦布苏病毒诊断抗原和亚单位疫苗奠定了基础。     

以番鸭呼肠孤病毒σC表达蛋白为抗原的ELISA方法的建立

将鸭呼肠孤病毒小外壳σC蛋白编码基因克隆于原核表达载体pET32a上,经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切鉴定及序列分析,得到重组质粒pET32a-σC,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,经SDS-PAGE和westem-blotting分析,融合蛋白能够与番鸭呼肠孤病毒感染康复鸭血清发生特异反应;以0.15m mol/LIPTG诱导,5h后融合蛋白δC表达量可达高峰,分子量为50ku;融合蛋白纯化后作为包被抗原,建立了检测鸭血清中的呼肠孤病毒抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法,最佳包被浓度为51μg/ml;标准阳性血清的最适稀释倍数为1：40;用该方法对50份鸭血清样品进行检测,并与琼扩抗体检测法相比较,证明该ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,该研究为今后鸭呼肠孤病毒的诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)抗体的方法,本研究以纯化的重组σC蛋白作为包被抗原,并对该方法的反应条件进行优化,建立了NDRV间接ELISA抗体检测方法。该方法仅对NDRV血清检测为阳性,与番鸭呼肠孤病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、番鸭源鹅细小病毒阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。其批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%,具有良好的重复性。利用建立的σC蛋白间接ELISA方法对80份疑似鸭血清样品进行检测,结果显示与NDRV全病毒间接ELISA的符合率为88.75%。本研究建立的ELISA方法为NDRV的流行病学调查提供了快速、特异的血清学检测方法。     

检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA方法建立及初步应用

以鹅源坦布苏病毒JS804毒株制备的多克隆抗体为捕获抗体,抗鹅坦布苏病毒NS1蛋白的单克隆抗体4A9作为检测抗体,建立了检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA方法。该方法的最佳反应条件为:兔抗鹅坦布苏病毒多克隆抗体的最适稀释度为1∶1 600,单克隆抗体的最适稀释度为1∶160,样品反应时间为1 h,酶标羊抗鼠二抗工作浓度为1∶5 000,以OD450nm≥0.245作为阳性判定标准。该方法的板间、板内重复性变异系数小于10%,病毒最低检测量为386.25TCID50/0.1 mL,与新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸭肝炎病毒(DHV)和鹅细小病毒(GPV)无交叉反应。应用该方法与RT-PCR方法同时检测22份临床样品,符合率达到86.36%。结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异性好、灵敏性高和重复性好等优点,可用于坦布苏病毒的快速检测。     

以番鸭呼肠孤病毒σC表达蛋白为抗原的ELISA检测方法的建立

将鸭呼肠孤病毒小外壳dC蛋白编码基因克隆于原核表达栽体pET32a上，经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切鉴定及序列分析，获得了重组质粒pET32a-σC，转化DH5a大肠埃希氏菌感受态细胞后，经SDS—PAGE和Western—blotting分析，融合蛋白能够与番鸭呼肠孤病毒感染康复鸭血清发生特异反应；以0．15mmol／L IPTG诱导，5h后融合蛋白σC表达量可达高峰，分子质量为50ku；融合蛋白纯化后被用作包被抗原，建立了检测鸭血清中呼肠孤病毒抗体的间接ELISA，经对检测条件优化，最佳包被浓度为5μg／mL，标准阳性血清的最适稀释倍数为1：40。用该方法对50份鸭血清样品进行了检测，与琼脂扩散抗体检测法相比，ELISA具有良好的特异性和敏感性。     

鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒及番鸭呼肠孤病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与临床应用

为建立鉴别检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)、新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)及番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的方法,本研究分别针对DTMUV E基因与NDRV、MDRV S3基因,设计特异性引物和Taq Man探针,经优化反应条件,建立了同一体系中同时检测DTMUV、NDRV及MDRV的Taq Man荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅能扩增DTMUV、NDRV及MDRV,与禽呼肠孤病毒(ARV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、鸭瘟病毒(DEV)等主要禽源病毒均无交叉反应,特异性强;对DTMUV、NDRV及MDRV质粒标准品的检测下限均为7.5×10~1拷贝/μL,敏感性高;组内与组间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性好。利用该方法与已报道的坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法及NDRV与MDRV双重RTPCR方法同时检测82份临床疑似患病鸭的肝脾组织样品,结果检出阳性样品22份,其中,DTMUV阳性检出率为10.98%(9/82),NDRV阳性检出率为2.44%(2/82),MDRV阳性检出率为13.41%(11/82),检出阴性样品60份。与参考方法的检测结果一致,三者的符合率达100%。本研究建立的方法为临床DTMUV、NDRV及MDRV鉴别检测和流行病学调查提供了特异、敏感、高效的技术支撑。     

检测鸭坦布苏病毒卵黄抗体间接ELISA方法的建立

本研究以纯化的鸭坦布苏病毒WR株为包被抗原,建立检测鸭坦布苏病毒卵黄抗体的间接ELISA方法。经优化后确定检测样品的结果P/N([样品孔OD450nm-空白孔OD450nm)/(阴性孔OD450nm-空白孔OD450nm)]≥2.1判为阳性,<1.5者为阴性;1.5≤P/N<2.1者判为可疑,重检后仍可疑者定为阴性。以建立的间接ELISA方法对H9亚型禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒、减蛋综合征病毒、鸭瘟病毒和大肠杆菌卵黄抗体进行了检测,结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。经重复性试验表明,该方法重复性好。本方法的建立对开产种鸭和蛋鸭坦布苏病毒疫苗免疫效果的评价具有十分重要的意义。     

猪脑心肌炎病毒重组抗原间接ELISA诊断方法的建立与应用

以猪脑心肌炎病毒VP1重组蛋白为抗原,建立了检测猪脑心肌炎病毒(EMCV)血清抗体的间接ELISA诊断方法。经优化后抗原最适包被浓度为2μg/mL,血清最适稀释度为1∶50,其作用时间为90 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min。判定标准为OD450≥0.427为阳性,OD450≤0.35为阴性,介于二者之间为可疑。该重组蛋白与PRRSV、猪瘟、PCV2、FMDV抗体反应呈阴性,证明具有良好的特异性。应用该方法检测了来自我国不同地区的26家猪场的156份临床血清,结果证明我国部分规模化猪场已有猪脑心肌炎疾病存在。     

一种基于VP0蛋白检测DHAV(1型和3型）血清抗体的间接ELISA的建立及应用

为建立一种快速检测鸭甲肝病毒(DHAV)1型和3型(DHAV-1、DHAV-3)血清抗体的方法,本研究诱导表达了DHAV-1、DHAV-3重组蛋白VP0、VP1、VP3,并采用ELISA方法比较了3者的反应原性,结果显示DHAV-1 VP0更适合作为检测DHAV-1、DHAV-3血清抗体的通用型诊断抗原。经各反应条件优化,建立了一种基于DHAV-1 VP0重组蛋白的可同时检测DHAV-1、DHAV-3血清抗体的间接ELISA方法。优化的主要反应条件为:抗原包被浓度为0.25μg/m L,待检血清稀释度为1100,山羊抗鸭HRP-IgG 1400稀释。该方法特异性较强,只与DHAV-1、DHAV-3阳性血清反应,与鸭源小鹅瘟病毒(GPV)、鸭病毒性肠炎病毒(DEV)、H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)等阳性血清均无交叉反应;敏感性为1320;批内变异系数小于4%,批间变异系数小于6%;与商品化的ELISA抗体检测试剂盒比较,二者阳性符合率为93.3%,阴性符合率为88.9%,总符合率为95.7%,且该方法可用于临床血清样本的检测。本研究为检/监测DHAV血清抗体水平提供了技术手段。     

鸭坦布苏病毒E基因重组杆状病毒的构建与间接ELISA检测方法的建立

研究旨在建立基于真核表达的鸭坦布苏病毒(DTV)E蛋白的诊断鸭坦布苏病毒病的间接ELISA方法。利用Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统,构建含有DTV E基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出55 ku左右的表达蛋白,Western blot检测该蛋白具有很好的反应原性。以重组Bacmid DTV E蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。利用该方法对135份来自江苏省的樱桃谷鸭血清样品进行检测,发现其血清阳性率达79.3%。表明建立的间接ELISA检测方法特异性强、重复性好、敏感性高,可以用于鸭坦布苏病毒病的临床诊断。     

鸭坦布苏病毒全长E蛋白可溶性表达及免疫原性分析

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)引起的一种以产蛋量和采食量严重下降为主要特征的传染病。应用RT-PCR方法扩增DTMUV GDHD2014-3毒株的囊膜(E)蛋白全基因序列,并将其克隆至原核表达载体pMAL-c5x,构建重组表达质粒E-pMAL。将其转化E.coli BL21感受态细胞,经诱导表达条件优化,在30℃条件下IPTG诱导,可溶性表达重组的全长E蛋白(rf E),大小约110 ku。用Amylose Resin对目的蛋白进行纯化,并将纯化的rf E蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆血清抗体。经Nu-PAGE以及Western blot分析,成功实现rf E蛋白可溶性表达,并能与DTMUV灭活疫苗免疫鸭血清多抗产生特异性反应。间接免疫荧光试验结果表明,rf E蛋白免疫小鼠获取的多克隆血清抗体能与DTMUV反应。实现了rf E蛋白的可溶性表达及纯化,并验证rf E蛋白具有良好的免疫原性,为DTMUV的亚单位疫苗的研制以及相关诊断试剂的开发奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR方法的建立

为了研究一种可同时检测鸭坦布苏病毒与鸭圆环病毒的二重PCR方法,试验采用DNASTAR及Primer Premier 5.0软件,针对Gen Bank中坦布苏病毒(DTMUV)E基因和鸭圆环病毒(Du CV)REP基因的保守序列,设计合成了2对引物,通过优化反应体系条件及特异性、敏感性评价,建立了鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的二重RT-PCR方法。结果表明:该方法对鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的检测敏感性达到100 fg;使用该方法对新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合征病毒的检测结果全为阴性。说明建立的二重RT-PCR检测方法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒感染的快速鉴别诊断。     

一例樱桃谷种鸭坦布苏病毒病与呼肠孤病毒病混合感染的诊断

江西省赣州地区某种鸭场樱桃谷种鸭发生一起以产蛋下降、个别死亡、卵泡出血和肝脏、脾脏表面有白色坏死点为主要特征的疫病,我们设计特异性引物并以建立的PCR、RT-PCR方法对该病例样品分别进行了禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、禽多杀性巴氏杆菌、鸭呼肠孤病毒、产蛋下降综合征病毒、副粘病毒和鸭瘟病毒的检测,结果仅扩增出约330 bp大小的鸭坦布苏病毒特异性条带和约680 bp大小的鸭呼肠孤病毒特异性条带,结合临床剖检病变和实验室检测结果,确诊该病例为鸭坦布苏病毒病与呼肠孤病毒病合感染。     

鸭坦布苏病毒冻干高免卵黄抗体的研制

本研究用鸭坦布苏病毒病灭活苗三次免疫SPF蛋鸡,收取高免鸡蛋,制备成冻干高免卵黄抗体;用鸡胚中和试验和间接ELISA方法进行效价检测。试验结果显示,第3次免疫后2周,卵黄抗体中和效价为1∶103.5,4、5周达到最高值1∶104.5;间接ELISA方法检测冻干前后的抗体效价结果均为阳性;对鸭坦布苏病毒强毒的攻毒保护率达100%,可为鸭坦布苏病毒的防控提供一种有效的冻干高免卵黄抗体制剂。