利用双亲灭活原生质体融合技术选育高效苏云金芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌融合菌株

苏云金芽胞杆菌B7发酵液在药后96 h对小菜蛾2龄幼虫致死率高达85.06%;枯草芽胞杆菌TL2对黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病有显著拮抗活性(对峙培养5 d对病原菌的平均抑制率在60%以上)。本文对菌株B7和TL2的原生质体形成、完全灭活及融合的最佳条件分别进行了筛选,研究结果表明菌株B7在溶菌酶1.0 mg/m L、酶解70 min的条件下,原生质体形成率和再生率最佳,分别为85.0%和29.41%;菌株TL2在溶菌酶1.25 mg/m L、酶解50 min的条件下,原生质体形成率和再生率最佳,分别为80.00%和25.00%。菌株TL2原生质体完全灭活的最佳条件为60℃水浴35 min,菌株B7原生质体完全灭活的最佳条件为紫外照射25 min。灭活后的两亲本融合最佳条件为30℃水浴融合20 min后涂布再生培养基,用影印法连续传代10次以上,最后筛选出17株稳定的融合子,经过杀虫防病检测最后筛选到一株兼具两亲本特性的高效融合子TLB15。TLB15发酵液在药后96 h对小菜蛾2龄幼虫校正死亡率为93.44%,TLB15发酵液对黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病(对峙培养5 d)的平均抑制率分别为60.00%和62.79%。     

十字花科根肿病生防菌副地衣芽胞杆菌ZF480的鉴定及其防效

为有效防控十字花科蔬菜生产中的毁灭性病害——根肿病,以尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum和辣椒疫霉Phytophthora capsici为指示菌,利用平板对峙法对分离自土壤的1 198株细菌进行筛选,进通过盆栽试验筛选对十字花科根肿病具有良好防效的生防菌株,并基于形态学特征、生理生化特性及16S rDNA、gyrB和atpD多基因系统发育分析对生防菌株进行鉴定,同时测定其抑菌谱和田间防效。结果表明,通过对峙培养筛选获得115株有抑菌效果的生防菌株,采用盆栽试验获得1株对根肿病菌具有拮抗效果的菌株,命名为ZF480。结合形态学特征和系统发育分析结果将该菌株鉴定为副地衣芽胞杆菌Bacillus paralicheniformis。菌株ZF480对野油菜黄单胞野油菜变种Xanthomonas campestris pv. campestris等10种病原菌具有拮抗效果,抑菌谱较宽,对白菜根肿病的盆栽防效和田间防效分别达到72.82%和64.08%。表明副地衣芽胞杆菌菌株ZF480对十字花科根肿病具有显著的防效,可作为生防菌进一步开发利用。     

苏云金芽胞杆菌分离过程中无晶体芽胞杆菌的分析

本研究选择了在苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)分离过程中发现的与Bt芽胞相似、没有伴胞晶体的8株芽胞杆菌,对其种属、质粒等生物学特性和杀虫活性进行了初步研究.对分离菌株所产芽胞进行形态观察及质粒图谱分析,发现其与Bt相似;但肽指纹图谱分析和16S rDNA聚类研究表明所分离菌株与蜡样芽胞杆菌B.cereus(Bc)匹配最高;杀虫活性测定表明这8株菌对猿叶甲Colaphellus bowringi幼虫均无毒杀作用,而15-3、W23-1和W25-3 3个菌株及其培养上清液对小菜蛾Plutella xylostella幼虫有一定的杀虫活性,说明它们能产生活性物质.这些结果说明在Bt菌株的分离过程中要对无晶体菌株加以重视,其含有的活性物质具有潜在的研究和利用价值.     

提高解淀粉芽胞杆菌PHODG36芽胞耐热性的技术研究

芽胞耐热性直接影响芽胞杆菌类生防细菌干粉原药的生产效率和成本。为开发提高解淀粉芽胞杆菌PHODG36的芽胞耐热性技术,以该菌株为出发菌株,通过热处理诱变和变温诱变,获得芽胞耐热性提高的诱变菌株BBW-11。与野生型菌株PHODG36相比,诱变菌株BBW-11的芽胞存活率提高55.0%,且在菌落形态、生物膜形成、生长动态和抑菌作用等方面无显著性差异。通过正交试验确定了诱变菌株BBW-11适宜的保护剂和处理条件,并建立耐热性菌株BBW-11 + 0.5%蔗糖 + 55 ℃处理0.5 h的提高PHODG36菌株芽胞耐热性的技术,芽胞存活率比未处理的诱变菌株BBW-11提高了2.3倍,比野生型菌株PHODG36提高了2.8倍。综上,本研究建立了提高PHODG36菌株芽胞耐热性的技术,可为该菌株干粉原药的喷雾干燥工艺优化提供技术支撑。     

苏云金芽胞杆菌晶体毒素的多样性

苏云金芽胞杆菌是生物防治中应用最为广泛的一种杀虫剂,它对多种昆虫和其他一些无脊椎动物具有特异的毒杀活性。苏云金芽胞杆菌的杀虫活性主要来自于菌体在形成芽胞期间生成的伴胞晶体毒素,这些晶体毒素在结构和生物学功能方面表现高度的多样性。本文介绍了苏云金芽胞杆菌晶体毒素的分类、命名方法,深入讨论了晶体毒素的氨基酸序列、三维结构、靶标生物和杀虫机理的多样性。评价了各种分类方法的特点,并展望了晶体毒素作用机制研究和未来晶体毒素新基因的发掘。     

苏云金芽胞杆菌安全性的研究进展

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是目前应用最为广泛的一类微生物农药。本文分析比较了我国及美国Bt产品登记和安全评价等情况,并对Bt制剂的风险评价进行了分析。Bt菌株不是人或其他哺乳动物的已知病原体,对哺乳动物无毒性、感染性和致病性;其种群数量在环境中呈逐渐减少趋势,无残留风险;对非靶标昆虫的生存和繁殖及土壤微生物群落结构无显著影响。     

生防芽胞杆菌脂肽抗生素研究进展

本文对生防芽胞杆菌脂肽抗生素的类群、特性,脂肽抗生素合成相关基因的基因工程研究以及脂肽抗生素的分离纯化、鉴定进行了概述。最后对该类抗生素的研究前景进行了展望。     

PhoR/PhoP双组分系统对枯草芽胞杆菌NCD-2菌落形态和芽胞形成的影响

 双组分PhoR/PhoP是枯草芽胞杆菌中普遍存在的以低磷为信号的调控系统。前期研究发现,PhoR/PhoP双组分系统正调控枯草芽胞杆菌NCD-2菌株脂肽类抗生素fengycin的合成,本研究分析了PhoR/PhoP双组分系统对NCD-2菌株菌落形态和芽胞形成的影响。在有机磷培养基上,NCD-2野生型菌株可以降解有机磷并且形成表面褶皱、立体结构较强的菌落形态,而phoR或phoP基因突变子丧失了降解有机磷的能力,菌落表面光滑、平坦。phoR和phoP基因突变子的互补菌株恢复到了与野生型相似的解磷能力和菌落形态。在低磷和高磷培养基中比较了NCD-2野生型及其衍生菌株的生长及芽胞形成情况,结果表明,在高磷培养基中,NCD-2野生型及其衍生菌株的生长速率没有差异,但在低磷培养基中,phoR和phoP基因突变子的菌体生长速率显著降低。芽胞形成能力测定结果表明,在低磷培养基中,NCD-2野生型菌株的芽胞形成率较高,而phoR和phoP基因突变子的芽胞形成率显著降低;在高磷培养基中,NCD-2野生型及其衍生菌株芽胞形成率普遍较低并且无显著差异。RT-PCR分析显示, phoR和phoP的突变均显著降低了芽胞形成相关基因spo II GA的表达,相比感应激酶PhoR,调控因子PhoP对spo II GA基因的影响更显著。     

单细胞分析研究二氧化氯对杀蚊细菌球形赖氨酸芽胞杆菌芽胞的影响

球形赖氨酸芽胞杆菌Lysinibacillus sphaericus（Ls）是应用广泛的蚊虫生物防治制剂,在实际应用时可能会遇到不利的环境因子或杀菌剂。本研究通过单细胞分析方法监测ClO₂处理后的单个Ls芽胞及其萌发过程,探究ClO₂对Ls芽胞结构和成分的影响及与芽胞萌发相关蛋白的影响,以及ClO₂的杀胞机制。经0.05%～0.3% ClO₂处理5 min后,36%～86%的芽胞不能形成单菌落。吡啶二羧酸钙（CaDPA）特征峰（1017 cm^-1）强度随处理程度增大有所降低,而蛋白质α-螺旋峰（1652 cm^-1）强度没有明显变化。ClO₂处理显著改变Ls芽胞的萌发动态,芽胞启动CaDPA快速释放的时间、完全释放的时间以及皮层水解完成的时间显著延长;而外源CaDPA仅能触发低浓度ClO₂（0.05%）处理的芽胞,且显著迟缓。表明ClO₂处理没有直接破坏芽胞内膜但严重损伤了与萌发相关蛋白的功能,特别是皮层水解酶容易失活。这可能就是被处理的芽胞可以启动芽胞萌发的最初步骤,而不能进一步发展为营养细胞的原因。     

短短芽胞杆菌B011基因组中芽胞形成调控基因spo0E的鉴定与表达分析

短短芽胞杆菌B011是一株具有广谱抗菌活性的植物内生菌,发酵后期形成芽胞。据报道,芽胞形成调控基因Spo0E的编码产物能对Spo0A～P蛋白因子去磷酸化,从而实现芽胞形成的负调控。为了能够进一步验证B011基因组中Spo0E基因的功能和表达情况,为B011菌株的遗传改造提供候选基因,本研究基于B011全基因组序列,通过生物信息学工具预测得到了9个spo0E类似基因,并与其他已公布全基因组序列的101个短芽胞杆菌Brevibacillus菌株进行比较,结果表明短短芽胞杆菌spo0E家族基因在物种分化前就已经存在。转录组测序结果表明,FO446＿19435和FO446＿04050两个spo0E家族基因在B011中高表达,表达模式表现为先升高,在发酵18 h达到最高,此后下降,这两个基因均存在SQELD基序,推测这两个基因为B011中的两个主效spo0E基因。研究结果可为短短芽胞杆菌B011的进一步开发和利用提供一定的基础。     

枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的高效电击转化

本研究对影响枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisNCD-2菌株遗传转化的因素进行摸索并对其转化条件进行优化,建立了该菌株的高效电击转化体系。通过比较5个不同大小和携带不同来源复制子的质粒对其转化效率的影响,发现质粒大小与NCD-2菌株的电击转化效率之间没有相关性;而携带来源于Bacillus coagu-lans复制子的质粒pNW33N时,NCD-2菌株的电击转化效率最高,达到3.53×104cfu.μg-1DNA,说明复制子来源是影响转化效率的一个重要因素。采用pNW33N质粒在不同电阻、电场强度及培养时间下的电击转化效率的研究结果表明,该菌株转接到生长培养基后,37℃、150r.min-1培养3.5h,在电阻值200Ω、电场强度14.0kV.cm-1的条件下转化效率最高,达到6.07×104cfu.μg-1DNA。优化后的转化体系为顺利开展枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的分子操作奠定了基础。     

地衣芽孢杆菌WIO发酵产生抗茵蛋白的研究

地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisW10是1株生防细菌,其能产生抗菌蛋白,对多种植物病原菌有较好的抑制效果。本试验研究了菌株W10产生抗菌蛋白的发酵条件,为工厂化生产工艺提供技术支持。试验结果表明,接种菌龄12h,2％接种量,发酵液pH7．0,发酵培养60h是菌株W10产生抗菌蛋白的适宜发酵条件。控制发酵温度有利于抗菌蛋白积累,第一段温度为30℃培养20h,第二段温度为28℃至发酵结束。最佳溶氧量为20％。2次补料发酵效果要高于分批发酵,补料为500mL含10g．L-1葡萄糖和5g·L-1蛋白胨的培养基;选用200mg·L-1聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚（GPE消泡剂,泡敌）为消泡剂。利用优化的控制条件发酵培养菌株W10,与优化前相比,对目标病菌的抑菌率增加了34．6％。     

地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白的分离纯化及其理化性质研究

 地衣芽孢杆菌W10是一株对多种植物病原菌有拮抗作用的生防细菌,其产生的抗菌物质主要是抗菌蛋白。细菌培养滤液用30%硫酸铵盐析,透析后再经SephadexG-75层析柱纯化得到一种具有抑菌活性的蛋白。该抗菌蛋白的分子量为46049.2Da;等电点为6.71;含有糖基,含糖量为6.83%;含有脯氨酸或羟脯氨酸;不含脂基。这种蛋白在pH6~12范围内均具有抑菌作用,pH6时活性最大;对热稳定,100℃以下水浴20min,抑菌活性与对照相比均在对照的80%以上,121℃蒸汽处理20min,活性虽有所下降,但仍达对照的65.7%;对胰蛋白酶和蛋白酶K不敏感,酶处理后蛋白的抑菌活性分别为对照的98.7%和98.3%;对氯仿和紫外线也不敏感,处理后活性仍达对照的91.0%和98.6%。     

黄瓜褐斑病菌拮抗细菌的筛选及鉴定

从全国14个地区多种作物田采集土样56份,经室内分离、纯化及筛选,获得了对黄瓜褐斑病菌Corynespora cassiicola具有拮抗作用的16株细菌,其中拮抗作用最强的为菌株SDYT-79,其对黄瓜褐斑病菌的抑菌带宽度达37mm。室内盆栽试验结果显示,菌株SDYT-79对黄瓜褐斑病的防效达58.4%。孢子萌发试验表明,该菌株对黄瓜褐斑病菌孢子萌发有较强的抑制作用,其发酵无菌滤液及10倍稀释液对孢子萌发的抑制率均达100%。黄瓜褐斑病菌孢子在100倍、1000倍稀释无菌滤液中虽能萌发,但芽管形态异常。抑菌谱试验表明,该菌株对供试的11种植物病原真菌均有较好的抑菌作用,抑菌带在19.9～41.9mm之间。生理生化鉴定及16S rDNA序列测定结果表明该菌株为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。     

拮抗细菌对番茄植株抗灰霉病的诱导

通过拮抗细菌多粘类芽孢杆菌W3、Y2和地衣芽孢杆菌W1 0诱导接种和灰霉病菌挑战接种试验 ,明确了 3菌株培养液和去菌液对番茄植株抗灰霉病的诱导作用。 3株拮抗细菌的诱导抗病效果为 2 3 .4%～ 64.5% ,其中W3诱导作用最强。W 3培养液及其去菌液处理后 5d ,诱导效果达最大值 ,且 1 2d后仍有诱抗作用。在 1 0 2 ～ 1 0 1 0 cfu/ml范围内 ,拮抗细菌的诱导活性随浓度增加而增强 ,以≥ 1 0 8cfu/ml的效果最好。拮抗细菌处理叶上部各叶片间诱抗效果无明显差异。     

灰葡萄孢拮抗细菌在番茄植物体表的定殖

通过耐利福平标记菌株回收,研究了灰葡萄孢拮抗细菌(地衣芽孢杆菌W10和多粘类芽孢杆菌W3、Y2—11—1)在番茄叶片和果实上的定殖能力及其影响因素。试验表明,拮抗细菌在较高浓度(10^7--10^9cfu/ml)下,定殖时间可达10—15d。接种灰霉病菌对拮抗细菌的定殖有一定影响,特别是在接种灰霉病菌1d后接种拮抗细菌和同时接种灰霉病菌与拮抗细菌的情况下,拮抗细菌的定殖能力显著下降,提示该类拮抗细菌的防病效果要好于治病效果。此外,温度较高(25—35℃)、湿度较大(RH95％一--100％)、12h光暗交替对拮抗细菌的定殖有利。     

枯草杆菌B034拮抗物质及其内源质粒的研究

 枯草杆菌(Bacillus subtilis) B034是从水稻叶面分离的植物病原细菌拮抗菌,对水稻白叶枯病菌,水稻细条病菌有较强的抑制作用。(NH₄)₂SO₄饱和沉淀粗提液经Sephadex G-100柱层析所得的3个洗脱吸收峰中有两峰具较强的抑菌活性。此拮抗物抗热,对胰蛋白酶敏感,对蛋白酶K、E部分敏感。B034菌株内含有一稳定的大小约8kb的内源质粒。质粒消除后,其拮抗活性也随之消失。用穿梭质粒pMK4的XL1-Blue中对其EcoR Ⅰ酶切4片段分别进行了克隆,并转化到无拮抗活性的Bacillus DB104中,片段Ⅱ+Ⅲ显示了部分的拮抗活性。     

GFP标记的多粘芽孢杆菌1114在番茄根际的定殖

多粘芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa菌株1114对多种植物病原菌具有良好的防治效果。为研究其在作物根际土壤中的迁移和定殖规律,通过电击转化引入绿色荧光标记质粒pB-SVG101,得到稳定表达的荧光标记菌株,转化后的菌株对青枯菌Ralstonia solanacearum仍保持良好的抑制效果。通过多种接种方法,发现该菌株能通过浸根的方式侵入番茄的维管组织和周围细胞。