犬GM-CSF基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

为了研究犬粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的作用,试验根据GenBank上发表的犬(Canis familiaris)GM-CSF cDNA基因序列设计1对引物,采用RT-PCR技术,以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出犬GM-CSF基因。结果表明:扩增片段长为435 bp,编码144个氨基酸;生物软件分析结果表明,该序列与猕猴的亲源性更近,与已知人、马、牛、野猪、豹猫、鸡等序列的同源性较低。     

犬GM-CSF基因对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白.利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应.为进一步提高VP2 DNA疫苗的免疫活性,本实验利用犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因作为生物佐剂研究其对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用.首先通过RT-PCR方法从犬淋巴细胞中扩增GM-CSF基因,并将其插入到pcDNA3.1栽体上,分别构建该基因的两个分泌型真核表达载体,即非融合表达载体pcDNA-cGMCSF和与Myc His融合的表达栽体pcDNA-cGMCSF/MH.用pcDNA-cGMCSF/MH载体转染HEK293T细胞以确定GM-CSF基因能否在真核细胞中进行分泌表达.然后用本室构建的VP2基因表达栽体单免疫小鼠,用VP2表达载体与pcDNA-cGMCSF共免疫小鼠(pcDNA3.1空载体作为阴性对照).免疫后用ELISA方法检测不同时间小鼠血清的抗体水平.用MTT法检测小鼠免疫后35 d时淋巴细胞的增殖活性,同时用ELISA试剂盒检测小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平.结果表明,本试验构建的表达载体能够介导重组GM-CSF在真核细胞中进行分泌表达.免疫实验表明,利用GM-CSF基因与VP2基因共免疫小鼠,抗体的水平明显高于VP2基因单免疫组(P＜0.01).共免疫组小鼠淋巴细胞的刺激指数和γ干扰素的表达水平均明显高于单免疫组(P＜0.05).由此可见,GM-CSF表达载体可明显提高CPV VP2 DNA疫苗的免疫应答水平.     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的原核表达和纯化

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)是一种具有多种生物学活性的细胞因子。本试验根据GenBank发表的猪的GM-CSF基因序列设计特异性引物,对GM-CSF基因片段进行扩增,扩增后的PCR产物经酶切后克隆入pET-28a载体。重组质粒转化入大肠杆菌杆菌BL21中经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果证明,重组蛋白获得了成功表达,并且主要以包涵体的形式存在。Western blot结果证明重组蛋白具有良好免疫反应性。以上结果为进一步应用重组GM-CSF作为血液干细胞动员剂提供了基础。     

鸡GM-CSF与生长抑素表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

本研究运用R T-PCR技术从萧山鸡脾脏细胞总R NA中扩增获得鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)成熟区序列,并进一步通过设计重叠引物构建出GM-CSF-SS(SS:生长抑素)嵌合基因,并将其在大肠杆菌中进行表达。结果表明:实验成功得到鸡GM-CSF成熟区片段(435 bp)和GM-CSF-SS嵌合基因(486 bp),并在大肠杆菌中成功表达出GM-CSF和GM-CSF-SS融合蛋白,分子量分别约为18 ku和20 ku,该研究为通过免疫途径提高动物生长性能提供基础。     

LPS诱导肺泡巨噬细胞法对奶牛GM-CSF的克隆与序列分析

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colonyst imulating fac- tor,GM-CSF)主要由T细胞和巨噬细胞产生,能够诱导粒细胞前体和巨噬细胞前体呈集落性生长(即形成集落).GM-CSF还具有种属特异性和造血,抗炎,增强中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬功能,增强巨噬细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用,对粒细胞和巨噬细胞有直接的趋化等作用.试验旨在应用RT-PCR技术扩增奶牛GM-CSF基因,为进一步了解奶牛的GM-CSF基因和获得重组蛋白打下基础.     

腺病毒表达鸡GM-CSF及其对鸡骨髓细胞增殖活性的检测

为了方便鸡粒细胞/巨噬细胞集落细胞刺激因子（GM-CSF）作为疫苗佐剂使用,用PCR方法扩增出鸡GM-CSF基因,将其连入人腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,将重组穿梭载体与腺病毒骨架重组后,获得重组腺病毒骨架载体,线性化后转染293SD细胞,获得能够表达鸡GM-CSF的腺病毒。将获得的重组腺病毒转导鸡成纤维细胞系DF1,细胞培养上清中,可以检测到GM-CSF刺激鸡骨髓细胞活性,为鸡GM-CSF进一步应用奠定了基础。     

奶牛粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的原核表达及其活性检测

为了表达奶牛粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)并对其活性进行检测.根据GenBank中登录的牛GM-CSF基因序列(U22385),设计一对特异性引物;采用RT-PCR方法,以LPS体外诱导的奶牛肺泡巨噬细胞为材料,从总RNA中扩增出奶牛GM-CSF cDNA基因,克隆到pGEM-T载体中,经酶切鉴定与序列测定,结果显示克隆的奶牛GM-CSF基因与GenBank中登录的牛GM-CSF基因序列的核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.7%和99.3%.构建pET32a-GM-CSF原核表达重组质粒,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示重组蛋白大小约为35 ku.分别运用集落形成试验与MTT比色法测定重组蛋白活性,结果显示重组奶牛GM-CSF蛋白能够诱导粒细胞前体呈集落性生长并具有较强的体外增殖淋巴细胞的活性,为下一步临床试验奠定了基础.     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达及其促淋巴细胞增殖活性测定

根据GenBank上公布的猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(pGM-CSF)基因序列(U67175.1)扩增该基因,克隆至pET30b载体,构建重组表达载体pET30b-pGM-CSF,并与分子伴侣辅助质粒pG-KJE8共同转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE分析,可见表达的目的蛋白大小约为23ku,主要以包涵体形式存在,且在分子伴侣的辅助下,增大了可溶性蛋白的表达量。经镍离子亲和层析纯化后,通过淋巴细胞增殖试验初步检测了pGM-CSF蛋白促进淋巴细胞增殖的活性。结果表明,猪GM-CSF具有明显的体外刺激淋巴细胞增殖的生物学活性,为进一步研究猪GM-CSF的生物学功能以及临床应用奠定了基础。     

白来航鸡IL-18和GM-CSF基因克隆与序列分析

根据GenBank中鸡白细胞介素18(IL-18)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的序列设计2对特异引物,以白来航鸡脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆白来航鸡IL-18和GM-CSF工基因并进行序列分析.测序结果表明,白来航鸡IL-18基因开放阅读框为597 bp,编码199个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡IL-18基因与GenBank中鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%.白来航鸡GM-CSF基因开放阅读框为435 bp,编码145个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡GM-CSF基因与GenBank鸡GM-CSF的核苷酸同源性为99.3%～100%,氨基酸同源性为99.3%～100%,生物信息学分析表明,IL-18与GM-CSF基因编码的蛋白具有亲水性,都有很强的抗原性,IL-18共有2个潜在的N-糖基化位点,可能存在4个蛋白激酶C磷酸化位点,存在3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点;GM-CSF共有1个潜在的N-糖基化位点,可能存在1个蛋白激酶C磷酸化位点,存在4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点.     

比格犬SLAM基因的克隆与序列分析

对比格犬的犬瘟热病毒细胞受体——信号淋巴细胞激活因子(SLAM)基因进行克隆及测序分析,并与其他物种的SLAM受体进行比较,以期发现其关键结构部分.用RT-PCR从Con A刺激后的犬外周血淋巴细胞中扩增SLAM基因,将目的片段连接到PMD18-T载体上,转化感受态细胞,筛选阳性克隆,测序.结果显示,克隆的比格犬SLA...     

古典式条件反射原理在工作犬训练中的应用

生理学家巴甫洛夫以犬为对象，通过采用一种原来与犬无关的条件刺激(如灯光)，与另一种对犬有生物学意义的非条件刺激(如食物)结合作用，引起犬出现食物反应(唾液分泌)，并经过多次重复结合后，只要单独使用灯光刺激而不用再结合食物，同样能引起食物反应，这说明灯光对犬已具有食物信号意义。犬的这种行为的产生把它称为条件反射。它的反应程序是刺激在前，行为在后，行为是刺激的结果，犬对刺激的反应是既定的。它的联系表现为：刺激——动作——强化——条件信号活动。     

犬白细胞介素18基因的克隆与序列分析

为研究犬白细胞介素18(IL-18)的生物学功能,从犬外周血中分离白细胞,经Con A刺激后,提取总RNA,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增犬IL-18基因,连接pMD19-T simple vector,转化DH5α感受态细胞,经双酶切鉴定,获得阳性重组质粒后进行序列分析。结果表明,获得的犬IL-18基因全长为582bp,编码氨基酸194个。将犬与GenBank中牛、猫、羊、猪、鼠、兔、狐、貉IL-18基因进行同源性比较,发现犬IL-18与红狐和貉IL-18的同源性最高,氨基酸序列同源性分别达96.4%、91.2%,与其他物种则存在较大种属差异。     

牛GM-CSF与金黄色葡萄球菌黏附素FnBPB共表达质粒的构建与原核表达

采用PCR方法对牛粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和金黄色葡萄球菌FnBPB的D区进行特异性的扩增,并通过重叠延伸PCR扩增GM-CSF-FnBPB串联基因,构建了克隆质粒pMD19-GM-CSF-FnBPB。利用表达载体pET-32a(+)对该融合基因片段进行原核表达,SDS-PAGE分析表明,在1mmol/L IPTG诱导浓度下,在39ku处出现了与目的蛋白一致的外源蛋白带,Western blot分析表明,该蛋白具有反应原性,进而证明该融合基因成功在原核细胞中表达。     

羊传染性脓疱病毒疫苗株和野毒株GIF基因比较分析

羊传染性脓疱(orf)是由羊传染性脓疱病毒(orf virus,ORFV)感染引起的绵羊和山羊的一种接触性人兽共患病。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)/白细胞介素(IL-2)抑制因子(GIF)基因为ORFV编码中晚期病毒基因,它能够与GM-CSF、IL-2结合并且抑制二者的活性,从而抑制宿主抗病毒作用。为了比较疫苗毒株和流行毒株间GIF的差异,本试验扩增并测定了ORFV疫苗株和野毒株的GIF基因序列,比较分析了ORFV疫苗弱毒株和野毒株GIF基因的核酸水平和氨基酸水平的差异情况,以及二、三级蛋白结构。结果表明:本次测定的ORFV疫苗株与野毒GIF基因核苷酸序列相似性为94.3%,氨基酸序列相似性为92.5%,两者的蛋白三级结构预测上也有差异。本研究结果为该病的防控提供了参考依据。     

利多卡因硬膜外麻醉对犬生理指标的影响及镇痛效果评估

为研究利多卡因硬膜外麻醉对犬生理指标的影响,以及分析和评估不同剂量利多卡因硬膜外麻醉对犬的镇痛效果,试验选择健康中华田园犬9只,分为空白组、低剂量(利多卡因,2 mg/kg)组、高剂量(利多卡因,4 mg/kg)组,按体重以适量丙泊酚进行诱导麻醉,于腰椎与荐椎结合处穿刺进入硬膜外腔,并分别注入不同剂量的利多卡因或生理盐水,通过其对痛觉刺激的反应和生理指标(体温、心率、呼吸频率)的变化来评估麻醉效果,最终确定利多卡因硬膜外麻醉剂量。结果表明:麻醉5 min后高剂量组犬的体温显著低于低剂量组和空白组(P0.05);麻醉后25～45 min,高剂量组犬的呼吸频率显著高于低剂量组和空白组(P0.05)。低剂量组犬麻醉5分钟时,对前肢痛觉刺激后心率较刺激前显著升高(P0.05),而此时对后肢进行痛觉刺激发现,刺激前后心率无显著变化(P0.05);至麻醉20分钟时,后肢痛觉刺激后心率较刺激前显著升高(P0.05)。高剂量组犬麻醉10分钟时,前肢痛觉刺激后心率较刺激前显著升高(P0.05),而此时对犬的后肢进行痛觉刺激犬的心率与刺激前无显著变化(P0.05);麻醉45分钟时,对后肢进行痛觉刺激后心率较刺激前显著升高(P0.05),表明高剂量利多卡因硬膜外麻醉对犬后肢的痛觉反射有一定影响,且该影响能维持一定时间。高剂量组犬的后肢痛觉刺激前后心率变化不显著的持续时间要长于低剂量组,而低剂量组长于空白组。三组犬的前肢在麻醉过程中均有痛觉反射,低剂量组后肢在第20分钟开始出现痛觉反射,而高剂量组犬的后肢于麻醉后第40分钟出现痛觉反射。说明4 mg/kg利多卡因进行硬膜外麻醉具有较好的镇痛效果,可用于犬后肢外科手术中疼痛管理。     

CDV、CPV和CPIV多重PCR检测方法的建立

为了建立一种快速诊断犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的多重PCR方法,参照GenBank中的犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)基因序列,设计了3对引物分别用于特异扩增犬瘟热病毒F基因、犬细小病毒VP2基因和犬副流感病毒F基因上的目的片段.通过优化反应条件,建立同时扩增CDV(740 bp)、CPV(419 bp)和CPIV(559 bp)的多重PCR方法.结果表明特异性和敏感性良好,对CDV、CPV、CPIV3种病毒的最低核酸检测量为1 ng/μL.临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对CDV、CPV、CPIV单个感染或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

犬瘟热病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬瘟热病毒(CDV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,采用RTPCR扩增CDV F基因269bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了CDV荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.6×101拷贝/μL,与犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的CDV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床犬瘟热(CD)的检测。     

犬类几种常见传染病诊断中基因芯片的应用

采用PCR技术扩增出犬腺病毒(CAV)ORF(P-VIII)基因、犬细小病毒(CPV)VP2基因、鸡血红蛋白的珠蛋白基因片断;采用RT-PCR扩增出犬冠病毒(CCV)纤突蛋白(S)基因、犬瘟热病毒(CDV)融合蛋白(F)基因、犬副流感病毒(CPIV)核衣壳结构蛋白(NP)基因、狂犬病病毒(RV)核蛋白(N)基因的各一段保守序列,纯化后点在硝酸纤维素膜上,制成基因芯片。通过RT-PCR将生物素标记到被检样品的核酸上,将已经标记的扩增产物与诊断基因芯片进行特异性的逆向点杂交,然后扫描仪对芯片进行扫描分析、判断。结果表明,此方法比病毒分离、HI、PCR方法灵敏度高、特异性强,平均检出率要高20%以上,并可同时对犬多种疫病进行快速诊断。     

犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒三重PCR检测方法的建立

参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)和犬冠状病毒(CCV)的基因序列保守片段分别设计特异性引物,建立了可以同时检测CDV(684 bp)、CPV(213 bp)和CCV(417 bp)的三重PCR方法。特异性结果表明,所建立的体系只能扩增CDV、CPV、CCV,而不能扩增犬腺病毒Ⅱ型(CAV-Ⅱ)和犬副流感病毒(CPIV);敏感性试验表明,该方法对CDV、CPV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10-2、6.0×10-2和6.7×10-2copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。采用建立的三重PCR方法对北京、山东地区收集的临床粪便样品进行检测结果表明,使用三重PCR体系的扩增结果与单项PCR扩增结果一致,符合率为100%。以上结果表明该方法快速、敏感、特异性强,对上述3种病毒能够进行快速鉴定诊断,为临床诊断提供了快速简便的方法。     

吉林株犬新孢子虫的分离与鉴定

将疑似感染犬新孢子虫而流产的牛胎儿脑组织接种于Vero细胞进行体外培养,同时感染长爪沙鼠进行动物试验.提取牛流产胎儿脑组织DNA、沙鼠脑组织DNA、细胞培养虫体DNA,用犬新孢子虫特异性引物进行PCR扩增.结果显示,PCR扩增出了1条约为681 bp的目的条带;测序结果表明,扩增出的特异性目的基因序列与GenBank中发表的犬新孢子虫NcSAG1基因(AF113004)核苷酸序列的同源性为99.4%.结果表明,在吉林省牛流产胎儿脑组织中分离出犬新孢子虫.