中国明对虾酚氧化酶原基因cDNA的克隆与表达特征

利用3′和5′RACE技术从中国明对虾血细胞中克隆了一个酚氧化酶原基因FCproPO,FCproPO基因cDNA全长为2311bp,其中开放阅读框2061bp,编码687个氨基酸,预测分子量为78.71ku。推测的序列与凡纳滨对虾同源性为84%,与日本囊对虾同源性为71%。RT-PCR实验结果表明,FCproPO在血细胞中的相对表达量最高,在心脏和精巢中几乎不表达。序列分析发现FCproPO含有两个保守的铜离子结合位点;进化分析发现FCproPO与斑节对虾、日本囊对虾、凡纳滨对虾等海水虾的酚氧化酶原亲缘关系最近。该基因在被鳗弧菌和对虾白斑病毒(WSSV)感染后的对虾肝胰腺中的表达量显著增加,并具有不同的时空表达趋势,提示中国明对虾FCproPO基因在免疫反应中具有重要作用。     

中国对虾Rab7全长cDNA的克隆及原核表达

本研究采用RACE方法克隆了中国对虾Fenneropenaeus chinensis Rab 7基因(crab7)全长cDNA (GenBank∶JF742050).生物信息学分析显示,fcrab7的开放阅读框615bp,编码205个氨基酸,分子量23.2kD.FcRab7的氨基酸序列具有Rab蛋白家族的共同特征,与凡纳滨对虾和斑节对虾同源蛋白的同源性为100％.构建重组表达载体pBAD/ gⅢA-crab7转化到大肠杆菌E.coli进行诱导表达,诱导产物经SDS-PAGE检测和Western blot验证.本研究结果为进一步研究WSSV与FcRab7的相互作用提供了基础.     

三疣梭子蟹钙调蛋白基因的克隆及在蜕皮中的功能分析

基于转录组数据库信息,采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)钙调蛋白基因(PTCaM)。该基因cDNA全长1981 bp,包含450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,预测分子量16.8 k D,理论等电点为4.09。对序列进行生物信息学分析发现,PTCaM是一个高度保守的序列,具有EF家族典型的EF-hand钙离子结合域。同源性分析结果表明,PTCaM基因编码的氨基酸与果蝇和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的Ca M氨基酸序列覆盖率高达100%,与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)和仿刺参(Apostichopus japonicus)覆盖率高达99%。系统进化表明,PTCaM基因氨基酸序列与凡纳滨对虾、中华绒螯蟹和克氏原螯虾聚为一支。通过分析不同蜕皮时期各个组织中PTCaM的表达情况得知,该基因在蜕皮时期的各个组织中均出现差异性表达,并且差异显著,说明该基因参与蜕皮调控过程。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) F0-ATP合酶b链全长cDNA的克隆及组织分布

采用RACE方法克隆得到了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的F0-ATP合酶b链基因的全长cDNA序列。生物信息学分析显示,该基因开放阅读框744 bp,编码248个氨基酸,分子量为28.2 kDa。Blast比对结果显示,克隆得到的cDNA序列所编码的氨基酸序列与海虱(Caligus clemensi) F0-ATP合酶β亚基的同源性为50%,与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) F0-ATP合酶β亚基的同源性为60%。免疫组化实验及流式细胞分析表明,F0-ATP合酶b链广泛分布于对虾鳃组织中,并且在对虾血细胞表面有分布。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) F0-ATP合酶b链全长cDNA的克隆及组织分布

采用RACE方法克隆得到了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的F0-ATP合酶b链基因的全长cDNA序列.生物信息学分析显示,该基因开放阅读框744 bp,编码248个氨基酸,分子量为28.2 kDa.Blast比对结果显示,克隆得到的cDNA序列所编码的氨基酸序列与海虱(Caligus clemensi) F0-ATP合酶β亚基的同源性为50%,与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) F0-ATP合酶β亚基的同源性为60%.免疫组化实验及流式细胞分析表明,F0-ATP合酶b链广泛分布于对虾鳃组织中,并且在对虾血细胞表面有分布.     

中国对虾血蓝蛋白基因cDNA的克隆与序列分析

利用3’和5’RACE技术从中国对虾Fenneropenaeus chinensis肝胰腺中克隆了1个血蓝蛋白基因FCHc,FCHc基因cDNA全长为2161bp。其中,开放阅读2 034bp,编码678个氨基酸,预测分子量为77.59 kDa。FCHc序列与凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei血蓝蛋白同源性为82%,与日本囊虾Marsupenaeus japonicas同源性为85%。Real-timePCR实验结果表明,FCHc在肝胰腺中的相对表达量最高,在心脏和表皮中几乎不表达。该基因在鳗弧菌和对虾白斑综合征病毒(WSSV)感染后的对虾肝胰腺中的表达量显著增加,并具有不同的时空表达趋势,提示中国对虾FCHc基因在免疫反应中具有重要作用。     

凡纳滨对虾围食膜蛋白基因全长cDNA的克隆及序列分析

为研究凡纳滨对虾围食膜蛋白在IHHNV感染虾体过程中的作用,实验采用SMART技术构建了凡纳滨对虾肠道组织的全长cDNA文库,电子拼接获得了对虾围食膜蛋白基因全长cDNA序列,并进行了功能分析。全长cDNA文库的库容达1.05×106pfu/mL,重组率为95%。随机挑选1 600个克隆进行测序,去除载体后得到插入长度≥450 bp的有效序列1 531条,根据同源片段长度不小于100 bp,90%同源性的原则对这些序列归并unigene,得到unigene 399条。从所测克隆中得到一个围食膜蛋白基因,其cDNA序列长度为1 002 bp,编码由303个氨基酸组成的蛋白,基因序列比对发现该序列与斑节对虾卵巢围食膜蛋白1和2、围食膜蛋白前体3,短钩对虾围食膜蛋白1、2,以及中国对虾围食膜蛋白编码序列的同源性较高,均达到80%以上。通过半定量RT-PCR对该基因在不同组织的表达分析结果表明该基因在抗感染对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的对虾的心脏和胃中高表达,在肝脏、肠和肌肉中表达较低,在鳃中表达最弱,在眼中不表达;该基因在感染IHHNV病毒的对虾的心脏表达明显减弱,在肝脏、眼、肌肉和鳃中表达较低,在肠道和胃中几乎不表达,说明该基因参与对虾抵御病原体侵入过程。     

中国明对虾caspase2基因克隆及其在抗白斑综合征病毒中的表达分析

采用RACE技术克隆获得中国明对虾caspase2基因cDNA序列全长,并对该序列进行分析。结果显示,中国明对虾caspase2基因全长为1517 bp,开放阅读框长924 bp,5'非编码区长78 bp,3'非编码区长515 bp,命名为FcCasp2。推测该基因编码307个氨基酸,预测分子量为34.21 ku,理论等电点为7.62。同源性和系统进化分析发现,FcCasp2基因与凡纳滨对虾caspase2和斑节对虾caspase的相似性分别为88%和80%,与其他节肢动物caspase家族基因聚为一类。荧光定量RT-PCR结果显示,FcCasp2基因在肝胰腺中的相对表达量最高,在肌肉中表达量最低。WSSV感染后该基因在中国明对虾肌肉、肝胰腺和鳃丝中的表达量有不同的时空表达趋势,表明FcCasp2基因可能参与中国明对虾生物胁迫的应答反应。     

凡纳滨对虾ARMC8基因的克隆及表达

为了研究含Armadillo重复蛋白8在凡纳滨对虾抗病感染过程中所起的免疫作用,本实验采用RACE-PCR技术首次克隆得到凡纳滨对虾ARMC8基因(LvARMC8,Gen Bank注册号:KX058562)的c DNA序列全长,并利用在线软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(Rt-PCR)技术对LvARMC8基因在凡纳滨对虾不同组织及感染白斑综合征病毒和副溶血弧菌过程中的表达变化特征进行分析。结果显示,LvARMC8基因全长为2917bp,其中开放阅读框长2046 bp,编码681个氨基酸,5′非编码区长49 bp,3′非编码区长822 bp。预测分析显示LvARMC8编码的蛋白质含有6个ARM结构域。同源性分析发现,LvARMC8基因与内华达古白蚁ARMC8基因的相似度最高,为71%。系统进化分析结果显示,LvARMC8和多种无脊椎动物ARMC8聚为一支,其中与昆虫类动物赤拟谷盗、致倦库蚊和柑橘凤蝶的亲缘关系最近。Rt-PCR分析发现,LvARMC8基因在凡纳滨对虾多个组织中均能检测出,在表皮中表达量最高,眼柄中表达量最低。WSSV感染后12 h,LvARMC8基因在凡纳滨对虾血液中的表达量显著降低,但48 h后显著升高,72 h达到最高水平。除副溶血弧菌感染后24 h外的时间点,LvARMC8基因在凡纳滨对虾血液中的表达量均显著升高。研究表明,LvARMC8基因可能参与凡纳滨对虾抗病免疫应答途径。     

凡纳滨对虾核自身抗原精子蛋白基因克隆及其表达

利用cDNA末端快速扩增技术克隆出凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)核自身抗原精子蛋白(NASP)基因,NASP基因c DNA全长2258 bp,其中包括92 bp 5′端非编码区,147 bp 3′端非编码区及2019 bp开放阅读区,编码673个氨基酸,预测分子量为74.18 k D。该序列已提交至Gen Bank,序列号为KT274811。在NCBI上进行序列比对后发现,其与斑节对虾(Penaeus monodon)NASP序列相似性最高,为90%。采用荧光定量PCR方法测定了不同发育时期卵巢与肝胰腺中NASP m RNA相对表达水平,结果表明,NASP在卵巢中的表达量高于肝胰腺中的表达量,且在Ⅱ期表达量最高,Ⅲ期表达量最低。此外,通过构建系统进化树比较了凡纳滨对虾NASP与其他物种间的遗传距离。实验结果为进一步研究该基因在凡纳滨对虾卵巢发育中的作用提供了依据。     

湖北地区克氏原螯虾白斑综合征病毒变异区ORF14/15、ORF23/24基因序列比较分析

试验扩增、克隆了在湖北地区采集的19份克氏原螯虾(Procambarus clarkii)白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)阳性样品的变异区ORF14/15和ORF23/24基因,通过测序比较分析了湖北各WSSV毒株与Gen Bank公布的标准毒株间在变异区ORF14/15及ORF23/24基因的差异性。结果显示,19份WSSV阳性样品中有部分样品在变异区扩增出ORF14/15、ORF23/24基因片段,变异区基因序列分析发现,与Gen Bank已公布的标准毒株相比,存在大片段缺失。在变异区ORF14/15,有3个毒株扩增出1 442 bp的片段,4个毒株扩增出630 bp的片段,基于变异区ORF14/15构建的系统进化树显示,这些毒株归属两个不同的分支。在变异区ORF23/24,有2个毒株扩增出大小为2 096 bp的片段,进化分析发现这2个毒株在变异区ORF23/24的遗传距离较近。     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)成纤维细胞生长因子8的cDNA克隆及特征分析

以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为实验对象,利用RACE技术克隆了草鱼成纤维细胞成长因子8(Fibro-blast Growth Factor8,FGF8)cDNA序列。实验结果显示,草鱼FGF8 cDNA序列长度为887 bp,其中5′-非翻译区长100 bp,3′-非翻译区长157 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,编码210个氨基酸的前体蛋白,包含22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。利用已知的FGF8序列绘制系统发育树,发现草鱼与两种鲤科鱼(班马鱼、墨西哥脂鲤)聚为一簇,显示亲缘关系很近,而与其它脊椎动物如两栖类、鸟类、哺乳类的亲缘关系则相对较远,这与形态分类学的结果一致。此外,还通过生物信息学分析,揭示了草鱼FGF8的分子结构特征。     

红螯螯虾冷休克蛋白Y-box编码基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)血细胞中分离到冷休克蛋白Y-box编码基因的cDNA序列。结果显示,冷休克蛋白Y-box编码基因的长度为1 733 bp,其中包括82 bp的5'非翻译区、676 bp的3'非翻译区和975 bp的编码序列,可编码324个氨基酸。理论相对分子质量和等电点分别为35 800和9.81。结构域分析和序列比对显示,红螯螯虾冷休克Y-box蛋白由3部分组成:富含丙氨酸或脯氨酸区域、冷休克结构域和带电荷区域,其中冷休克结构域高度保守。系统进化树分析表明,红螯螯虾冷休克Y-box蛋白与水蚤等节肢动物冷休克Y-box蛋白聚类,且三级结构非常相似。最适温度养殖条件下,冷休克蛋白Y-box的虾组织分布特异性研究表明,红螯螯虾神经组织的冷休克蛋白Y-box转录活性最强,而后依次为肝脏、血淋巴和鳃,在肠和心脏中也有活性,在肌肉组织中转录保持较低水平,揭示神经组织是重要的冷休克Y-box蛋白表达区。     

锦鲤疱疹病毒CJ株ORF27基因克隆及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株（KHV-CJ）ORF27基因编码蛋白的结构特征和进化关系,采用镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF27基因,将其克隆在pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF27基因的结构和功能,并与GenBank上公布的三株KHV构建系统进化树。结果显示：获得207bp的ORF27基因,编码69个氨基酸;预测ORF27编码蛋白的理论分子质量为7366.62Da,等电点为4.487;抗原表位预测显示抗原性良好;编码蛋白存在1个N-糖基化位点、4个O糖基化位点和5个磷酸化位点;系统进化树分析表明与锦鲤疱疹病毒美国株（KHV-U）属同一分支。     

Cloning and characterization of the haemolysin determinants from Aeromonas hydrophila

Abstract. Two haemolysin genes (AHH4 and AHH-2) of Aeromonas hydrophila ATCC7966 were cloned into a plasmid vector in Escherichia coli K-12. An open reading frame (ORF) of the AHH-1 haemolysin gene was 1734 base pairs (bp). and corresponded to a protein of 577 amino acid residues. Analysis of the deduced amino sequence indicated a highly hydrophobic N-terminal region which had the characteristics of a leader peptide. The sequence also included the -10 region and the -35 region of a promoter, and a ribosome- binding site upstream from the ORF. The termination site was located downstream from the ORF. The haemolysin was a thermolabile protein with the predicted molecular mass of 60 kDa. The AHH-1 gene is distributed in various A. hydrophila and A. salmonicida strains. The nucleotide sequence of a 981 bp ORF of the AHH-2 gene was encoded with the predicted molecular mass of 377 kDa polypeptides. The homology of the nucleotide sequence was very low between the AHH-1 and AHH-2 genes, and also with the aerolysin gene cloned by Howard & Buckley (19S6). No leader peptide was found in the N-terminal region of the ORF of the AHH2 gene. The AHH-2 gene was detected in the original strain ATCC7966, but was not detected in other tested strains of A. hydrophila and A. salmonicida.     

达氏鲟gdf11基因cDNA的克隆及组织表达特征分析

本研究克隆了达氏鲟(Acipenser dabryanus)生长转化因子gdf11(growth differentiation factor 11)基因cDNA。达氏鲟gdf11基因cDNA序列全长1 298 bp(不包括Poly A),开放阅读框为1 191 bp,编码396个氨基酸,5非编码区长19 bp;3非编码区长88 bp。通过Signal P软件预测含有N端21aa的信号肽。组织表达特征分析结果显示,gdf11在7种组织中均有表达,在眼和鳃中的表达量较高;不同水流条件下,鳃和心脏gdf11的表达量有显著性差异,静水中鳃gdf11表达量是流水(流速27.0±3.0 cm/s)的4.70倍,而心脏中的表达量是流水的2.72倍。这暗示了gdf11可能在呼吸代谢中发挥功能。     

仿刺参纤维胶凝蛋白基因的分子特征及表达分析

纤维胶凝蛋白是非特异性免疫系统中的重要分子。通过转录组测序及cDNA末端快速克隆技术得到一条仿刺参纤维胶凝蛋白基因的全长cDNA序列,并将其编码的蛋白命名为仿刺参纤维胶凝蛋白-1。获得的基因cDNA全长为1951bp,其中5′-末端非翻译区为397bp,3′-末端非翻译区为666bp,开放阅读框为888bp,编码295个氨基酸,N端16个氨基酸为信号肽,信号肽后面有两个G-X-Y重复序列,C端为纤维蛋白素原结构域。采用实时荧光定量PCR方法分析了仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参幼参不同组织及细菌脂多糖刺激后的时序表达规律,结果显示仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参的肠道、呼吸树、体腔细胞和体壁均有表达,且肠道的表达量最高;脂多糖刺激后,4种组织的仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因表达量均有变化,且以肠道和体壁表达量的变化最为显著;此外,仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参4种组织中的表达量变化具有不同的时序性,表明仿刺参纤维胶凝蛋白-1可能在仿刺参免疫应答中起重要作用。     

剑尾鱼IgZ基因的克隆及疫苗免疫对其在组织中表达的影响

为研究剑尾鱼Ig Z基因序列及其在疫苗免疫后的表达规律,本实验根据已知的EST库设计引物,利用RT-PCR等方法,获得剑尾鱼Ig Z基因c DNA全长序列,并进行生物信息学分析和疫苗免疫后组织表达分析。结果显示,剑尾鱼Ig Z基因全长序列为5 420 bp,包含4个外显子和3个内含子;c DNA序列全长1 527 bp,包含一个1 299 bp的完整ORF框,该基因编码432个氨基酸,预测其编码蛋白的分子量大小为47.48 ku,并具有Ig Z的基本结构,与其他硬骨鱼类Ig Z氨基酸序列一致性为28%~54%。荧光定量PCR分析结果显示,Ig Z基因主要在剑尾鱼的头肾、脾脏和肠中分布,且疫苗免疫后11天内,Ig Z基因在头肾、脾脏和肠组织中均表现为先上升后下降的趋势。头肾中Ig Z基因的表达量在第4天时最高,为对照组的2.12倍;脾脏中Ig Z基因在第4天时呈现最高峰,为对照组的4.65倍;肠组织中Ig Z基因的表达量在12 h时有一个小高峰,第2天时最高,为对照组的11.41倍。本研究获得了剑尾鱼Ig Z基因c DNA全长序列,并对其表达规律进行了初步研究,发现Ig Z在肠道黏膜免疫中具有重要作用,这将为进一步验证其在黏膜免疫中的作用以及剑尾鱼作为疾病研究模式动物和疫苗免疫评价模型奠定基础。     

大口黑鲈溃疡综合征病毒MCP基因序列分析及PCR快速检测方法的建立

为了早期快速诊断近年来流行于广东省养殖大口黑鲈(Micropterussalmoides)中的病毒性溃疡综合征,本研究用基因组步移的方法获得了大口黑鲈溃疡综合征病毒(Largemouthbassulcerativesyndromevirus,LBUSV)主要衣壳蛋白(MCP)基因,该基因编码区全长1392bp。通过序列比较分析,在MCP基因内确定了一段241bp的特异性较强的片段作为靶序列,设计并合成引物,经过优化PCR反应条件,建立了可以快速检测大口黑鲈溃疡综合征病毒的PCR方法。实验表明,在PCR进行到30个循环反应时可以检测到的质粒最小浓度是104拷贝数/μL,相当于104个病毒粒子。利用该方法,从天然感染LBUSV的大口黑鲈脾脏组织DNA可扩增出241bp的片段,而健康大口黑鲈和感染了传染性脾肾坏死病毒样病毒的大口黑鲈脾脏组织则没有扩增条带。本研究建立的PCR检测方法具有检测快速、成本低、准确性高的特点,适用于大范围早期病害诊断的推广应用。