栉孔扇贝与虾夷扇贝杂交及子一代的遗传性状

20 0 0～ 2 0 0 3年在山东省长岛增殖站进行了以栉孔扇贝为母本与虾夷扇贝为父本 (正交 )、虾夷扇贝为母本与栉孔扇贝为父本 (反交 )、栉孔扇贝自交、虾夷扇贝自交的苗种培育 ,并在同一海区进行了养殖试验。结果表明 ,水温 15～ 18℃条件下 ,正、反交均可正常受精 ,受精率在 90 %以上 ,与对照组没有明显差别 ;成体的外部形态与母本基本相同 ,是偏向母本类型的异源二倍体 ;正交组在第 2年高水温季节栉孔扇贝出现大量死亡的情况下 ,成活率达 95 % ,生长速度提高 2 3% ,反交组在苗种中间暂养和养殖过程中的成活率比虾夷扇贝提高 16 % ,生长速度未见显著差别 ;正、反交子一代生殖腺发育正常 ,可排放精、卵。试验证明 ,栉孔扇贝♀×虾夷扇贝♂的杂交子一代 ,外部形态虽与栉孔扇贝基本相同 ,但显著提高了栉孔扇贝的生产性能尤其是抗逆能力 ,远缘杂交育种是解决栉孔扇贝大面积死亡的重要途径之一 ,其杂交子一代已经具有生产使用价值。     

栉孔扇贝♀×虾夷扇贝♂杂交子一代与其双亲同工酶的比较研究

采用不连续垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳法,对栉孔扇贝(Chlamys farreri)♀、虾夷扇贝(Pa-tinopecten yessoensis)♂及其杂交子一代的ADH、MDH、SDH、IDH、ME和SOD共6种同工酶的酶谱进行分析,以探讨双亲遗传物质在杂交子代中的表达情况及杂交子代基因的表达特征。结果表明,杂交子代的同工酶酶谱与母本栉孔扇贝的相似,而与父本虾夷扇贝的明显不同,说明父本虾夷扇贝的同工酶在杂交子代中没有表达。幼虫阶段的同工酶酶谱亦表明,父本虾夷扇贝的同工酶在杂交子代的幼虫阶段仍然没有表达。另外,在对母本栉孔扇贝群体和杂交子代群体的同工酶酶谱进行比较研究时发现,在杂交子代中出现了一定比例的杂合子,因此不能确定杂交子代是由雌核发育而来。     

紫扇贝与海湾扇贝杂交后代的母本亲权鉴定方法

紫扇贝与海湾扇贝的成功杂交为改善海湾扇贝的种质提供了新的途径。但紫扇贝和海湾扇贝均为雌雄同体的动物,在育种实践中存在着精子或卵子污染的问题,为确保育种进程的顺利进行并确证后代的谱系,经常需要确定某一后代是否为真正的杂交后代及其父母本来源,因此需要建立一种方法来快速鉴定其亲本来源尤其是母本来源。本文通过比对海湾扇贝和紫扇贝mtDNA序列差异性,设计并筛选出一对特异性引物(mtDNA-Z),可在紫扇贝中扩增出约460bp的PCR产物,而在海湾扇贝中无扩增,因此可由此建立一种鉴定杂交后代母本亲权的方法。用该方法在杂交一代紫海、海紫扇贝和回交一代紫海海、紫海紫、海紫海、海紫紫扇贝的验证结果表明,该方法简单、快速、可靠。     

栉孔扇贝、虾夷扇贝及其杂交子代的MSAP分析

运用甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术对栉孔扇贝(♀)、虾夷扇贝(♂)及其杂交子一代、子二代基因组DNA胞嘧啶甲基化水平进行了研究,并分析了DNA甲基化与各性状的相关性及其与杂种优势的关系。结果表明,(1)DNA甲基化率与壳宽、总重等表型值呈正相关的关系,而与壳长、壳高、软体重和闭壳肌重4个性状表型值呈负相关的关系,其中闭壳肌重与甲基化率的相关性达到极显著水平(P<0.01);(2)虾夷扇贝、栉孔扇贝、F1代、F2代的总甲基化率分别为32.79%、24.13%、19.98%、20.18%,杂交种F1代的甲基化水平低于双亲,是两种扇贝杂交的结果;F1代的甲基化模式经过了重新调整,其变化相对其亲本主要有4种类型:甲基化水平相同、去甲基化、超甲基化、次甲基化,且去甲基化位点多于超甲基化位点。结果证实杂种优势的产生与杂交种F1代基因组DNA甲基化模式的改变和重新调整有关,丰富了杂种优势机理研究内容。     

微卫星评价栉孔扇贝雌核发育二倍体纯合性

采用筛选获得的5对多态性微卫星引物对栉孔扇贝（Chlamys farreri）减数分裂雌核发育家系A和家系B、有丝分裂雌核发育家系A和家系B各30个个体、双亲及对照组40个个体进行了遗传变异分析，并对减数分裂和有丝分裂雌核发育后代的纯合性进行了比较。电泳结果表明，5对微卫星引物在减数分裂雌核发育和有丝分裂雌核发育个体中均能稳定重复地扩增出相应的序列；各雌核发育家系中均有部分个体出现父本基因，表明精子遗传物质失活不彻底，雌核发育组中存在正常受精个体；有丝分裂雌核发育二倍体在所有检测位点全部纯合，减数分裂雌核发育二倍体在部分位点纯合，但未发现在所有位点全部纯合的个体，在CFMSP007、CFMSP075、CFMSM009、CFMSM014和CFMSM020位点，杂合子比例分别为0．3400、0．3611、0．4884、0．4750和0．7500，平均杂合子比例为0．4829。研究结果显示，栉孔扇贝有丝分裂雌核发育二倍体均为纯合子，如精子的灭活率达到100％，有丝分裂雌核发育二倍体一代即可实现纯合，如再进行一次减数雌核发育即可建立纯系；减数分裂雌核发育二倍体由于具有较高的重组率，其与母本的遗传同质性较高。     

RAPD标记在合浦珠母贝家系F1代的分离方式

对RAPD标记在合浦珠母贝F1代全同胞家系共27个样品中的分离方式进行了研究。从21条RAPD随机引物中筛选了8条引物用于扩增分析,结果共扩增出49个位点,其中正常位点47个(95.9%),异常位点2个(4.1%),即子代有扩增带而双亲无。47个正常位点中3个位点在F1中不分离(6.4%),44个位点发生分离(93.6%,即多态位点)。卡方检验表明,44个分离位点中32个符合孟德尔分离规律(72.7%),12个位点发生偏分离(27.3%)。符合孟德尔分离位点中按11分离位点占43.8%,31分离位点占56.2%,其中,父本特有标记、母本特有标记和双亲共有标记分别占28.2%,15.6%和56.2%,父本特有标记略多于母本特有标记。根据“双假测交”理论,11分离位点是构建F1代家系的作图位点。较高的11分离位点表明,利用RAPD标记构建合浦珠母贝遗传连锁图谱是可行的。     

虾夷扇贝与风向标扇贝种间杂交的初步研究

针对虾夷扇贝在养殖过程中出现的问题,本研究以风向标扇贝和虾夷扇贝为亲本进行了种间杂交实验,培育出了虾夷扇贝（♀）×风向标扇贝（♂）（PY♀×PC♂）及风向标扇贝（♀）×虾夷扇贝（♂）（PC♀×PY♂）两种杂交一代,并对其早期发育及幼虫期和稚贝期生长进行了比较。结果显示,PY♀×PC♂杂交一代的受精率、孵化率和幼虫期的生长和存活率介于双亲之间,而壳高和壳长的生长均高于双亲,表现出显著的杂种优势;PC♀×PY♂杂交一代的受精率、孵化率、幼虫期生长和存活率均低于双亲,表现为杂种劣势。在养殖第1年,PY♀×PC♂杂交一代的壳高、壳长、壳宽和体质量增长率均高于双亲,杂种优势显著。研究表明,卵子来源对后代的表现具有极其显著的影响,以雌性虾夷扇贝与雄性风向标扇贝进行种间杂交从而改良虾夷扇贝种质是可行的。     

海湾扇贝杂交后代的微卫星鉴定

海湾扇贝(Argopecten irradians)是典型的雌雄同体型贝类,行体外受精,因此杂交育种过程中存在非目标配子污染的问题。本研究筛选10对多态性微卫星引物对海湾扇贝两个亲本及正反交两个F1子代群体各100个个体进行了分析。基因型分析结果表明,所有后代等位基因均来源于双亲,不存在外源等位基因污染情况。卡方检验表明,杂交后代基因型比例符合孟德尔遗传分离比,即微卫星标记符合孟德尔遗传。其中对AIMS026扩增位点的分析结果表明,杂交后代基因型均为双亲互补型,没有出现自交后代基因型,即杂交过程中没有自身配子的污染。该研究证实了微卫星在海湾扇贝中分离的孟德尔遗传规律,同时验证了海湾扇贝杂交过程中一系列避免异源配子污染方法的有效性,为海湾扇贝定向杂交配子隔离的可靠性提供了分子生物学证据。     

合浦珠母贝印度家系F↓（1）代的AFLP分析

用AFLP标记对合浦珠母贝(Pinctada fucata)印度家系的亲本及其子一代(F1)进行了遗传分析。27对引物共扩增出1 013个位点,其中835个位点在F1代分离,178个位点不分离,多态位点比例82.4%。分离位点中,符合孟德尔分离规律的位点458个,占分离位点数的54.9%。偏孟德尔分离规律的位点377个,占分离位点数的45.1%。分离比为3∶1的位点共有482个,占分离位点数的57.7%,符合孟德尔分离规律的位点251个,占52.1%(占分离位点数的30.1%);分离比为1∶1的位点共有353个,占分离位点数的42.3%,符合孟德尔规律的位点207个,占58.6%(占分离位点数的24.8%)。半数以上的标记符合孟德尔遗传规律。表明AFLP标记适合于合浦珠母贝的遗传图谱构建。[中国水产科学,2007,14(1):52-58]     

草鱼、赤眼鳟及其杂交F1遗传多样性的RAPD分析

采用RAPD-PCR分子标记技术分析了草鱼、赤眼鳟及其正、反交子一代的遗传多样性。从100条引物中筛选出13条扩增效率高、多态性高的有效引物,对4个群体共120尾个体样本进行扩增,获得115个基因位点,扩增产物大小集中在300~3 000 bp,草鱼、正交F_1、赤眼鳟和反交F_1多态位点率分别为85.22%、77.39%、80.87%和70.43%,Shannon信息指数分别为0.392 4、0.396 9、0.443 3和0.358 3。结果表明,赤眼鳟的遗传多样性最丰富,正交F_1的遗传多样性优于草鱼,反交F_1的多样性最差。遗传同源性和遗传距离聚类分析表明,正交F_1和反交F_1与赤眼鳟的遗传关系更近。种群平均遗传分化指数为0.302 6,表明4个群体之间的遗传分化程度较高,30.26%的变异来源于群体间。     

栉孔扇贝、虾夷扇贝及其杂交子代的群体遗传多样性分析

采用扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)标记对栉孔扇贝(Chlamys farreri,♀)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis,♂)及其Fl群体的遗传多样性进行分析.5对引物组合共扩增得到315个位点,其中311个为多态位点,总的多态位点比例为98.73%.栉孔扇贝、虾夷扇贝及其F1群体的Shannon信息指数分别为0.477 1±0.260 6、0.423 9±0.277 7、0.548 8±0.220 9;3个群体的Nei's基因多样性指数分别为0.329 1±0.185 0、0.289 7±0.195 9、0.382 8±0.161 2,表明杂交子代群体的遗传多样性水平比2个亲本群体都高.栉孔扇贝与虾夷扇贝群体间的遗传距离为0.411 6,栉孔扇贝与F1群体间的遗传距离是0.131 6,虾夷扇贝与F1群体间的遗传距离是0.278 0,表明杂种子代与母本栉孔扇贝遗传距离较近.聚类分析显示,虾夷扇贝群体、栉孔扇贝群体以及F1群体的所有个体分别聚到一起,且都形成独立群体;分子方差分析(AMOVA)结果显示,变异来源有30.47%来自群体间,有69.53%来自群体内,表明群体内的遗传多样性比较丰富.杂种优势的产生与群体遗传多态性有关.     

云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢及其杂交子一代间的遗传关系

应用RAPD技术研究云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢及其杂交子一代(F1)间的遗传关系。筛选得到25个随机引物均在亲本和杂交子一代间呈现多态,遗传相似性指数和遗传距离的计算结果显示,正交F1(云斑尖塘鳢♂×线纹尖塘鳢♀)与母本平均遗传相似系数(0.7090)高于与父本平均遗传相似系数(0.5948);反交F1(云斑尖塘鳢♀×线纹尖塘鳢♂)与母本平均遗传相似系数(0.6301)也高于与父本平均遗传相似系数(0.6089)。说明正反交子代在遗传关系上均偏向各自的母本,对扩增带和聚类图的分析均得到这一结果,表明F1所接受的双亲遗传物质并非完全对等的,所获得的遗传信息可能更多来自母本。     

栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交子代的GISH鉴定及其免疫学特性

以栉孔扇贝[Chlamys farreri（Jones et Preston）]（♀）和虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）（♂）杂交子代担轮幼虫为材料，分别用栉孔扇贝和虾夷扇贝基因组作探针，采用基因组荧光原位杂交（GISH）的方法，对杂交后代杂交子的确切身份进行初步鉴定。结果表明，子代分别继承了双亲各一套染色体（n=19），为真正的杂交种。为了解杂交扇贝的免疫学特性，在自然海域栉孔扇贝大规模死亡的情况下，分别对杂交扇贝及其亲本3个扇贝群体血细胞的胞内活性氧含量（ROIs）、血清凝集素效价（HA）、溶菌酶活力（LSZ）、抑菌活力、酚氧化酶活性（P0）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）以及酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（ALP）等9种非特异性免疫学指标进行测定。结果表明，栉孔扇贝除ROIs、SOD、ACP等3个指标显著低于虾夷扇贝外（P〈0．01），其他6种指标均高于虾夷扇贝，且除血清凝集素效价外均达显著水平（P〈0．05）。在杂交子代中，上述免疫指标除SOD活性低于低值亲本外（P〉0．6），其余8种免疫指标均介于双亲之间。杂交子代在9种免疫指标中有8种与母本无显著性差异，而子代与父本之间9种免疫指标中有7种达显著差异（P〈0．05）。这些结果说明，杂交扇贝在非特异性免疫上存在明显的偏母性特征，这点与子代在外形特征上的偏母性相吻合。因此杂交扇贝相对于其母本在生产实践中表现出的一定程度的抗逆优势可能与非特异性免疫无明显关系。[中国水产科学，2006，13（4）：597—602]     

急性温度胁迫对虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)基因组DNA甲基化的影响

为探讨急性温度胁迫对虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)基因组 DNA 甲基化水平的影响,本研究从表观遗传学角度,运用甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术比较分析了升温海水(17℃和24℃)急性胁迫虾夷扇贝(原暂养于9℃的海水中)9 h 和24 h 后基因组 DNA 甲基化的变化情况。结果显示,9对引物在各组的总扩增位点数为314–337,总甲基化位点为79–94,所占比例为23.45%–28.51%;所有处理组基因组 DNA 总甲基化率低于对照组,急性升温胁迫使虾夷扇贝基因组 DNA 发生去甲基化,而且去甲基化程度随胁迫温差增大和胁迫时间增长而增强,说明急性升温胁迫能够改变 DNA 甲基化水平和模式。本研究为进行虾夷扇贝抗逆基因的筛查提供了新思路和研究基础,丰富了表观遗传学在扇贝中的研究资料。     

栉孔扇贝（♀）×虾夷扇贝（♂）杂交子代胚后发育过程中遗传构成变化研究

采用RAPD和GISH技术对栉孔扇贝（♀）和虾夷扇贝（♂）杂交子代胚后发育4个重要时期（担轮幼虫期、D形幼虫期、壳顶幼虫期和眼点幼虫期）的遗传构成进行了检测。在RAPD检测中,50条随机引物在亲贝中共扩增出35条栉孔扇贝的特异条带和28条虾夷扇贝特异条带,其中栉孔扇贝特异条带在杂交子代4个时期出现的条数分别为：担轮幼虫期21条、D形幼虫期19条、壳顶幼虫期23条和眼点幼虫期23条;而虾夷扇贝特异条带在杂交子代4个时期出现的条数分别为：17、16、1和1。GISH结果表明,杂交扇贝在担轮幼虫期和D形幼虫期均继承了来自父母本遗传物质,而在壳顶幼虫期和眼点幼虫期未检测到来自父本的遗传物质。结果表明,杂交子代遗传结构在进入壳顶幼虫期时发生重大改变,大部分父本遗传物质从杂交贝基因组中丧失。     

虾夷扇贝×栉孔扇贝人工受精过程的荧光显微观察

采用 DAPI染色显微荧光方法 ,连续观察了虾夷扇贝×栉孔扇贝的正反交受精细胞学过程。无论正交或反交 ,精子均可正常入卵 ;受精卵能顺利完成第 1次、第 2次减数分裂 ,排出第一、第二极体 ;精子和卵子内的各一套染色体融合后 ,形成二倍体的合子进入正常的细胞分裂 ,其发育过程同母本     

黄姑鱼异质雌核发育子代的遗传分析

为了解黄姑鱼（Nibea albiflora）异质雌核发育子代的基因纯合情况，利用微卫星标记（SSR）和扩增片段长度多态性标记（AFLP）对黄姑鱼异质雌核发育家系进行遗传鉴定和分析。结果显示：（1）雌核发育家系在4个SSR位点和5对AFLP引物组合扩增出的位点均未发现父本特异性等位条带，表明雌核发育体比率为100%。（2）用于遗传分析的7个SSR位点在雌核发育家系和正常交配家系中均未见完全纯合的情况，雌核发育家系7个SSR位点的平均纯合度为0.382，是正常交配家系（0.161）的2.37倍。雌核发育家系各个体的纯合位点数为0~6个，纯合位点所占比例为0~85.7%。（3）5对AFLP引物共扩增出182条清晰的扩增条带，其中有21条父本特异性条带和16条母本特异性条带。16条母本特异性条带中有7个条带在雌核发育家系中显著偏分离（P<0.05）。雌核发育家系和正常交配家系多态性条带比例分别为14.7%和20.3%。（4）雌核发育家系与母本的遗传相似度高于与正常交配家系的遗传相似度，正常交配家系同父本和母本的遗传距离大致相同。研究结果表明，黄姑鱼异质雌核发育二倍体家系的遗传纯合度显著高于正常交配家系，人工诱导雌核发育是促进基因纯合的一个有效途径，它不仅可以加速有利基因的纯合固定，还可以加速有害基因的淘汰，从而有效提高育种效率。     

栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交子代的GlSH鉴定及其免疫学特性

以栉孔扇贝[Chlamys farreri(Jones etPreston)](♀)和虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)(♂)杂交子代担轮幼虫为材料，分别用栉孔扇贝和虾夷扇贝基因组作探针，采用基因组荧光原位杂交(GISH)的方法，对杂交后代杂交子的确切身份进行初步鉴定。结果表明，子代分别继承了双亲各     

墨西哥湾扇贝与华贵栉孔扇贝的远缘杂交

为进一步研究扇贝属间远缘杂交的可行性,以墨西哥湾扇贝(Argopecten irradians concentricus)与华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)作为亲本,建立了两种扇贝的正交组MH、反交组HM、墨西哥湾扇贝自交组MM和华贵栉孔扇贝自交组HH。对各实验组的胚胎发育速度、受精率、孵化率、D形幼虫发生率和幼虫生长速度进行比较,分析了不同温度、盐度和精子浓度对各实验组配子亲和力及合子育性的影响,并尝试运用BP神经网络模型预测杂交组浮游幼虫的生长趋势。结果表明,两种扇贝的正反杂交均可获得早期杂交子代(F_1)。从胚胎发育情况看,正反杂交组幼虫发育到D形幼虫的时间均少于两个自交对照组;其受精率、孵化率、D形幼虫发生率也低于两个自交对照组;即使在不同温度、盐度和不同精子浓度下正反交组的受精率和孵化率也均低于两个自交组。从浮游幼虫生长情况看,正反交组D形幼虫的壳长和壳高均高于两个自交组,具有显著的差异性(P0.01),表现出较明显的杂种优势。运用BP神经网络模型对正反交组的浮游幼虫进行预测,其预测值与实测值的误差率均小于4%。     

异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育后代的微卫星分析

采用紫外线遗传灭活的长牡蛎精子激活栉孔扇贝卵子，6-DMAP诱导染色体加倍的方法，获得第二极体抑制型雌核发育二倍体早期胚胎。通过优化PCR反应条件，在11对栉孔扇贝和10对长牡蛎微卫星引物中共筛选出3对引物，可以同时在长牡蛎和栉孔扇贝基因组中获得稳定性，多态性较好的特异性扩增条带，其中2对引物为栉孔扇贝引物。利用筛选出的3对通用微卫星引物对雌核发育后代进行检验及遗传分析。结果表明，雌核发育个体基因完全来自于母本，后代中没有父本基因的表达；部分雌核发育后代在3个座位上发生了纯合，部分个体发生了不同程度的基因重组，3个座位上的重组率分别为40%、55%和35%。研究结果从分子水平上证实，利用遗传失活的长牡蛎精子诱导栉孔扇贝雌核发育是可行的，只进行一次第二极体抑制型雌核发育二倍体的诱导只能获得部分后代个体的基因纯合，但后代与母本具有较高的遗传同质性。