刀鲚PPARγ基因的cDNA克隆及其应激应答

旨在研究刀鲚(Coilia nasus)过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor, PPARγ)基因的应激调控表达,克隆并获得了刀鲚PPARγ基因的cDNA全长。刀鲚PPARγ基因的cDNA全长1951 bp,开放阅读框1470 bp,预测编码489个氨基酸。刀鲚PPARγ包括4个功能结构域,即A/B区, DNA结合区(DNA binding domain, DBD区),铰链区,配体结合区(ligand binding domain, LBD区)。运用荧光定量PCR (real time quantitative PCR, RT-qPCR)检测刀鲚PPARγ基因在不同组织、运输胁迫和胚胎发育时期的表达。结果显示,刀鲚PPARγ在各组织中均有表达,其中在肝中表达量最高,在脑、肠、心脏、肾、头肾、肌肉中相对高表达,在鳃和脾中微量表达。运输胁迫过程中, PPARγ基因表达显著上调(P0.05),在4 h达到峰值,随后显著降低,但仍高于对照组。PPARγ在胚胎发育时期各时期均表达,其中在受精卵时期高表达,随后表达量急剧降低,并在此后的时期一直处于较低的表达水平。PPARγ基因在应激过程中发挥重要作用,也是胚胎发育过程中重要的基因。本研究为刀鲚的人工繁育和应激调控提供了理论基础。     

牙鲆趋化因子基因CXCL9的克隆、鉴定与表达分析

趋化因子是一类具有化学趋化功能的小分子分泌性蛋白,能够引导白细胞到损伤或者感染的部位,参与免疫调节和病理反应。为丰富鲆鲽鱼类趋化因子的相关基础研究,本研究克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)趋化因子基因CXCL9,其全长为910 bp,开放阅读框为408 bp,编码135个氨基酸。该基因具有趋化因子超家族的典型特征,在35、37、60和77个氨基酸位置具有4个保守的半胱氨酸残基,形成两个二硫键。氨基酸序列分析表明,该基因与大菱鲆(Scophthalmus maximus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的CXCL9基因具有较高的同源性,分别为78.5%和71.0%。实时荧光定量PCR结果显示, CXCL9在正常牙鲆肝脏和脾脏中的表达量非常高,在皮肤和鳃等组织中表达量次之,说明CXCL9特异性地在免疫相关组织中表达。经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA表达量在感染后6 h即出现高峰值,而头肾和脾脏中的高峰值出现较晚。经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后6 h,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA的表达量升高近8倍,头肾中的表达高峰值出现在感染后24 h,而脾脏中CXCL9 mRNA的表达量在感染后6 h迅速升高10倍,逐渐降低后48 h又出现高峰,为正常水平的20倍。上述研究结果说明CXCL9基因在病原菌感染过程中有快速响应,可能参与了免疫防御过程,将有可能发展为一种牙鲆细菌性疾病的生物标记。本研究为牙鲆趋化因子超家族免疫机制的深入研究奠定了基础。     

三疣梭子蟹甲基转移酶2基因克隆及在胚胎、幼体和性腺发育过程中的表达分析

本研究采用SMART RACE方法克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Dnmt2(Pt Dnmt2)基因。该基因c DNA全长为1291 bp,开放阅读框为1203 bp,编码400个氨基酸。结构域分析显示,PtDnmt2基因有典型的C5-DNA甲基化酶结构域。同源分析表明,PtDnmt2氨基酸序列与其他物种有较高的同源性。系统进化分析显示,三疣梭子蟹PtDnmt2氨基酸序列与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)Dnmt2关系最近。qRT-PCR结果显示,PtDnmt2基因在三疣梭子蟹所有组织中均有表达,在卵巢中表达量显著高于其他组织(P0.05)。PtDnmt2基因在胚胎和幼体发育过程中的表达量随发育时期而变化,其在受精卵和多细胞时期无表达,从囊胚期开始出现,随着胚胎的发育表达量逐渐上升。在性腺发育不同时期PtDnmt2基因表达量存在显著差异,其在卵巢II期表达量最高,之后逐渐下降;在精巢中该基因的表达量随着精巢的发育逐渐上升,在IV期达到峰值。本研究结果表明,PtDnmt2基因参与了三疣梭子蟹胚胎、幼体和性腺发育调控。     

盐碱胁迫对尼罗罗非鱼血清渗透压、离子浓度及离子转运酶基因表达的影响

为了解鱼类适应盐碱水环境的生理变化机理,将尼罗罗非鱼从淡水直接转入4个不同盐碱混合梯度组(A组:盐度10,碱度1 g/LNaHCO3;B组:盐度10,碱度2 g/LNaHCO3;C组:盐度15,碱度1 g/LNaHCO3;D组:盐度15,碱度2 g/LNaHCO3)中进行为期96 h的急性胁迫实验,分别检测胁迫后0、6、12、24、36、48、72和96 h时尼罗罗非鱼的血清渗透压、血清Na+、K+、Cl-浓度以及鳃中Na+-K+-ATP酶(NKA)和碳酸酐酶(CA)基因相对表达量的变化过程。结果显示,血清渗透压、离子浓度以及鳃中NKA基因和CA基因mRNA表达量变化程度均与其盐碱胁迫浓度间呈正相关,变化过程随着实验时间推移均呈现为先升、后降,最后趋于平稳。B、D组血清渗透压峰值出现在24 h,A、C组出现在36 h。血清Na+、K+、Cl-浓度均在24 h达到峰值。B、D组NKA基因mRNA表达峰值出现在24 h,A、C组出现在36 h;除A组外,其余各组CA基因mRNA表达峰值时间出现在24 h。研究表明,尼罗罗非鱼具有一定的盐碱适应能力,盐碱胁迫下NKA、CA是参与离子转运、渗透压调节的重要转运酶。     

大黄鱼sox9a/b基因的克隆与表达分析

为探究sox9基因在大黄鱼性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆得到大黄鱼sox9a和sox9b 2个基因,采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析其在雌雄个体不同组织和不同发育阶段的表达规律,并检测了其在17β-雌二醇处理后的遗传雄性和17α-甲基睾酮诱导处理后遗传雌性幼鱼中的表达变化。结果显示,大黄鱼sox9a c DNA全长2 442 bp(NCBI登录号:MH996431),包含476 bp 5′UTR、466 bp 3′UTR、1 500 bp ORF,编码499个氨基酸。大黄鱼sox9b cDNA全长为2 199 bp (NCBI登录号:MH996432),包含335 bp5′UTR、415 bp 3′UTR、1 449 bp ORF,编码482个氨基酸。qRT-PCR分析显示,sox9a基因主要在性腺、眼、脑、肝脏中表达,精巢中的表达量显著高于卵巢;sox9b在大黄鱼各组织中广泛表达,但以精巢中表达量最高,而卵巢中只有痕量表达。在鱼苗性腺发育初期,sox9a/b的表达量都维持在较低水平;随着鱼苗长大,sox9a/b的表达量在84 dph、123 dph 2次达到高峰,随后开始下降,10 mph后又逐渐上升。17β-雌二醇处理能够显著下调遗传雄性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达,17α-甲基睾酮处理则显著上调遗传雌性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达。研究表明,sox9a/b基因与大黄鱼性别发育和分化过程密切相关,对大黄鱼精巢的发育与维持起重要的调控作用,而且两个基因的功能可能具有一定程度的分化。     

凡纳滨对虾E75基因可变剪切形式的鉴定与分析

E75是对虾蜕皮激素信号通路的关键调控因子。为了深入了解E75基因的结构和功能,本实验从转录组数据中筛选得到注释为凡纳滨对虾E75基因的转录本,经与基因组序列比对分析,鉴定发现凡纳滨对虾E75基因至少存在6种可变剪接体,分别命名为LvE75-1、LvE75-2、LvE75-3、LvE75-4、LvE75-5和LvE75-6。其中LvE75-1/2/4/5/6均包含DBD和LBD结构域,与果蝇E75A/C有相同的结构域,而LvE75-3仅包含LBD结构域,与果蝇E75D相同。在凡纳滨对虾蜕皮过程中,LvE75-1/2/3/4在D3～D4时期高表达,而LvE75-5和LvE75-6表达量很低。在成体组织中,LvE75各种剪切形式在所有检测的组织中均有表达,且在表皮、肠和鳃中表达较高,在肝胰脏、血细胞和淋巴组织中仅LvE75-3表达较高。实验通过双链RNA干扰LvE75基因的表达,在干扰样品中,检测到Halloween基因中的spo、phm和dib表达下调,shd表达上调,表明LvE75可能通过调控Halloween基因的表达来影响蜕皮激素的合成;同时E75基因的干扰也使同为蜕皮激素早期应答基因的Br-C基因和Ftz-F1基因表达下调,HR3基因表达上调,表明LvE75基因对蜕皮信号通路上下游基因均有作用。在LvE75基因持续干扰12 d后,凡纳滨对虾的蜕皮率显著低于对照组,而死亡率显著高于对照组,说明LvE75基因对凡纳滨对虾的蜕皮和生存具有重要作用。     

大鲵皮肤cDNA文库ESTs分析及Dynll 2基因的分离与表达

以本实验室构建的大鲵皮肤cDNA文库为材料,通过文库质量检测、随机测序、ESTs拼接、COG软件进行基因注释等对文库进行了分析,并从中分离获得了大鲵胞质动力蛋白轻链2(dynein light chain,LC8-type 2,Dynll 2)基因的cDNA序列,对Dynll 2基因进行了生物信息学分析及组织表达研究。结果表明,本实验室构建的大鲵cDNA文库初级库容为1.50×10⁶ cfu,文库重组率为94.8%,插入片段平均长度约为1 kb。400个随机克隆测序共获得343个有效ESTs,其中214条ESTs序列E值＜10^-6,经COG软件归为9大类,其中与分泌蛋白、细胞代谢、细胞骨架以及信号转导相关的基因表达量最高,分别为31.3%、14.0%、13.0%和12.6%。表明大鲵皮肤分泌活动强烈,代谢旺盛,这和大鲵皮肤发挥免疫、呼吸以及渗透压平衡等生理功能相一致。获得的大鲵Dynll 2基因全长为682 bp,其中5′-UTR为57 bp,3′-UTR为313 bp,生物信息学分析表明,该基因编码104个氨基酸,分子量为12.03 ku,等电点pI值为7.05。Dynll 2蛋白在88~104处有由里向外和由外向里的2个跨膜螺旋区,且二级结构以α—螺旋为主;在69~87处有典型的“ZnFC2H2”结构模体;经比较,其三级结构与鼠Dynll 2蛋白相似。Dynll 2蛋白的进化分析表明,大鲵与无尾两栖类相比,更接近陆生动物。荧光定量实验表明,大鲵Dynll 2基因在肌肉中高表达,在其他组织中低度表达。     

CYP3A65及上游核受体基因PXR和AHR2在斑马鱼生长发育阶段的表达

为了选择处于最佳生长阶段的斑马鱼用于药物代谢研究,本实验考察不同生长阶段斑马鱼全鱼、肝脏和肠道组织中CYP3A65及其上游核受体基因(PXR、AHR2) mRNA表达水平的变化规律。实验测定CYP3A65、PXR和AHR2相对表达量,并通过比较核受体基因与代谢酶基因mRNA之间的相关性来证实核受体基因的调控作用。结果显示,144 hpf和75 dpf两个生长阶段的斑马鱼中CYP3A65、PXR和AHR2 mRNA表达量最高;斑马鱼生长阶段中代谢酶基因和核受体基因的表达趋势一致,且受肝脏、肠道组织占全鱼比重的影响。研究表明,幼鱼期144 hpf斑马鱼及稚鱼期75 dpf的斑马鱼最适用于CYP3A65代谢研究;CYP3A65与PXR、CYP3A65与AHR2的mRNA表达之间有显著的相关性,与AHR2的相关性更显著。     

日本沼虾细胞自噬基因ATG13和ATG101的克隆及其低氧胁迫下表达分析

为研究自噬相关基因(autophagy-related genes, ATG) ATG13和ATG101在甲壳动物应答低氧胁迫过程中的调节作用,实验采用RACE PCR技术通过克隆测序和基因序列拼接,首次克隆了日本沼虾的细胞自噬基因ATG13和ATG101的全长cDNA序列,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13 cDNA全长2 043 bp (NCBI登录号为MT084347),包括211 bp的5′末端非翻译区(untranslated region,UTR),449 bp的3′UTR和1 383 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),开放阅读框编码460个氨基酸;ATG101 cDNA全长1 051 bp(NCBI登录号为MT084348),包括18 bp的5′末端非翻译区,373 bp的3′UTR和660 bp的开放阅读框,开放阅读框编码219个氨基酸。通过软件和生物信息网站对其序列进行分析,氨基酸相似度比对显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13富含高度保守的LC3作用结构域(LIR);系统进化树分析显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13与凡纳滨对虾ATG13具有最近的亲缘关系;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)实验分析发现,日本沼虾ATG13和ATG101在其肝胰腺和脑组织表达量较高,而在肌肉中表达量较低;利用qRT-PCR追踪其在肝胰腺组织低氧胁迫过程中出现的表达差异情况,结果显示,实验组日本沼虾在低氧胁迫6和24 h时,其细胞自噬基因ATG13和ATG101表达量显著高于对照组,而在复氧12 h后,实验组与对照组的ATG13和ATG101表达量差异不显著;Western blot分析结果显示,日本沼虾ATG13和ATG101表达丰度基本与基因表达模式相似。透射电镜分析结果显示,在低氧胁迫6和24 h后,肝胰腺组织中的溶酶体开始出现自噬空泡,表明急性低氧胁迫会诱导自噬体的形成,本研究结果可为了解日本沼虾应对低氧胁迫下的调控机制提供理论参考。     

大菱鲆脂质代谢相关基因PPARs的组织表达及其对高温胁迫的响应

为研究大菱鲆过氧化物酶体增殖物激活受体家族(PPARs)的组织分布和高温胁迫下PPARs在肾脏中的表达情况。实验采用荧光定量PCR(qPCR)技术检测PPARs基因3种亚型在大菱鲆不同组织中的表达情况以及高温胁迫下大菱鲆肾脏中PPARs的表达情况。qPCR结果显示,大菱鲆PPARs 3种亚型的组织分布存在显著差异。PPARα1和PPARα2在心脏中的表达量显著高于其他组织;PPARβ在大菱鲆的各个组织中普遍表达;PPARγ在大菱鲆的鳃中出现了显著性的高表达。大菱鲆肾脏中PPARs的mRNA水平随着温度升高呈现出不同的响应模式。PPARα随温度升高表达水平先显著降低,后有所升高;PPARβ的表达量在14、20、23和25℃时差异不显著,当温度升高至大菱鲆的致死温度28℃时,表达量出现了显著性的升高;PPARγ在14℃时表达水平很低,但随着温度的升高不断增加。研究表明,大菱鲆中存在PPARα、PPARβ和PPARγ3种亚型,而且三者可能以组织特异性的方式参与脂质代谢的调节,首次指出PPARs 3种亚型在温度胁迫中的表达变化,对PPARs的研究将推动鱼类脂代谢研究,揭示鱼类PPARs在脂质代谢调控以及响应逆境胁迫中的重要作用。     

溶藻弧菌相关分离株的分子及VITEK鉴定

哈维群弧菌是弧菌属的核心菌群,包括溶藻弧菌在内的6个种在表型和遗传型上均十分相似,要准确鉴定各种有一定难度。看家基因的研究及生化鉴定系统的出现为弧菌鉴定提供了多种方法,本文比较了16S rRNA基因、toxR基因和pyrH基因以及VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡对溶藻弧菌相关分离株的分辨力。哈维群弧菌基因组内16S rRNA基因是多拷贝的,且拷贝间序列差异大于种间差异,不适用于种的鉴定。单拷贝基因toxR和pyrH序列种内差异均小于种间差异。基于toxR基因相似性比较可清楚地将18个疑似溶藻弧菌分离株和5个参比株归并到4个种;toxR基因系统发育学分析也显示,哈维群弧菌各种独立地聚类分支,且溶藻弧菌种内存在两个明显的聚类分支,说明两个分支的溶藻弧菌具有独立的进化方向。pyrH基因的相似性比较和发育学分析也得到类似的结果,但pyrH基因具有较强的保守性,因而分辨力稍低于toxR基因。VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡在鉴定溶藻弧菌时也有一定的错误率,且鉴定谱较窄。因此,建议在实际应用中采用toxR基因比对作为溶藻弧菌快速鉴定的主要手段,可再选用pyrH基因对鉴定结果进行验证。     

引起混养塘中异育银鲫和鲢发病死亡的病原及组织病理

混养的异育银鲫和鲢鱼种大批死亡,为明确发病死亡的病原和组织损伤并提供相关的疾病防控措施,进行了病鱼肉眼和显微镜检查、细菌学检测、病毒学检测、组织病理和药敏试验研究。结果发现,除在患病鱼体表偶然发现有少量不会引起充血等症状的杯体虫和车轮虫外,未在体内外发现其他寄生虫和真菌类病原;通过细菌分离、人工回感试验、生理生化特性和16S r RNA基因序列分析,从患病异育银鲫和鲢分离到的致病菌株均为嗜水气单胞菌;根据异育银鲫和鲢病毒性疾病的现状,使用鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)DNA聚合酶基因的特异性引物分别对自然发病的异育银鲫和鲢进行PCR检测,只有异育银鲫检测到Cy HV-2,分别用它们的除菌组织上清液进行人工感染试验,只有异育银鲫出现充血症状和死亡现象;由此得出嗜水气单胞菌是异育银鲫和鲢发病死亡的主要病原,Cy HV-2是异育银鲫混合感染的次要病原。患病鲢与患病异育银鲫呈现出类似的组织病理现象,又有一些各自特有的组织病理表现,单纯细菌感染的鲢轻度病变以细胞颗粒变性为主,坏死细胞以核溶解为主,细菌和病毒混合感染的异育银鲫肝脏轻度病变以细胞滴状玻璃样变的变性为主,坏死组织细胞以核固缩和核碎裂为主,在肾脏和脾脏出现染色质边集于核膜的肿大细胞核,主要组织器官出现从变性到坏死的病理变化过程,最终失去应有的功能而死亡。依据药敏试验结果,建议内服诺氟沙星和氟苯尼考等抗生素防治本病的嗜水气单胞菌感染,混合感染Cy HV-2的异育银鲫可以通过注射Cy HV-2疫苗和生态养殖的方法控制和减少该病毒病感染和发展。     

Identification of Stress Sensitive Genes in Hyperthermic Atlantic Salmon (Salmo salar) Embryos by RAP-PCR

Deformities of skeletal structures, the heart, and other organs are a recurrent problem in species used in intensive aquaculture. Elevated egg incubation temperature appears to be a high risk factor in the development of these malformations, but the causal relation has not been established. Our aim was to identify candidate genes involved in the development of heat induced deformities in Atlantic salmon (Salmo salar). Temperature sensitive genes were isolated by RNA Arbitrarily Primed (RAP)-PCR. A total of 33 RAP-PCR products were successfully sequenced, and the expression of eight identified genes was further examined by RT-PCR from pooled samples of heat exposed embryos. Five of these genes were demonstrated to be temperature sensitive, of which four were shown to be up-regulated and one was down-regulated at elevated water temperatures. The atrial natriuretic peptide (ANP) gene, which is a promising candidate for heart deformities, showed the highest level of heat induction. Three additional RAP-PCR products identified as heterogeneous nuclear ribonucleprotein (hnRNP) A0, acyl CoA binding protein (ACBP) and mitochondrial (mt)-HSP70 showed up-regulated mRNA expression in response to elevated water temperature. The single down-regulated gene was identified as an Atlantic salmon (Salmo salar) homolog of the cysteine and tyrosine-rich 1 (CYYR1) gene. This study demonstrated that a temperature elevation of only 4 °C during the early stages of the organogenesis in Atlantic salmon induce altered expression of a number of genes, which are candidates for the development of heat induced deformities.     

倒刺鲃属三个种之间种间杂交的初步研究

采用人工催产和干法授精技术,进行了以中华倒刺鲃、倒刺鲃为母本与其父本及黑脊倒刺鲃雄鱼的种间杂交实验,获得4个杂交组合和2个自交组合,在(27±0.5)℃温度条件下,对其F₁卵膜径、受精率、孵化率、孵化时间、畸形率、子代早期形态特征与成活率进行了比较,同时,观察了胚胎发育及其异常现象,结果表明:以中华倒刺鲃为母本的F₁卵膜径差异不显著;以倒刺鲃为母本的F₁卵膜径,在多细胞期时差异不显著,在耳石期时,倒刺鲃♀×中华倒刺鲃♂F₁卵膜径显著大于母本(P<0.05)。杂种F₁的受精率、孵化时间与母本差异不显著,畸形率显著高于母本(P<0.05)。中华倒刺鲃杂种F₁的孵化率较高,与母本差异不显著(P<0.05)。倒刺鲃♀×中华倒刺鲃♂F₁的孵化率与母本之间差异不显著,倒刺鲃♀×黑脊倒刺鲃♂F₁的孵化率显著低于母本(P<0.05)。中华倒刺鲃杂种F₁仔鱼早期发育阶段存在死亡高峰期,成活率显著低于母本(P<0.05)。中华倒刺鲃种间杂交和倒刺鲃♀×黑脊倒刺鲃♂杂种F₁既具有父本特征,同时又具有母本特征,初步证明倒刺鲃属种间杂交是可行的。     

欧洲鳗短钩拟指环虫病及其鳃组织病理

报道了患短钩拟指环虫病欧洲鳗的症状、流行状况和鳃显微组织病理.游动和呼吸频率异常、鳃丝浮肿和鳃上粘液增多为该病的主要症状.该病尽管在冬季也有发生,但水温在26℃以上的春末、夏季和秋初是最易发病的流行季节,流行出现明显的季节性变化.患病欧洲鳗鳃的组织病理变化主要表现出5种类型,其一是鳃小片上皮细胞增生,使邻近的鳃小片相连;其二是鳃小片粘液细胞增生,同样使鳃小片连成一片,增生的粘液细胞经阿利新蓝(Alclan blue)和过碘酸雪夫氏(Periodic acid schiff)二者联合染色后呈蓝紫色的染色反应,属于Ⅳ型的粘液细胞;其三是鳃小片肿大,但单层扁平上皮细胞无肿大现象,上皮细胞层与毛细血管相分离,鳃小片上皮细胞坏死,上皮细胞层破裂,血细胞外溢,鳃小片上皮细胞坏死脱落后,失去鳃小片原有的结构;其四是鳃小片肿大同时伴随单层扁平上皮细胞肿大,进一步发展,鳃小片上皮细胞坏死脱落后,鳃小片同样失去原有的结构;其五是鳃小片毛细血管严重充血扩张,比原毛细血管扩张几倍到十几倍,形成充满红细胞的棒状到球状的动脉瘤.结果表明鳃上皮细胞增生、粘液细胞增生、鳃小片肿大、上皮细胞坏死脱落和严重充血成动脉瘤等病理变化都可导致患病欧洲鳗呼吸困难,轻者影响其生长,重者最终因呼吸衰竭而死亡.     

曼氏无针乌贼Phb2基因的克隆和其在不同生长阶段的表达分析

Phb2是抗增殖蛋白(Prohibitin)的一个亚型。本研究利用RACE技术首次获得了曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)Phb2基因的全长序列,该序列全长为1283 bp,其中5′非编码区(5′-UTR)150 bp,3′非编码区(3′-UTR)236 bp,开放阅读框(ORF)897 bp,预测编码298个氨基酸。序列分析表明,曼氏无针乌贼Phb2基因编码的蛋白无信号肽,第20~42位氨基酸为跨膜结构,包含1个PHB家族的结构域。采用荧光定量PCR技术检测其在曼氏无针乌贼不同生长时期(幼体、产卵前、产卵中、产卵后濒死前)各组织中的表达情况,结果显示,Phb2在4个时期的各组织中均有表达,其中,幼体和濒死前表达量较低,产卵前和产卵中的表达量则相对较高,在各时期中脑、肝表达较多。视腺作为与生殖调控有关的内分泌器官,其Phb2基因表达具有时期差异性,在产卵后的表达量由产卵时期的高表达大幅下降,说明Phb2具有周期调节、控制细胞衰老和凋亡的多效性功能。本研究结果可为进一步了解抗增殖蛋白对曼氏无针乌贼的抗衰老作用提供参考。     

珠江口海域双胞旋沟藻赤潮对卤虫幼体、鱼苗和虾苗的急性毒性

为研究2009年10月下旬在广东珠海海域爆发的双胞旋沟藻赤潮对养殖鱼类及水体中其它生物的影响,实验以卤虫幼体、金鼓鱼苗和凡纳滨对虾苗作为受试生物,在赤潮现场测试双胞旋沟藻对卤虫幼体、鱼苗和虾苗的急性毒性效应。结果显示,24 h双胞旋沟藻对卤虫幼体的LC₅₀(半致死浓度)为9.55×10⁴/mL,藻密度为2.5×10³/mL的双胞旋沟藻对卤虫幼体的LT₅₀(半致死时间)为48.5 h。60 h内该赤潮水体对鱼苗和虾苗的存活无不利影响,卤虫幼体和金鼓鱼苗均可摄食双胞旋沟藻,卤虫幼体对双胞旋沟藻的摄食率低。研究表明,双胞旋沟藻赤潮水体对卤虫幼体有一定的毒性作用,但在低藻密度条件下,卤虫幼体能以该藻为食并维持其生命,双胞旋沟藻对金鼓鱼苗和凡纳滨对虾苗无急性毒性作用。     

中华鲟、史氏鲟及达氏鳇血清免疫球蛋白的纯化及部分特性分析

采用饱和硫酸氨分步沉淀和Sephadex G200凝胶层析的方法，首次分别纯化制备了健康非免疫状态下中华鲟（Acipenser sinensis）、史氏鲟（Acipenser schrenckii）和达氏鳇（Huso dauricus）的血清免疫球蛋白（Ig） ，并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）、蛋白免 疫印迹（Western blotting）及免疫琼扩实验等方法对其Ig及Ig亚单位的分子量和部分特性进行了分析。PAGE及SDSPAGE的结果显示：史氏鲟，中华鲟和达氏鳇IgM的相对分子量分别为867 kD， 896 kD和924 kD；3种鲟鱼Ig的重链分子量均为88 kD，都具有29 kD的轻链，其中达氏鳇还另有一分子量约为26 kD的轻链蛋白。分子量的测定及计算结果显示鲟鱼的Ig为四聚体。Western-blotting的检测结果表明，3种鲟鱼Ig的重链与其Ig具有同样的抗原性，在硝酸纤维素膜上可被兔抗鲟Ig多克隆抗体所识别，而轻链的Western blotting检测结果则呈阴性。免疫沉淀反应的结果显示，3种鲟鱼的血清及其Ig与相互之间的兔抗Ig血清有免疫沉淀反应，但与兔抗鲤Ig血清无免疫沉淀反应，这表明3种鲟科鱼类的Ig在结构和序列上是较为相似的，而与鲤鱼等高等硬骨鱼类的Ig存在较大的差别。     

日本沼虾cytMnSOD和mtMnSOD基因全长cDNA克隆及表达

利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn2+结合位点和2个N-糖基化位点。Real-time PCR结果表明,cytMnSOD和mtMnSOD在日本沼虾肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达,其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低。嗜水气单胞菌刺激后3 h,肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD的表达量显著增加,推测MnSOD是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

半滑舌鳎TRAF6 基因和TAK1 基因的克隆及表达分析

本研究通过同源克隆和RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)和转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)的c DNA全长,并分析了其在不同组织和早期胚胎发育时期的表达情况。结果表明,TRAF6 c DNA全长1956 bp,开放阅读框(ORF)为1731 bp,编码576个氨基酸。二级结构预测显示TRAF6具有保守的蛋白结构域:N端的RING结构,两个锌指结构以及C端的环–环(coiled-coil)α螺旋结构和高度保守的MATH同源结构。TAK1 c DNA全长2519 bp,ORF为1731 bp,编码576个氨基酸。TAK1的蛋白结构域包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶激活结构域和C端的环–环(coiled-coil)α螺旋结构域。系统进化树分析表明,半滑舌鳎TRAF6和TAK1分别与牙鲆(Paralichthys olivaceus)TRAF6和TAK1聚为一支,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,TRAF6和TAK1在所检测的8种组织中都有表达,TRAF6在鳃中的表达最高,肠中也有较高的表达;TAK1在心脏中的表达量最高,其次是肾。TRAF6和TAK1在鳃、肾等免疫器官中的高表达,与其在Toll样受体信号通路中的重要作用是一致的。对TRAF6和TAK1在早期胚胎发育时期的表达情况进行检测,结果显示,在未受精卵中可检测到TRAF6和TAK1,提示了这两种免疫分子的母源性m RNA遗传的可能性。免疫分子母源性m RNA可能参与发育过程,也可能参与构建免疫体系,以保护胚胎或仔鱼免受病原体的侵袭。