柔嫩艾美尔球虫与肠炎沙门菌混合感染对雏鸡盲肠菌群的影响

为探讨柔嫩艾美尔球虫与肠炎沙门菌单独感染及混合感染对盲肠肠道菌群的影响,12日龄莱航鸡口服单独或混合感染柔嫩艾美尔球虫或肠炎沙门菌,18日龄通过16SrRNA Miseq高通量测序检测鸡盲肠菌群组成。结果表明,18日龄莱航鸡盲肠内主要菌群为厚壁菌门和拟杆菌门。与柔嫩艾美尔球虫或肠炎沙门菌单独感染相比,混合感染导致肠杆菌科明显增加,毛螺菌科明显减少;因此,柔嫩艾美尔球虫与肠炎沙门菌混合感染对盲肠肠道菌群的影响与两者单独感染明显不同。     

甘露寡糖添加方式对哺乳期犊牛瘤胃细菌菌群结构的影响

为利用16S rDNA技术研究甘露寡糖不同添加方式对哺乳期犊牛瘤胃细菌菌群结构影响,本研究选用出生日龄一致、体重接近、健康状况良好的荷斯坦公犊牛20头,随机分为4组。CR组为对照组,饮用乳及开食料中均不添加甘露寡糖;ORa组在饮用乳中添加5 g甘露寡糖,开食料中不添加甘露寡糖;ORb组在开食料中添加5 g甘露寡糖,饮用乳中不添加甘露寡糖;ORc组在饮用乳及开食料中各添加2.5 g甘露寡糖(混合添加)。应用16S rDNA测序技术,研究了甘露寡糖添加方式对犊牛瘤胃细菌构建的影响。结果表明:甘露寡糖添加方式会影响哺乳期犊牛瘤胃细菌总数,但对哺乳期犊牛瘤胃细菌菌群多样性未产生显著影响(P>0.05)。在门水平上,与对照组相比,ORb组颗粒料中添加甘露寡糖显著降低了厚壁菌门与放线菌门的丰度(P<0.05),极显著提高了变形菌门的丰度(P<0.01),优势菌门增加为3种,分别为拟杆菌门、厚壁菌门与变形菌门。在属水平上,甘露寡糖不同添加方式导致哺乳期犊牛瘤胃细菌菌群结发生了改变,其中甘露寡糖不同添加方式对小杆菌属和脱硫弧菌属在瘤胃内丰度均产生了影响,但对ORa组与ORc组犊牛瘤胃细菌影响不及ORb组;且ORb组犊牛瘤胃细菌功能性菌属普雷沃氏-7属、氨基酸球菌属、优杆菌属和琥珀酸弧菌等均发生显著变化。基于以上结果,得出如下结论:本研究条件下,甘露寡糖添加方式对哺乳期犊牛瘤胃细菌菌群多样性未产生显著影响(P>0.05),但开食料中寡糖添加方式对菌群结构产生部分影响,其中发挥瘤胃蛋白降解作用和淀粉降解作用的琥珀酸弧菌科-UCG-001属、利用乳酸的新月形单胞菌属丰度极显著提高(P<0.01),而利用乳糖的优杆菌属丰度显著降低,降解半纤维素的小杆菌属丰度极显著降低(P<0.01)。     

柔嫩艾美耳球虫感染对鸡盲肠中一些正常厌氧微生物菌群动态的影响

通过对鸡感染柔嫩艾美耳球虫时盲肠中常见正常厌氧微生物的变化情况进行检测研究发现:鸡在感染球虫后第7、10、14天时盲肠中类杆菌(Bacteriodes)的数量显著减少(P<005),而梭状芽孢杆菌(Clostridium)则显著增多;在球虫感染后的第7、10天时,盲肠中的消化球菌(Peptostreptocuccus)和真杆菌(Eubacterium)呈显著下降(P<005)。上述结果从一个方面阐明了柔嫩艾美耳球虫感染导致对某些其它感染抵抗力下降的机制。     

基于MiSeq高通量测序方法研究酵母壁多糖对断奶仔猪盲肠菌群结构的影响

本试验旨在探讨饲粮中添加酵母壁多糖对断奶仔猪盲肠菌群结构的影响。采用单因素试验设计,选取180头遗传背景相同、胎次相近、体重接近的21日龄断奶仔猪,随机分为4个处理,每个处理5个重复,每个重复9头猪。4个处理分别饲喂0%酵母壁多糖饲粮(对照组)、0.15%酵母壁多糖饲粮(0.15%组)、0.30%酵母壁多糖饲粮(0.30%组)和0.45%酵母壁多糖饲粮(0.45%组)。试验期为21 d。取盲肠内容物提取细菌DNA,PCR扩增获得16S r RNA基因V4标签片段,进行Mi Seq高通量测序。结果表明:当酵母壁多糖添加量达一定程度时,仔猪盲肠菌群多样性会发生改变;在不考虑群落中每个物种丰度的前提下,0.30%酵母壁多糖组仔猪盲肠菌群最丰富;仔猪盲肠优势菌群为拟杆菌门、厚壁菌门、螺旋体门和变形菌门;与对照组相比,添加0.30%酵母壁多糖能降低仔猪肠道拟杆菌门含量(P0.05),添加0.30%或0.45%酵母壁多糖能显著增加盲肠厚壁菌门含量(P0.05),添加0.45%酵母壁多糖还能提高仔猪盲肠软壁菌门含量(P0.05);酵母壁多糖具有降低盲肠变形菌门含量的趋势(P=0.066);普氏菌属为仔猪盲肠优势菌属,酵母壁多糖能显著提高仔猪盲肠厌氧弧菌属、瘤胃杆菌属、粪球菌属和考拉杆菌属的含量(P0.05),显著降低链球菌属的含量(P0.05)。由此可知,当酵母壁多糖添加量达到一定水平时,短期添加可提高断奶仔猪盲肠厚壁菌门以及瘤胃杆菌属和粪球菌属等优势菌群的含量。     

四川白鹅不同肠段菌群多样性比较研究

试验利用Illimina MiSeq高通量测序对70日龄四川白鹅十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物进行微生物多样性分析。结果显示:①4个肠段微生物群落的α多样性(菌群丰度上)存在显著差异(P0.05);②4个肠段的菌群结构在6个菌门和13个菌属的相对丰度存在显著差异(P0.05);③盲肠微生物在7个菌属(脱硫弧菌属、拟杆菌属、拟杆菌属、相炭疽杆菌属、瘤胃球菌属、韦荣球菌属和Butycricimonas菌属)的相对丰度都显著高于其他3个肠段(P0.05),但是空肠的链球菌属和回肠的SMB53菌属的相对丰度均显著高于其他3个肠段(P0.05)。结果提示:鹅不同肠段的菌群组成存在显著差异,回肠和空肠微生物都参与粗纤维的消化,盲肠消化粗纤维的能力要强于其他3个肠段。     

饲粮中添加复合植物精油对58周龄海兰褐壳蛋鸡生产性能、蛋品质和肠道菌群结构的影响

本试验旨在探讨饲粮中添加复合植物精油(八角茴香精油和百里香精油)对58周龄海兰褐壳蛋鸡生产性能、蛋品质和肠道菌群结构的影响。选用产蛋率和体重相近的58周龄海兰褐壳蛋鸡360只,随机分为对照组和试验组2个组,每组6个重复,每个重复30只鸡。对照组饲喂基础饲粮,试验组饲喂基础饲粮+150 mg/kg复合植物精油。试验期49 d。结果表明:1)与对照组相比,试验组蛋鸡的产蛋率显著升高(P0.05),料蛋比和破蛋率显著降低(P0.05),平均日采食量和死淘率无显著差异(P0.05)。2)与对照组相比,试验组蛋鸡的蛋黄色泽、蛋白重量显著升高(P0.05),其他蛋品质指标差异无显著差异(P0.05)。3)与对照组相比,试验组的Shannon指数显著降低(P0.05),Chao1指数、ACE指数和Simpson指数无显著差异(P0.05)。4)在门水平上,2组盲肠菌群主要为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)。与对照组相比,试验组拟杆菌门的相对丰度显著升高(P0.05),厚壁菌门和梭杆菌门的相对丰度显著降低(P0.05)。5)在属水平上,与对照组相比,试验组的拟杆菌属(Bacteroides)和unidentified_Ruminococcaceae的相对丰度显著升高(P0.05),梭形杆菌属(Fusobacterium)、瘤胃球菌科_UCG-005属(Ruminococcaceae_UCG-005)、厌氧球菌属(Anaerotruncus)的相对丰度显著降低(P0.05),瘤胃球菌科_UCG-014属(Ruminococcaceae_UCG-014)和克里斯滕森菌科_R-7族群(Christensenellaceae_R-7_group)的相对丰度有降低趋势(P=0. 060)。由此可见,在本试验条件下,饲粮中添加150 mg/kg复合植物精油能够改善58周龄海兰褐蛋鸡的生产性能,加深蛋黄颜色,提高盲肠拟杆菌门的相对丰度,降低盲肠厚壁菌门和梭杆菌门的相对丰度,改善盲肠肠道菌群结构。     

雏鸡球虫病防治

<正>鸡球虫病是由艾美耳球虫属的球虫寄生于鸡的小肠与盲肠引起的一种原虫病。其中柔嫩艾美耳球虫寄生于盲肠又称盲肠球虫,巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、变位艾美耳球虫、哈氏艾美耳球虫寄生于小肠又称小肠球虫。     

柔嫩艾美耳球虫感染对鸡盲肠中一些正常厌氧微生物菌群动态的 …

通过对鸡感染柔嫩艾美耳球虫时盲肠中常见正常厌氧微生物的变化情况进行检测研究发现：鸡在感染球虫后第７、１０、１４天时盲肠中类杆菌（Ｂacteriodes）的数量显著减少（Ｐ〈０．０５），而梭状芽孢杆菌（Ｃlostridium）则显著增多；在球虫感染后的第７、１０天时盲肠中的消化球菌（Ｐep-tostueptocuccus）和真杆菌（Ｅubactirium）呈显著下降（Ｐ〈０．０５）。上述结果从一个方面阐明了柔嫩艾美耳球虫感染导致对某些其它感染抵抗     

不同精粗比饲粮条件下奶牛瘤胃细菌菌群结构变化的研究

本研究旨在揭示不同精粗比饲粮条件下奶牛瘤胃细菌菌群结构的变化。选择24头健康、体重相近、胎次相同、产后3周左右的中国荷斯坦奶牛,随机分为2组(每组12头),分别饲喂高精粗比饲粮(60∶40,HC组)和低精粗比饲粮(40∶60,LC组),试验期为45 d。运用16S rDNA高通量测序技术对奶牛瘤胃细菌菌群结构变化进行分析。结果表明:1) HC组奶牛瘤胃液丙酸比例极显著高于LC组(P0.01),乙酸/丙酸极显著低于LC组(P0.01)。2) HC组奶牛瘤胃细菌操作分类单元数量极显著低于LC组(P0.01)。3) LC组的Ace指数、Chao1指数显著高于HC组(P0.05),Shannon指数、Simpson指数极显著高于HC组(P0.01)。4) LC组奶牛瘤胃中拟杆菌门、厚壁菌门、纤维杆菌门、疣微菌门、SR1、软壁菌门、TM7、黏胶球形菌门、迷踪菌门丰度极显著高于HC组(P0.01),HC组奶牛瘤胃中变形菌门、螺旋菌门丰度极显著高于LC组(P0.01)。5) LC组奶牛瘤胃中纤维杆菌属、瘤胃球菌属、琥珀酸菌属、甲烷短杆菌属、BF311丰度极显著高于HC组(P0.01),丁酸弧菌属丰度显著高于HC组(P0.05); HC组奶牛瘤胃中密螺旋菌属、粪球菌属、Shuttleworthia丰度极显著高于LC组(P0.01),vadinCA11丰度显著高于LC组(P0.05)。由此可见,饲粮精粗比显著影响了奶牛瘤胃中细菌总数和多样性。高精粗比饲粮条件下,瘤胃中纤维降解菌的生长受到抑制,促进了瘤胃中产酸菌的增殖,从而改变了瘤胃发酵模式。     

人工感染柔嫩艾美耳球虫对雏鸡盲肠正常菌群的影响

在对雏鸡人工感染柔嫩艾美耳球虫后6、8、13、20天,分别对感染雏与未感染雏盲肠内容物中梭杆菌、真杆菌、消化球菌、乳酸杆菌、类杆菌、肠球菌、葡萄球菌和肠杆菌等8种主要正常菌群进行定性、定量分析。结果发现在球虫感染第20天,感染组有益菌如乳酸杆菌的数量低于对照组,差异极显著(P<0.01),有害菌如梭杆菌、葡萄球菌数量感染组高于对照组,其中梭杆菌差异显著(P<0.05),葡萄球菌差异极显著(P<0.01)。     

鸡球虫病常用药物辨析

正1病原分析鸡球虫属原生动物门,孢子虫纲.球虫目。目前世界上公认的鸡球虫主要有艾美耳属的七种,即柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫。在普通饲养环境下,鸡球虫病多是以两种以上球虫混合感染的情况存     

柔嫩艾美耳球虫感染对鸡盲肠中氧化-还原电位及pH值的影响

本文对鸡感染柔嫩艾美耳球虫时盲肠中氧化－还原电位和ＰＨ值的变化情况进行了研究。鸡在感染球虫后第７、１０、１４ｄ时盲肠中的ＰＨ值呈显著下降,且氧化－还原电位显著地向氧化相移动 。结果表明：柔嫩艾美耳球虫感染所引起的肠炎沙门氏菌感染增强现象可能至少与球虫感染时的氧化还原电位和ｐＨ值的改变相关。     

不同精粗比饲粮条件下奶牛瘤胃细菌菌群结构变化的研究北大核心CSCD

本研究旨在揭示不同精粗比饲粮条件下奶牛瘤胃细菌菌群结构的变化。选择24头健康、体重相近、胎次相同、产后3周左右的中国荷斯坦奶牛,随机分为2组(每组12头),分别饲喂高精粗比饲粮(60∶40,HC组)和低精粗比饲粮(40∶60,LC组),试验期为45 d。运用16S rDNA高通量测序技术对奶牛瘤胃细菌菌群结构变化进行分析。结果表明:1)HC组奶牛瘤胃液丙酸比例极显著高于LC组(P<0.01),乙酸/丙酸极显著低于LC组(P<0.01)。2)HC组奶牛瘤胃细菌操作分类单元数量极显著低于LC组(P<0.01)。3)LC组的Ace指数、Chao1指数显著高于HC组(P<0.05),Shannon指数、Simpson指数极显著高于HC组(P<0.01)。4)LC组奶牛瘤胃中拟杆菌门、厚壁菌门、纤维杆菌门、疣微菌门、SR1、软壁菌门、TM7、黏胶球形菌门、迷踪菌门丰度极显著高于HC组(P<0.01),HC组奶牛瘤胃中变形菌门、螺旋菌门丰度极显著高于LC组(P<0.01)。5)LC组奶牛瘤胃中纤维杆菌属、瘤胃球菌属、琥珀酸菌属、甲烷短杆菌属、BF311丰度极显著高于HC组(P<0.01),丁酸弧菌属丰度显著高于HC组(P<0.05);HC组奶牛瘤胃中密螺旋菌属、粪球菌属、Shuttleworthia丰度极显著高于LC组(P<0.01),vadinCA11丰度显著高于LC组(P<0.05)。由此可见,饲粮精粗比显著影响了奶牛瘤胃中细菌总数和多样性。高精粗比饲粮条件下,瘤胃中纤维降解菌的生长受到抑制,促进了瘤胃中产酸菌的增殖,从而改变了瘤胃发酵模式。     

鸡球虫病的诊断和治疗

鸡球虫病是养禽业常见的一种疾病，是由艾美耳科的8种艾美耳球虫引起的。其中柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫的致病性最为严重。柔嫩艾美耳球虫寄生于盲肠，故称盲肠球虫病；其余7种球虫寄生于小肠，因而称为小肠球虫病。病鸡表现贫血、消瘦和血痢，急性感染可造成大批死亡；中轻度感染主要影响生长发育，并降低对其它疾病的抵抗力。     

鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因的原核表达及动物免疫试验

为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因原核表达重组蛋白的免疫效力,分析其在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中对鸡平均增重、抗球虫指数(ACI)、减少盲肠病变和卵囊数量中的作用,从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总RNA作为模板,用RT-PCR扩增出SO7基因片段,再应用DNA重组技术将SO7基因克隆到原核表达载体pET32a(+)中并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示,pET32a(+)-SO7表达的目的蛋白约为40ku,主要以包涵体形式存在。用纯化的重组蛋白进行动物免疫试验显示,SO7重组蛋白在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中有较好的免疫保护作用,能够显著提高鸡柔嫩艾美耳球虫感染鸡的平均增重和抗球虫指数(ACI),对减少盲肠病变和卵囊数量也有部分作用。     

柔嫩艾美耳球虫感染对蛋鸡生产肠炎沙门氏菌污染蛋和感染肠炎 …

为揭示球虫感染对蛋鸡的肠炎沙门氏菌敏感性及蛋鸡的肠炎沙门锚菌污染率的影响而进行了本研究。结果显示：柔嫩艾美耳球虫感染对蛋鸡生产肠炎沙门氏菌污染及感染肠炎沙门氏菌的敏感性均具有增强作用，具体表现为，柔嫩艾美耳球虫感染可使肠炎沙门氏菌污染蛋壳显著增多；球虫感染鸡所产蛋，无论是新鲜的还是贮存１周后的，其蛋内容物的肠炎沙门氏菌阳性率比仅感染肠炎沙门锚菌鸡所产蛋要高；球虫感染鸡盲肠中的沙门氏菌阳性率和沙门氏     

两种无抗制剂对育肥猪生长性能及肠道健康的影响

本试验通过在生长育肥猪饲粮中添加两种不同的无抗制剂,探究其对育肥猪生长及肠道健康的影响。选取体重为（85.95±3.48） kg的LDY三元杂交猪60头,分为对照组、试验1、2组,每组5个重复,每个重复4头猪（阉公猪和母猪各半）。对照组饲喂基础饲粮,试验1组在基础饲粮中添加0.5%的红曲合生元酵母硒锗复合制剂,试验2组在基础饲粮中添加0.5%的复方中药提取物。结果表明：①3组间生长性能各项指标均差异不显著（P>0.05）。②与对照组相比,试验1组空肠的绒毛高度（VH）、绒毛高度/隐窝深度（V/C）以及回肠的绒毛高度均显著增加（P<0.05）,试验2组空肠和回肠的绒毛高度均显著增加（P<0.05）;试验1组空肠和回肠的绒毛高度显著高于试验2组（P<0.05）。③与对照组相比,试验1和2组盲肠菌群香浓指数均显著升高（P<0.05）、辛普森指数均显著降低（P<0.05）;试验1组的香浓指数显著高于试验2组（P<0.05）。④在门水平上,与对照组相比,试验1组盲肠菌群变形菌门和放线菌门丰度均显著升高（P<0.05）,厚壁菌门丰度显著降低（P<0.05）;试验2组厚壁菌门和变形菌门丰度显著升高（P<0.05）,拟杆菌门丰度显著降低（P<0.05）;试验1组放线菌门丰度显著高于试验2组（P<0.05）,厚壁菌门丰度显著低于试验2组（P<0.05）。在属水平上,与对照组相比,试验1组链球菌属丰度显著升高（P<0.05）,苏黎世杆菌属、uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae和乳杆菌属丰度显著降低（P<0.05）;试验2组瘤胃菌属和链球菌属丰度显著升高（P<0.05）,苏黎世杆菌属、梭菌属_13、乳杆菌属丰度显著降低（P<0.05）;试验1组梭菌属_13和链球菌属丰度显著高于试验2组（P<0.05）,试验1组uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、瘤胃菌属显著低于试验2组（P<0.05）。⑤试验1组Occludin、Zo-1、Claudin-1表达量显著高于对照组（P<0.05）,Occludin、Claudin-1表达量显著高于试验2组（P<0.05）。以上结果表明,红曲合生元酵母硒锗复合制剂和复方中药提取物对育肥猪肠道健康均有改善作用,但红曲合生元酵母硒锗复合制剂组饲喂效果优于复方中药提取物组。     

赤芍黄柏制剂对致病性大肠杆菌人工感染雏鸡的肠道菌群多样性的影响

为了解不同浓度赤芍黄柏制剂对致病性大肠杆菌（Escherichia coli）感染的雏鸡肠道菌群多样性的影响,本研究对240只15日龄健康雏鸡随机编号后分为空白对照组（CON）、感染组（BC）、低剂量治疗组（TL）和高剂量治疗组（TH）4个组,除对照组外,其余各组（BC、TL、TH）均使用致病性大肠杆菌进行感染,感染0.5 d后,分别用不同浓度的赤芍黄柏制剂对TL组（4 mL·L^-1灭菌水）和TH组（12 mL·L^-1灭菌水）进行饮水治疗,治疗5 d后统计各组发病率及死亡率,采用高通量测序技术检测雏鸡十二指肠肠道菌群多样性。结果显示,与感染组相比,TH组显著降低了雏鸡的发病率和死亡率（P<0.05）。菌群分析显示,赤芍黄柏制剂处理改变了雏鸡肠道菌群多样性组成,提高了乳杆菌属的丰度。CON组优势菌群以厚壁菌门、肠球菌属为主;BC组肠道优势菌群主要为厚壁菌门、变形菌门、肠球菌属、大肠杆菌属及葡萄球菌属;TL组优势菌群以厚壁菌门、乳杆菌属、肠球菌属及葡萄球菌属为主;TH组优势菌群以厚壁菌门、乳杆菌属为主。热图分析显示,乳杆菌属与发病率和死亡率呈负相关,大肠杆菌属与发病率和死亡率呈正相关（P<0.05）。综上,大肠杆菌感染及赤芍黄柏制剂治疗改变了雏鸡肠道菌群多样性及组成,而这种肠道菌群的变化可能对雏鸡腹泻发病及抗病力产生重要影响。     

复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿瘤胃发酵及菌群结构的影响

试验旨在研究复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿瘤胃发酵及菌群结构的影响。选取12头梅花鹿，随机分为2组，对照组饲喂基础饲粮，试验组饲喂基础饲粮+10 g/（头·d）复方中草药添加剂，预试期7 d，正式饲喂49 d。结果表明：(1)试验组瘤胃pH显著高于对照组（P<0.05），而丙酸浓度显著低于对照组（P<0.05）。(2)试验组Chao1和Ace指数显著低于对照组（P<0.05）。(3)在门水平上，试验组厚壁菌门和广古菌门的相对丰度显著高于对照组（P<0.05），而未分类细菌和放线菌门的相对丰度显著低于对照组（P<0.05）；在属水平上，试验组克里斯滕森菌科＿R-7菌属、醋酸菌属、瘤胃球菌属和瘤胃球菌科＿NK4A214菌属的相对丰度显著高于对照组（P<0.05）。综上所述，添加10 g/（头·d）的复方中草药添加剂能够提高生茸期梅花鹿瘤胃p H，降低瘤胃菌群丰富度并改变菌群结构。     

吉林市城区鸡球虫病的流行病学调查

通过对吉林城区具有代表性的鸡场进行鸡球虫病的感染情况调查,采集鸡新鲜粪便,用饱和盐水漂浮法收集卵囊,制片镜检,观察卵囊和孢子化卵囊的形状、颜色,测量卵囊的大小,鉴定出艾美耳属球虫3种,即柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫,其中柔嫩艾美耳球虫为优势种,其主要侵害鸡的盲肠,导致贫血、消瘦甚至死亡,发病多为15～40日龄的雏鸡,为有效预防鸡球虫病提供参考.