西瓜噬酸菌ftsH基因功能分析

 AAA ATPase (ATPase associated with diverse cellular activities) 在西瓜噬酸菌的多种生命过程中发挥重要作用。AAA家族中的FtsH蛋白(filamentation temperature-sensitive H)是由ftsH基因编码的,参与生长、致病、环境应激反应、膜内在蛋白质量控制等过程的蛋白,但其在西瓜噬酸菌中的作用尚未明确。本实验以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,通过构建基因缺失突变体,测定致病力等各项表型以及突变株中致病相关基因和其他AAA ATPase基因的表达量,初步探索西瓜噬酸菌中ftsH的功能,为FtsH蛋白的功能研究奠定基础。结果表明,ftsH缺失显著降低菌株致病力、运动能力、生物膜形成能力、生长能力和环境胁迫耐受能力,不影响烟草过敏性反应,显著影响西瓜噬酸菌致病相关基因、AAA ATPase基因以及热激转录因子σ³²的表达量。这表明ftsH基因的功能与西瓜噬酸菌的致病性和环境耐受性密切相关。     

西瓜噬酸菌ftsH基因功能分析

 AAA ATPase (ATPase associated with diverse cellular activities) 在西瓜噬酸菌的多种生命过程中发挥重要作用。AAA家族中的FtsH蛋白(filamentation temperature-sensitive H)是由ftsH基因编码的,参与生长、致病、环境应激反应、膜内在蛋白质量控制等过程的蛋白,但其在西瓜噬酸菌中的作用尚未明确。本实验以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,通过构建基因缺失突变体,测定致病力等各项表型以及突变株中致病相关基因和其他AAA ATPase基因的表达量,初步探索西瓜噬酸菌中ftsH的功能,为FtsH蛋白的功能研究奠定基础。结果表明,ftsH缺失显著降低菌株致病力、运动能力、生物膜形成能力、生长能力和环境胁迫耐受能力,不影响烟草过敏性反应,显著影响西瓜噬酸菌致病相关基因、AAA ATPase基因以及热激转录因子σ³²的表达量。这表明ftsH基因的功能与西瓜噬酸菌的致病性和环境耐受性密切相关。     

西瓜噬酸菌Ⅲ型分泌系统hrcQ基因功能分析

Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)是影响西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli致病性的重要因素,hrcQ作为T3SS的保守基因,在组成和维持该系统功能方面扮演着重要角色,但hrcQ在西瓜噬酸菌中的具体生物学功能尚不明确。本试验以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,通过基因敲除、致病力及相关表型测定等,解析了hrcQ基因的功能。结果表明:hrcQ缺失导致Aac5菌株对寄主的致病能力丧失,运动性及生物膜形成能力降低,并丧失了引起烟草过敏性反应能力;hrcJ和hrcR基因在hrcQ缺失突变株中的表达量下调,hrcQ对hrcJ和hrcR基因均为正调控。表明hrcQ在维持西瓜噬酸菌致病能力中起着不可或缺的作用。     

西瓜噬酸菌中C-di-GMP代谢相关基因Aave_2620的功能研究

 环鸟苷二磷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)是一种广泛存在于植物病原细菌中的第二信使,调控细菌多种生物学功能,从而影响病原细菌的致病性,但其在西瓜噬酸菌中的研究还未见报道。本实验以Aac5菌株为研究对象,通过构建c-di-GMP代谢相关基因Aave_2620缺失突变株和互补菌株,从其致病能力及其生长能力两部分进行测定,探究此信号途径是否在西瓜噬酸菌中调控致病机制。结果表明,基因Aave_2620的缺失显著降低Aac5菌株致病力、生物膜形成能力和生长能力,减弱烟草过敏性反应以及运动能力,互补菌株表型基本得到恢复。基因Aave_2620的缺失显著影响三型分泌系统相关基因、毒性相关基因以及鞭毛及趋化性相关基因在西瓜噬酸菌中的表达量。以上结果表明c-di-GMP代谢相关基因Aave_2620与西瓜噬酸菌的致病密切相关。     

西瓜噬酸菌Ⅲ型分泌系统hrcS基因功能分析

为明确编码Ⅲ型分泌系统（typeⅢsecretion system,T3SS）中重要核心蛋白的hrcS基因对西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli致病力的影响,以西瓜噬酸菌野生型菌株Aac5为对象,通过基因敲除构建hrcS基因缺失突变菌株ΔhrcS及其互补菌株ΔhrcS-comp,测定其致病力及致病相关基因表达量、烟草过敏性反应能力、运动能力及运动能力相关基因表达量、生物膜形成能力和离体生长能力。结果显示,与野生型菌株Aac5相比,hrcS基因缺失突变菌株丧失了对寄主的致病能力和引起非寄主烟草过敏性反应能力,运动能力显著增强了191.75%,生物膜形成能力显著下降了43.90%,离体生长能力在达到对数期后呈下降趋势。hrcS基因缺失使西瓜噬酸菌T3SS中hrpG、hrpX和hrpE基因以及鞭毛fliC基因表达量显著上调,分别为野生型菌株的2.27倍、2.38倍、1.26倍和1.77倍,hrcQ基因表达量显著下调,仅为野生型菌株的50.75%。表明hrcS基因在维持西瓜噬酸菌致病能力中发挥着重要作用。     

西瓜噬酸菌hflX基因功能分析

为明确GTP结合蛋白基因hflX在西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli中的功能尤其是对该菌致病力的影响,以西瓜噬酸菌Aac5菌株为材料获得hflX基因的缺失突变菌株及互补菌株,通过对致病力等表型以及相关基因表达量的测定初步探究西瓜噬酸菌hflX基因的功能。结果显示,同野生型菌株Aac5相比,缺失突变菌株的致病力显著下降,III型分泌系统基因hrpG和hrpE的表达量显著下调,仅为野生型菌株表达量的54.99%和27.39%;hflX基因的缺失并未影响其引起烟草过敏性坏死反应的能力;但缺失突变菌株的运动能力显著下降,鞭毛基因fliR和fliC的表达量显著下调,仅分别为野生型菌株的37.04%和29.68%。此外,缺失突变菌株的生物膜形成能力相较于野生型菌株显著增强了26.32%,同时,其体外生长能力也有所增强。表明hflX基因可能通过调控III型分泌系统基因hrpG和hrpE、鞭毛基因fliR和fliC的表达以及运动能力来影响西瓜噬酸菌Aac5菌株的致病力。     

瓜类细菌性果斑病菌hrcN基因的生物学功能分析

以分离自西瓜上的Aac5菌株为例,通过同源重组的方法,构建了hrc N基因插入缺失突变体,通过PCR方法和Southern blot验证突变菌株,对突变体进行致病性、致敏性、生长曲线和运动性测定。为明确hrc N基因与其他基因的关系,通过实时荧光定量PCR法定量检测了hrp A、hrc V、hrc U、Lux I、LuxR 5个基因的表达量。结果显示:与野生型相比,突变体致病力和致敏性明显减弱,致病时间延迟,群体感应信号减弱,生长能力明显下降,运动性减弱,互补菌株只能恢复部分功能;5个基因在突变体中的表达量均上调,hrc N基因与这5个基因之间均为负调控关系。说明hrc N基因在果斑病菌致病能力上发挥重要作用。     

西瓜噬酸菌MarR家族转录因子Aave_3922的功能研究

 MarR(Multiple antibiotic resistance regulator)家族转录因子是一种广泛存在于细菌及古细菌中的转录抑制子。MarR可通过调控毒力因子的表达来影响病原细菌的致病性,其调控机制独特,在不同菌中存在不同的调控网络。为明确其在西瓜噬酸菌中的功能及信号通路,以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,构建MarR转录因子Aave_3922的缺失突变株及互补菌株,通过对表型及转录水平的测定,初步探究西瓜噬酸菌中MarR转录因子的功能及可能的调控网络。结果显示,与野生型Aac5菌株相比,突变菌株致病能力、生物膜形成能力、体内生长能力均显著下降,互补菌株有所恢复。同时,基因Aave_3922的缺失会显著影响三型分泌系统关键基因hrpX及hrcJ、毒性相关基因trbC、鞭毛及趋化性相关基因fliC及cheA、生物膜相关基因Aave_2620在西瓜噬酸菌中的表达量;与WT-hrpXpGUS相比,ΔAave_3922-hrpXpGUS的启动子活性显著减弱。以上结果表明Aave_3922基因可能通过参与hrpX的转录调控,以及调控生物膜形成来影响西瓜噬酸菌的致病能力。     

西瓜噬酸菌铜代谢相关基因copZ功能分析

 瓜类细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch,BFB)病原菌为西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac),主要为害西瓜、甜瓜等葫芦科作物,是瓜类生产上主要细菌性病害。目前生产上对该病害的防治手段主要以化学防治为主,其中铜制剂的防治效果较为显著。本研究以西瓜噬酸菌野生型菌株Aac-5中铜代谢相关基因copZ为对象,探究copZ基因缺失对西瓜噬酸菌抗铜性、生长能力等表型的影响;采用RT-qPCR技术测定在不添加和添加外源铜离子条件下,基因copZ缺失后对其他铜代谢相关基因表达量的影响。成功构建了西瓜噬酸菌copZ基因缺失突变菌株ΔcopZ和互补菌株ΔcopZ-comp。结果表明,野生型菌株Aac-5与ΔcopZ-comp菌株在添加1.25 mmol·L^-1 CuSO₄的生长能力与不添加CuSO₄相似,而ΔcopZ菌株的生长能力减弱;当添加CuSO₄至2.50 mmol·L^-1时,野生型菌株Aac-5、ΔcopZ菌株和ΔcopZ-comp菌株的生长能力均减弱。基因copZ缺失在不含铜和含铜条件下均能使西瓜噬酸菌生物膜形成能力减弱;在不含铜条件下基因copZ不影响西瓜噬酸菌的运动能力,在含有1.25 mmol·L^-1 CuSO₄的运动性培养基中各菌株运动能力丧失。ΔcopZ菌株在西瓜子叶内的生长能力相较于野生型菌株Aac-5显著增强,但在西瓜幼苗上的致病力差异不显著,仍具有引起烟草过敏性反应的能力。在不同铜浓度处理后,铜代谢相关基因cueR、copA表达量在野生型菌株中的变化趋势与ΔcopZ菌株存在差异;基因cusA、hylD在野生型菌株中表达量变化趋势与ΔcopZ菌株一致。这表明基因copZ在西瓜噬酸菌铜代谢过程中具有重要作用。     

植物青枯菌Po82菌株Ⅵ型分泌系统中hcp基因的克隆及其功能研究

Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS)是新近报道的细菌蛋白分泌系统。基于植物青枯菌致病力分化菌株Po82的全基因组测序结果,发现其大质粒中存在T6SS的同源基因簇。本文通过基因敲除的方法构建了Po82菌株Ⅵ型分泌系统中的核心基因—hcp基因的缺失突变株,并比对了Po82野生型菌株、突变株及互补菌株在致病性、生长速率、运动性、生物膜形成等方面的变化。结果表明,hcp基因突变株较野生型菌株致病力显著减弱,病程延长;在生长速率、运动性及生物膜形成方面,突变株较野生型无明显差异。说明植物青枯菌Po82菌株T6SS中的hcp基因参与了细菌的致病过程。     

西瓜嗜酸菌LuxR家族基因luxR_(4229)的功能研究

瓜类细菌性果斑病是葫芦科作物上的一种严重的世界性病害,其病原菌为西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)。本研究以野生型菌株Ac-5为研究对象,通过同源重组双交换的方法,构建了LuxR家族功能基因luxR_(4229)的全基因缺失突变株,并对突变株进行致病性、生物膜形成能力和运动能力等生物学特性测定。同时,qRT-PCR定量检测了鞭毛基因fliR和fliC以及III型分泌系统功能基因hrpE和hrcN的表达水平。结果显示:与野生型相比,突变株致病力明显降低,运动能力减弱,而生物膜形成能力增强。fliR、fliC、hrpE和hrcN基因在突变株中的表达量下调,luxR4229对fliR、fliC、hrpE和hrcN基因均为正调控。基因luxR_(4229)在对西瓜嗜酸菌致病力、运动能力及生物膜的形成具有重要调控作用。     

LuxR家族调控因子 LuxR-2460 对西瓜嗜酸菌致病力及生物膜形成的调控

 LuxR家族的调控因子在革兰氏阴性细菌中起重要作用。对西瓜嗜酸菌一个LuxR家族的调控因子 LuxR-2460的调控作用进行研究。生物信息学分析表明该调控因子有2个保守结构域:N-末端为REC 结构域,C-末端为HTH 结构域。通过同源重组双交换的方法,构建了luxR-2460全基因缺失的突变株,该基因缺失突变株能够引起菌株致病力、运动能力及蹭行运动能力的下降及生物膜形成能力的增强。qRT-PCR 检测结果表明,该基因缺失导致鞭毛基因fliR在突变株中的表达量下调,影响病菌鞭毛的形成。说明luxR-2460基因对西瓜嗜酸菌的致病能力及相关因子具有重要调控作用,可以作为该病害防控的潜在靶标。     

西瓜噬酸菌铁吸收调控因子furA的功能研究

 铁吸收调控因子(Ferric uptake regulator,Fur)是细菌中主要调控铁代谢的重要调控蛋白,也影响氧化应激和致病性。生物信息学分析显示,西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)中存在2个Fur蛋白,其生物学功能未知。本文以其中之一的furA为研究对象,通过同源重组原理,构建了野生型菌株Aac5的furA缺失菌株ΔfurA和互补菌株ΔfurAcomp,并进行了致病力和其他相关生物学表型的测定。结果显示,furA缺失后,显著降低了Ac对西瓜、甜瓜的致病力、运动能力、产铁载体能力,提高了生物膜形成能力、以及对Fe³⁺、过氧化氢和链黑菌素的敏感性;基因表达量分析结果显示,furA影响与铁代谢、应激反应和致病性相关基因的表达。综上所述FurA在Ac致病过程、铁代谢和其他表型中起着重要的调控作用。     

欧美杨细菌性溃疡病菌双组分系统lqp0812-lqp0813基因功能研究

  Lonsdalea quercina subsp. populi引起的欧美杨溃疡病是严重威胁欧美杨人工林生产的细菌性病害。双组分系统是细菌最重要的信号转导通路之一,在细菌的生长繁殖、环境适应、胁迫耐受性以及致病过程中发挥重要作用。为探索L. quercina 中双组分系统编码基因的功能,本研究利用同源重组对双组分系统编码基因lqp0812和lqp0813进行缺失突变,并研究其生物学功能。表型分析显示,与野生型菌株N-5-1相比,Δlqp0812和Δlqp0813突变体在生长速率、金属离子胁迫、盐胁迫、渗透胁迫及致病性方面没有显著差异;但Δlqp0812突变体在游动性上与野生型N-5-1相比显著减弱;Δlqp0812和Δlqp0813突变体生物被膜的形成能力,对过氧化氢、抗生素的耐受性都显著增强。qRT-PCR结果显示,在Δlqp0812和Δlqp0813突变体中,外排泵基因acrA、mdtB、aaeB的表达量与野生型相比显著升高。研究结果表明,lqp0812参与病原菌的游动性,lqp0812与lqp0813共同负调控菌株生物膜的形成和对氧化胁迫、抗生素胁迫的耐受性。     

西甜瓜果斑病菌avrRxo1同源基因激发玉米Rxo1抗性产生的研究

生物信息学分析发现西(甜)瓜果斑病菌(Acidovorax citrulli,Ac)基因组中存在水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)avrRxo1的同源基因avrRxo1_(Ac)。为了揭示avrRxo1_(Ac)是否能够激发玉米R基因Rxo1介导的过敏反应(Hypersensitive response,HR),本研究克隆了avrRxo1_(Ac)基因;氨基酸同源性分析结果显示:AvrRxo1_(Ac)与AvrRxo1的同源性为53.16%。将avrRxo1_(Ac)置于Xoc的avrRxo1突变体中,发现其不能恢复该突变体在含有Rxo1玉米上激发HR反应的能力;借助农杆菌瞬时表达体系发现AvrRxo1A,也不能在Rxo1玉米上激发HR反应。这些结果表明avrRxo1_(Ac)-Rxo1互作不表现为基因-对-基因关系,暗示Rxo1抗病基因转入西甜瓜中,将不能起到抗西(甜)瓜细菌性果斑病的作用。