昆明系小鼠胚胎干细胞分离培养的优化

以昆明系小鼠为对象,经过丝裂霉C处理成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)制备饲养层,对影响小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)分离培养的相关因素进行研究。分别收集小鼠3.5d的囊胚(扩张囊胚)和4.5d囊胚(孵化囊胚)进行培养,比较扩张囊胚和孵化囊胚的贴壁率、原代克隆率及传代率的情况。收集3.5d胚龄的囊胚,通过全胚法和免疫外科法对内细胞团(Inner cell mass,ICM)进行分离培养ICM集落,确定离散ICM的适宜时间。用0.25%胰酶+0.04%EDTA,0.125%胰酶+0.02%EDTA和0.25%胰酶+1%小鸡血清等方法对小鼠ES细胞集落进行传代,观察不同酶浓度对ES细胞分离克隆的影响。结果显示,孵化囊胚的贴壁率高于扩张囊胚(P0.05),但传代率则相反(P0.05),原代克隆率差异不显著(P0.05);一般ICM增殖培养2～3d(免疫外科法)或4～5d(全胚培养法)后,出现典型的克隆集落,再挑取ICM;0.125%胰酶+0.02%EDTA及0.25%胰酶+1%小鸡血清,形成ES原代克隆率较高,2组没有显著性差异(P0.05);结果表明,分离得到的ES细胞经形态学观察,AKP染色,体外分化试验等表明其具有胚胎干细胞的特性。     

山羊原始生殖细胞分离与培养的影响因素

以本地白山羊胎儿的生殖嵴为试验材料,从原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)中分离培养得到胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EGCs),对其进行体外培养和鉴定等。胎儿生殖嵴在室温(25℃)下消化15 min,使用0.125%胰酶+0.02%EDTA比0.25%胰酶+0.04%EDTA效果好,差异显著(P<0.05);挑取集落法和胰酶消化法均能将PGCs传至第2代,两种方法差异不显著(P>0.05);以GEF为饲养层,在培养液中添加不同浓度和种类的细胞因子:①LIF:10 ng/mL;②LIF:20 ng/mL;③LIF(10 ng/mL)+SCF(10 ng/mL);④LIF(20 ng/mL)+SCF(20 ng/mL)。4种情况对于原代集落形成率的影响差异不显著(P>0.05),均能得到传至第2代的EGCs;研究不同胎龄胎儿分离培养PGCs的效果,结果发现4例冠臀长小于15 mm的胎儿仅观察到一个原代集落,6例大于30 mm的胎儿没有观察到原代集落。     

鸡胚胎原始生殖细胞的体外培养

旨在对影响鸡胚胎原始生殖细胞（PGCs）体外培养、传代过程的各种影响因素进行探讨。将分离到的19期鸡胚胎生殖腺的PGCs在以鸡胚成纤维细胞（CEF）为饲养层，添加细胞因子的培养体系中进行培养、传代。经冷冻保存的PGCs在添加细胞因子的培养体系中能增殖，并具有分化能力。从细胞形态、集落形态、增殖生长能力、核型检测、碱性磷酸酶测定等方面对培养过程中的鸡胚胎PGCs进行检测。结果表明，采用传至3代的CEF为饲养层，多次离散法进行传代所获得的5代鸡胚胎PGCs不但能有效维持PGCs的未分化状态和正常二倍体核型，也具有其作为多能性胚胎干细胞的一系列特征。     

不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期和增殖的影响

为了研究不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期、增殖及相关基因表达的影响。本研究分别用不同浓度GnIH（0、0.1、1、10和100 ng·mL^-1）处理体外培养的鸭颗粒细胞24 h（n=3），观察细胞的生长状态，通过流式细胞术和EdU方法检测细胞周期和细胞增殖，并用qRT-PCR方法检测增殖相关基因CDK6、CyclinD1、IGF-2、IGFBP-2、p27^kip1的表达。结果显示，各浓度GnIH处理组的细胞生长状态良好，形态正常，细胞轮廓清晰，组间死亡细胞数差异不显著（P>0.05）；在0.1和1 ng·mL^-1 GnIH处理组，细胞周期阻滞在G2期的比例显著上升（P<0.05）；随着GnIH处理浓度的增加，EdU阳性细胞数所占的百分比降低；在0.1和1 ng·mL^-1 GnIH处理组，颗粒细胞中CDK6、CyclinD1、IGF-2、IGFBP-2、p27^kip1基因的相对表达量均下降，在10和100 ng·mL^-1 GnIH处理组中这些基因的相对表达量则有所上升。研究表明，在体外培养的鸭颗粒细胞中，GnIH能使细胞周期阻滞在G2期，并降低EdU阳性细胞所占百分比和下调增殖相关基因的表达水平，从而抑制颗粒细胞增殖来影响动物繁殖性能。     

山羊毛囊干细胞的分离及体外培养

试验采用2．4U／mL Dispase酶消化和机械切割法分离毛囊隆突部,经胰酶（0．5mg／mL胰酶＋0．2mg／mL EDTA）消化从山羊耳部皮肤分离得到的毛囊干细胞,然后进行形态学观察、细胞生长曲线测定、克隆形成率及免疫组化染色检测,并对毛囊干细胞的基础培养基进行了筛选。结果表明：DMEM／F12是一种适合毛囊干细胞体外增殖培养的培养基;在以DMEM／F12为基础培养液的培养体系中细胞可传代至19代。     

不同影响因素对水牛原始生殖细胞分离培养的影响

探讨了不同影响因素(性别、胎龄、分离方法)对水牛原始生殖细胞(PGCs)分离培养的影响.结果显示:PGCs多层堆积生长形成克隆,该克隆具有明显的边界与饲养层区分;PGCs表达AKP和OCT-4;公胎牛组的克隆总数和克隆直径都显著高于母胎牛组,(179和32,(227.76±83.84)μm和(102.34±40.59)μm),P<0.05;在原代克隆数目上,80～90 d组只有16个克隆,显著低于其他各组(P<0.05),在克隆直径上,80～90 d组为(190.63±65.11)μm,也显著低于除70～80 d组外的其他各组(P<0.05),并且在最高传代数上,80～90 d组仅为3代,而其他各组都达到或超过了6代;机械分离组在克隆总数和直径上都显著高于胰酶消化组,(186和30,(216.95±77.41)μm和(140:t=38.76)μm),P<0.05,并且机械分离组的最高传代数为8代,而酶消化组仅为3代.结果表明,本试验分离培养出的水牛PGCs具有与已经分离培养出来的其他物种PGCs相似的生物学特性;公胎牛、胎龄小于80 d以及使用机械分离方法更利于水牛PGCs的分离培养.     

新生牛雄性生殖细胞源类ES的培养及检测

采用贴壁速率差法分离纯化的新生牛雄性生殖干细胞（Male germ stem cell，mGSCs）和支持细胞（Calf sertoli cell，CSCs）；CSCs饲养层细胞一般维持时间不超过8d；新生牛雄性生殖干细胞在CSCs饲养层上1代培养至5～6d可形成类ES细胞集落，采用机械离散集落传代法有利于集落形成或存在，传代培养至少在前2代细胞集落存在；部分典型细胞集落的中心细胞AKP强阳性，周边细胞AKP弱阳性或阴性；免疫组化检测显示，细胞集落SSEA1强阳性、SSEA3弱阳性和Oct-4呈现阳性染色。表明mGSCs具有ES细胞的某些细胞特性。     

坝上长尾鸡原始生殖细胞的分离、培养与鉴定

为了研究坝上长尾鸡的原始生殖细胞(primordial germ cell,PGCs),试验分别从孵化至13~15期的坝上长尾鸡鸡胚血液和5.5 d的鸡胚生殖嵴中分离得到PGCs,接种于24孔培养板,以鸡胚成纤维细胞(CEF)为饲养层,添加细胞因子的培养体系,在温度37℃、95%空气和5%CO2培养箱中进行体外培养和传代,借助组织化学及免疫组织化学方法进行染色,并采用PAS(高碘酸希夫氏染色)、AKP(碱性磷酸酶染色)以及SSEA-1等方法进行鉴定。结果表明:PGCs集落有典型的鸟巢状结构,且PAS、AKP以及SSEA-1染色呈阳性。     

细毛羊毛囊干细胞分离培养方法比较研究

试验旨在对细毛羊毛囊干细胞的分离培养方法进行初步研究,建立细毛羊毛囊干细胞体外培养体系。采用两步酶消化法、机械分离法和两步酶消化法+机械分离法3种方法分离培养细毛羊毛囊干细胞,通过测定毛囊干细胞的数量、克隆形成率及毛囊干细胞的增殖能力等综合评估3种培养方法的优劣,寻求既能方便获得大量毛囊干细胞,又能减少其分化的理想培养条件。倒置显微镜下观察3种培养方法获得的细胞均为铺路石状,均表达角蛋白K19和整合素β1,表明成功获得细毛羊毛囊干细胞,建立体外培养体系。采用"两步酶消化法和机械分离法"相结合的方法获得毛囊干细胞体外培养效果最优。     

蒙古马睾丸支持细胞的体外分离培养与鉴定

为研究一种简单快速分离蒙古马睾丸支持细胞并保证其活性的基本方法,本试验采集2岁蒙古马睾丸组织于低温环境下进行机械分离,将1~3 g睾丸组织剪碎,采用重力沉淀法去除游离的红细胞和间质细胞;使用0.1%胶原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶+EDTA逐步进行组织消化,并用含有10%胎牛血清的培养基进行细胞培养;在接种后采用差异贴壁法分离纯化支持细胞,使用Tris-HCl低渗法去除杂质细胞,并采用碱性磷酸酶（AKP）染色、HE染色、实时荧光定量PCR方法进行鉴定。结果显示,支持细胞贴壁性能较强,培养24 h后大多数细胞开始贴壁,细胞形状呈椭圆形;培养48 h后胞质增多,折光性变强;培养3~4 d细胞胞质展开紧密连接,此时细胞呈三角形,有明显的核仁,培养6~7 d细胞生长状态进入稳定期。实时荧光定量PCR结果显示,GATA4和GDNF基因在培养细胞中极显著表达（P<0.01）,AKP染色支持细胞呈阴性表达,表明分离培养的细胞确为支持细胞。本试验使用机械分离法与两步酶消化法处理组织,可快速高效地获得睾丸支持细胞,成功构建了蒙古马睾丸支持细胞体外培养方法。     

脱氧雪腐烯醇(DON)对牛卵母细胞体外成熟及发育能力的影响

本试验旨在探究脱氧雪腐烯醇（DON）对牛卵母细胞体外成熟发育的影响及其作用机制。将牛卵丘卵母细胞复合体分别在含DON浓度为0、50、250、500、1 000 ng·mL^-1的体外成熟培养液中进行体外成熟,检测卵丘细胞扩展程度及第一极体排出率,构建DON毒性模型。然后,借助此模型研究DON对卵母细胞的线粒体分布及后续受精卵裂率、囊胚发育率的影响,探究DON对牛卵母细胞体外成熟及后续发育能力的影响;通过检测体外成熟卵母细胞内的氧化相关因子（ROS、GSH）水平和抗氧化基因CAT、GPx4的mRNA表达量,揭示DON影响牛卵母细胞体外发育能力的分子机制。结果表明,250、500 ng·mL^-1的DON显著抑制卵母细胞的第一极体排出（P<0.05）,1 000 ng·mL^-1的DON极显著抑制第一极体排出（P<0.01）; 250 ng·mL^-1的DON显著抑制卵丘卵母细胞扩展（P<0.05）,500、1 000 ng·mL^-1的DON极显著抑制卵丘细胞扩展（P<0.01）;后续试验选取DON浓度为500 ng·mL^-1作为毒性模型（DON组）,与不含DON组（对照组）进行比较研究,结果发现,对照组与DON组的线粒体均匀分布比例（60.2%vs.40.0%）存在显著差异（P<0.05）;试验组较对照组的受精卵裂率（33.6±3.6%vs.（67.7±2.6）%）及早期囊胚率（（0.0±0.0）%vs.（18.3±2.2）%）均显著降低（P<0.05）;试验组较对照组,卵母细胞内ROS水平（1.6 vs.1.0）显著升高（P<0.05）,GSH相对水平（0.4 vs.1.0）显著降低（P<0.05）,抗氧化基因CAT与GPx4的mRNA相对表达量（0.0 vs.1.0;0.6 vs.1.0）显著降低（P<0.05）。以上研究表明,DON对卵母细胞的体外成熟及早期胚胎发育具有抑制作用,其作用机制与DON破坏牛卵母细胞内抗氧化系统平衡相关。     

Culture of Piglet Intestinal Epithelial Cells in vitro and the Infectivity of Porcine Epidemic Diarrhea Virus on the Cells

The study was aimed to establish a simple in vitro culture system for piglet small intestinal epithelial cells,and to provide materials for researches on porcine epidemic diarrhea virus (PEDV).In this study,newborn piglets that did not eat colostrum were used as the initial donors,and the primary cells were separated in vitro by scraping the intestinal mucosa from the intestinal lumen and mechanical separation and dispersion.The piglet intestinal epithelial cells were purified using 0.1% trypsin differential digestion method.Compared the effects of newborn weak piglets and normal piglets as donors on the activity of primary intestinal epithelial cells.MTT method was used to compare the proliferation activity of primary cells of different generations.Immunofluorescence and Real-time RT-PCR were used to detect the infection and proliferation of PEDV strain CV777 in primary intestinal epithelial cells.The results showed that the isolation and culture method in vitro used in this study could obtain primary intestinal epithelial cells with good proliferation activity,with obvious S-type cell proliferation curves.The cells with high purity and single morphology could be obtained by differential digestion,and had good proliferation activity after five consecutive passages.The proliferative activity of intestinal epithelial cells isolated from weak piglets and normal piglets had no obvious difference,and provided new way for reducing the cost of primary cell culture.The results of immunofluorescence and Real-time RT-PCR showed that PEDV could infect the primary intestinal epithelial cells,and replicated and proliferated in them.In this study,we established a simple,practical and low-cost method for in vitro culture of piglet primary small intestinal epithelial cells.The primary cells cultured by this method could be used as basic materials for the isolation and culture of PEDV and related research.     

仔猪小肠上皮细胞的体外培养及猪流行性腹泻病毒对其感染性研究

本研究旨在建立一种操作简单的仔猪小肠上皮细胞体外培养体系，为猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）的相关研究提供材料。研究以未吃初乳的新生仔猪作为肠道供体，采用肠腔面刮取肠黏膜和机械分离分散的方式进行原代细胞的体外分离。采用0.1%胰蛋白酶差速消化法进行仔猪小肠上皮细胞的纯化；比较新生弱仔猪和正常仔猪作为供体对原代小肠上皮细胞活性的影响；MTT法比较不同代次原代细胞的增殖活性；免疫荧光和实时荧光定量RT-PCR方法检测PEDV毒株CV777在原代小肠上皮细胞感染和增殖情况。结果显示，本研究建立的体外分离培养方法能获得增殖活性良好的原代小肠上皮细胞，具有明显的"S"型细胞增殖曲线。通过胰酶差速消化可得到纯度高、形态单一的小肠上皮细胞，同时细胞连续传代5次仍保持良好的增殖活性。弱仔猪和正常仔猪分离培养的小肠上皮细胞的增殖活性比较显示，两者并没有明显区别，这为降低原代细胞培养的成本提供新的思路。免疫荧光和实时荧光定量RT-PCR结果显示，PEDV可感染本方法分离培养的仔猪原代小肠上皮细胞，并在其中进行复制增殖。本研究建立了一种操作简单、实用性强、成本较低的仔猪原代小肠上皮细胞体外培养方法，该方法培养的原代细胞可作为PEDV分离培养和相关研究的基础材料。     

禽源烟曲霉菌和黄曲霉菌的分离鉴定及几种中药抑菌作用研究

[目的] 对保定市临床真菌感染病鸭进行菌株分离鉴定，并筛选分离菌株的体外抑菌药物。[方法] 通过形态学观察、PCR扩增、测序及动物回归试验对菌株进行鉴定，并采用微量稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）及体外药敏试验统计菌落数量和直径来探究石菖蒲、黄柏、决明子、苦参、辣蓼、白头翁和蒲公英对烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）和黄曲霉菌（Aspergillus flavus）的体外抑菌活性。[结果] 成功分离到烟曲霉菌和黄曲霉菌。动物回归试验结果显示，雏鸡出现与病鸭相似的症状，剖检可见肝脏长出灰白色结节，且病变组织出现肉芽肿病变，说明2种病原菌均可使雏鸡感染。烟曲霉菌MIC₈₀结果显示，石菖蒲、黄柏、决明子和苦参MIC₈₀分别为8、16、32和64 μg/μL，辣蓼、白头翁和蒲公英均为128 μg/μL；黄曲霉菌的MIC₈₀结果显示，石菖蒲、决明子和黄柏MIC₈₀分别为8、16和32 μg/μL，苦参和辣蓼均为64 μg/μL，白头翁和蒲公英均为128 μg/μL。体外药敏试验结果显示，在石菖蒲浓度为16 μg/μL时培养基长出烟曲霉菌和黄曲霉菌菌落，在决明子浓度为32 μg/μL时培养基长出黄曲霉菌菌落，黄柏浓度为32 μg/μL时培养基中长出烟曲霉菌菌落，而在苦参、辣蓼、白头翁和蒲公英浓度128 μg/μL培养基中就已长出直径较大的烟曲霉菌和黄曲霉菌菌落。[结论] 石菖蒲、黄柏和决明子对烟曲霉菌和黄曲霉菌的生长具有显著的抑制作用，其中石菖蒲的抑制作用最为显著。本试验可为抗家禽曲霉病的中药研发提供新的思路。     

旋毛虫重组二肽基肽酶1在体外对大鼠外周血单个核细胞增殖、吞噬、凋亡等的影响

本文旨在分析旋毛虫二肽基肽酶1（dipeptidyl-peptidase 1，Dpp1）在体外对大鼠外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）增殖、迁移、凋亡以及一氧化氮（NO）分泌和吞噬功能的影响。根据GenBank中旋毛虫Dpp1基因序列设计一对特异性引物，RT-PCR获得该基因，将其亚克隆到pET-32a原核表达载体，IPTG诱导后获得重组蛋白rDpp1。将大鼠PBMCs与rDpp1共孵育，用间接免疫荧光试验（IFA）分析rDpp1与大鼠PBMCs的结合情况，分析不同质量浓度（10、20、40 μg·mL^-1）的rDpp1对细胞增殖、迁移、NO分泌、吞噬功能和细胞凋亡的影响。结果表明，40 μg·mL^-1rDpp1极显著促进PBMCs增殖；10 μg·mL^-1rDpp1能显著促进PBMCs迁移，而20及40 μg·mL^-1时表现极显著的促进；20与40 μg·mL^-1rDpp1极显著促进PBMCs分泌NO；10 μg·mL^-1rDpp1能显著促进PBMCs的吞噬功能，而20及40 μg·mL^-1时表现极显著的促进；各质量浓度蛋白均极显著地促进PBMCs的凋亡。旋毛虫二肽基肽酶1在体外能通过多种途径影响大鼠外周血单个核细胞，对调节宿主免疫应答有一定的促进作用。     

原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养方法的改进

目前利用奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术，建立奶牛子宫内膜炎模型从而减少不可控因素来研究奶牛子宫内膜炎疾病已成为国内外普遍使用的一类方法，因此获得高纯度、同一性的子宫内膜上皮细胞是体外研究的关键环节，国内外所使用方法主要是酶消化法、组织块贴壁法和组织块消化贴壁法。本文旨对先前的方法进行改良，建立一种简便易行、培养周期短、细胞活性及形态良好的原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术。采用健康未孕奶牛子宫为试验材料，取下子宫内膜组织，加入5 mL含2%双抗、40%胰酶的DMEM/F12培养基，4 ℃消化12 h，再将组织移至25 cm²细胞培养瓶中贴壁培养。获得原代细胞后，应用角蛋白-18抗体对细胞进行免疫组化荧光鉴定，并对第3代细胞采用CCK-8法测定不同时间点的D_{450 nm}值，绘制细胞生长曲线。结果显示，培养至第8天，原代细胞基本铺满细胞培养瓶瓶底，有效地缩短了常规组织块贴壁法的周期。通过角蛋白-18免疫组化荧光鉴定，原代上皮细胞的阳性率可达98%以上，相比常规组织块贴壁法来说，纯度明显提高，省去了细胞纯化的操作步骤。细胞增殖状态，符合正常的分裂生长特性。试验结果表明将常规组织块贴壁法进行了优化改良，不仅缩短了培养周期，同时提高纯度，保持细胞活性，为原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术的改良提供一定的参考。     

桧烯抗弓形虫活性的体外评价

本研究旨在筛选具有抗弓形虫活性的萜类化合物,并进行体外活性评价。对26个萜类化合物进行体外抗弓形虫增殖作用的筛选,采用CCK-8法确定活性化合物对Vero细胞的毒性和安全浓度,Giemsa染色进一步确定对弓形虫的活性,通过细胞免疫荧光、Giemsa染色和生物化学发光法评价活性化合物对弓形虫的体外活性。结果表明,26个萜类化合物中,桧烯对弓形虫有显著的活性,桧烯对RH-2F的IC₅₀为90.76 μg·mL^-1,Giemsa染色和细胞免疫荧光的结果表明,桧烯对细胞内的两种弓形虫虫株都有显著的抗增殖作用,并且对弓形虫的入侵有极显著的抑制作用（P<0.001）。综上表明,桧烯对弓形虫的入侵和细胞内增殖具有显著的抑制作用,可作为潜在的抗弓形虫先导化合物。     

视黄酸诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究

体外胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）向生殖细胞分化可用于治疗不育症,同时也为揭示种系世代的分子机制提供最佳模型。试验旨在探讨视黄酸（retinoic acid,RA）诱导鸡胚胎干细胞（chicken embryonic stem cells,cESCs）向雄性生殖细胞（male germ cells,MGCs）分化的作用效果。利用胰蛋白酶消化法从新鲜种蛋X期鸡胚中分离胚胎干细胞,以鸡胚成纤维（chicken embryo fibroblast,CEF）细胞为滋养层,进行体外培养,利用形态法、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）染色和胚胎阶段特异性表面抗原（embryo specific surface antigen 1,SSEA-1）检测对获得的胚胎干细胞进行鉴定。结果表明,获得典型的呈巢状或岛状的cESCs克隆,细胞AKP染色呈蓝紫色,表明其具有较高的内源性AKP活性;SSEA-1鉴定结果呈阳性,显示cESCs克隆具有多能性。采用10^-5 mol/L RA诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化,镜下观察细胞形态变化,分别于诱导第0、2、4、6、8、10天提取细胞总RNA,反转录成cDNA,用于实时荧光定量PCR检测生殖细胞标志基因的表达。结果表明,在此诱导过程中,作为胚胎干细胞标志基因Nanog、Sox2表达量持续显著下降,而生殖细胞特异性基因Dazl、Stra8、c-kit、integrin α6表达量呈持续上升趋势;免疫细胞化学检测可观察到特异基因相关蛋白的阳性克隆。本研究成功分离出cESCs,可体外培养并保持未分化状态及多能性。10^-5 mol/L RA能够促进cESCs向雄性生殖细胞方向分化,可以引起生殖细胞相应基因的表达,为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供参考。