利用CRISPR/Cas9技术高效创制长粒香型水稻

【目的】CRISPR/Cas9基因编辑技术已成为水稻分子育种的重要手段。为了促进水稻育种的发展,本研究以非香型粳稻品种龙粳11为试验材料,对GS3、GS9和Badh2基因进行编辑,以期获得能稳定遗传的长粒香水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9技术,以GS3、GS9和Badh2为靶基因,构建敲除载体pYLCRISPR/Cas9-GS3/ GS9/Badh2-gRNA,通过农杆菌介导法,在龙粳11的GS3、GS9和Badh2基因中引入了特定的突变。【结果】T₂代无转基因的gs3/gs9/badh2纯合突变体与野生型龙粳11相比,粒长增加26.43%~27.01%,单株产量增加10.82%~12.11%,千粒重增加18.34%~41.36%,稻米变香,高效地将圆粒水稻变成长粒香型水稻。【结论】利用CRISPR/Cas9技术获得能够稳定遗传并具有长粒香品质的纯合突变株系,为组合多个品质性状提供了一种方便有效的方法,从育种角度加快了新品系创制过程。     

OsLOX10正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性

【目的】由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病和由水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白叶枯病严重影响水稻的产量和品质。创制转OsLOX10基因水稻材料，进行稻瘟菌和白叶枯菌的抗病性分析，有助于揭示其调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性机制。【方法】采用CRISPR/Cas9系统构建OsLOX10的敲除载体，利用限制性内切酶XcmⅠ线性化pCXUN-HA，TA连接构建OsLOX10的过表达载体，遗传转化获得OsLOX10转基因水稻，筛选过表达株系和纯合敲除株系进行真菌和细菌的抗病性分析。在稻瘟菌（Guy11）侵染水稻后，对水杨酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）途径的标志基因进行qRT-PCR分析;在几丁质（chitin）和flg22诱导下，观测水稻活性氧（reactive oxygen species，ROS）的暴发情况。【结果】 qRT-PCR分析表明，接种稻瘟菌和白叶枯菌24 h后，OsLOX10表达量上调;OsLOX10的纯合敲除和过表达水稻转基因株系接种稻瘟病菌Guy11孢子悬浮液，与野生型（日本晴）相比，OsLOX10敲除株系更易感病，过表达株系则无典型的病斑症状;接种 6、12、24和36 h时，3个病程相关蛋白基因OsPBZ1、OsPR1a、OsPR1b和SA通路基因OsPAL1，以及JA合成通路上的2个基因OsAOS2、OsLOX5的转录水平在敲除转基因株系中显著下调，而在过表达转基因株系中显著上调。对转OsLOX10基因水稻接种白叶枯菌（PXO99A），发现敲除OsLOX10的转基因水稻对白叶枯菌更易感病。qRT-PCR分析OsPR1b和OsPAL1以及JA合成通路上的3个基因OsAOS2、OsAOC和OsJAZ在OsLOX10过表达基因水稻中表达量明显上调，而在敲除OsLOX10的转基因水稻中却保持在较低水平，在接种7 d后表现出显著性差异。在几丁质和flg22诱导下，OsLOX10敲除株系的ROS水平显著性降低，而且在几丁质诱导下，ROS的起峰时间推迟。【结论】稻瘟病菌和白叶枯病菌能够诱导OsLOX10的表达，OsLOX10通过病原菌分子模式触发的免疫途径（PTI）参与抗病反应，其在水稻抵御稻瘟病和白叶枯病中起着正调控作用。同时，OsLOX10可能通过调节SA和JA介导的信号通路来正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性。     

水稻特大粒种质BG1和优质恢复系华占的粒形基因研究及相关功能标记开发

【目的】特异种质资源的发掘与利用是水稻优质高产育种的重要手段之一。明确特大籽粒种质BG1（Big Grain 1）和育种上广泛配组的优质恢复系华占携带的部分粒形基因等位变异类型,并开发相应基因的功能标记,有助于加快粒形基因的育种应用,提高水稻粒形精准改良的效率。【方法】对BG1和华占中的9个主效粒形基因（GS3、qLGY3、qGL3、GW2、GW8、GW5、TGW3、TGW6、GS9）的目的片段进行测序分析。并根据GW2、GS3、qGL3、TGW3、TGW6、qLGY3、GW8和GW5的测序结果,开发了鉴定其基因分型的功能标记。【结果】与日本晴相比,特大粒种质BG1在检测的9个主效粒形基因中有5个表现为功能缺失型（gs3、GW8、gw2、tgw3、tgw6）,1个稀有等位变异（qgl3）和1个外显子可变剪切型（qlgy3）;与日本晴相比,华占在检测的9个主效粒形基因中有3个（gs3、GW8、GW5）存在差异。根据测序结果开发了GW2、GS3、qGL3、TGW3、TGW6、qLGY3、GW8和GW5的功能标记,并利用15个水稻种质进行检测,检测结果中除了TGW6 的标记TGW6-Del 仅可用于鉴定是否含有功能缺失型的等位变异tgw6外,另外7个标记均为可准确鉴定基因型。【结论】与日本晴相比,特大粒种质BG1中调控粒长的基因gs3、qgl3、qlgy3、tgw3、GW8和tgw6之间可能存在复杂的互作调控通路,而不是简单的效应累加,粒宽特征可能是gw2、GW8的累加效应。优质恢复系华占的细长粒形可能是gs3、GW5和 GW8的互作效应所致。本研究中开发的功能标记可以用于水稻分子标记辅助育种。     

分子标记辅助选择改良C418对红莲型粳稻不育系的恢复力

【目的】高效选育红莲型(Honglian,HL)粳稻恢复系有助于HL型杂交粳稻育种,对促进三系杂交粳稻的发展具有重要的意义。【方法】Rf6是一个HL型恢复基因,来源于HL型籼稻强恢复系9311。前期研究中,在以9311为供体、日本晴为受体的一套染色体片段代换系中鉴定出携带Rf6的株系R1093。本研究利用R1093与BT型粳稻恢复系C418(携带Rf1)杂交,通过常规回交育种结合分子标记辅助选择技术,将Rf6导入C418中,进行Rf6与Rf1聚合育种;利用BT型、HL型六千辛A进行测交鉴定改良系的恢复力。【结果】共获得12个BC₃F₄株系和55个BC₄F₃株系,其中6个改良系的农艺性状已基本接近C418;测交鉴定结果表明聚合Rf6的改良系对HL型粳稻不育系的恢复度达到85%以上,可应用于水稻生产;对BT型粳稻不育系的恢复度提升效果不显著。【结论】聚合Rf6能有效改良BT型粳稻恢复系对HL型粳稻不育系恢复力,是选育HL型粳稻恢复系的一条重要途径。     

水稻粒重粒形QTL的定位及qTGW1.2/qGL1.2的验证

【目的】粒重粒形对水稻的产量和品质均有重要的影响。本研究通过开展水稻粒重粒形QTL的初步定位,并对新鉴定的第1染色体长臂qTGW1.2/qGL1.2区间进行验证,旨在进一步揭示水稻粒重粒形的遗传调控机制。【方法】以大粒的FM9为父本,小粒的EFT为母本,配组衍生遗传群体,先后获得包含277个株系的F_2:3群体和211个株系的重组自交系群体（Recombinant Inbred Lines, RILs）,测定千粒重、粒长和粒宽,采用完备区间作图法进行QTL初定位;针对新鉴定的qTGW1.2/qGL1.2区间,筛选2个剩余杂合体单株,自交衍生分离群体,开展QTL效应验证。【结果】初定位分析共检测到35个调控千粒重、粒长和粒宽的QTL,其中,11个能同时在两个群体中被检测到,18个仅在F_2:3群体中被检测到,6个仅在RIL群体中被检测到;应用两个剩余杂合体衍生的两套分离群体验证了新鉴定的qTGW1.2/qGL1.2区间对千粒重和粒长的效应,并观察到颖壳细胞长度的显著变化。通过qPCR分析,观察到与细胞周期、生长素代谢和粒形相关基因表达发生了显著变化。【结论】初步定位的35个QTL以及验证的qTGW1.2/qGL1.2有利于进一步揭示水稻粒重粒形的遗传控制基础,也为后续的基因克隆及分子标记辅助选择奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9技术创制抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系

【目的】创制新型抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系，为高产优质杂交水稻选育提供资源。【方法】利用CRISPP/Cas9技术在水稻稻瘟病基因Pi21、温敏不育基因TMS5和香味基因Badh2的第1外显子处设计靶位点，构建多基因表达载体pC1300-2×35S::g^TMS5-g^Badh2-g^Pi21，转化优质常规籼稻品种中早70，测序鉴定分析获得纯合阳性稳定株系。利用稻瘟病喷雾接种和打孔接种方法对稻瘟病基因Pi21的纯合突变株系进行稻瘟病抗性鉴定，利用GC-MS技术对Badh2纯合突变株系的香味物质2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量进行测定。【结果】在T₀转基因株系中，Pi21、TMS5和Badh2突变频率分别为87.5%、80.0%和87.5%，突变类型多为双等位突变。从T₁代中筛选不含载体骨架的纯合突变株系，获得两种三突变纯合株系。稻瘟病接种结果表明，与野生型相比，T₂代Pi21纯合变异株系的抗性显著提高。同时，接种后纯合突变体株系内相关防卫基因的表达量显著上调，ROS积累量也显著增加。tms5纯合变异株系表现出典型的温敏不育特性，TMS5基因的表达水平与野生型相比显著降低，高温下Ub_L404基因的表达水平明显高于野生型。与野生型相比，在Badh2纯合突变体植株中Badh2的表达水平显著下调，并且香味物质2-AP含量极显著增加。【结论】利用CRISPR/Cas9技术成功对Pi21、TMS5和Badh2基因同时进行定向编辑，获得了具有高抗稻瘟病的香型温敏不育系，为高抗、香型不育系材料的选育提供参考，加快高产优质杂交水稻的选育。     

水稻粒宽突变体gw4的鉴定与基因定位

【目的】水稻粒形是影响水稻产量和决定稻米外观品质的主要性状之一。筛选和鉴定新的粒形突变材料,可为研究水稻籽粒发育的调控机制奠定基础。【方法】粳稻品种中花11经1%的EMS处理,在诱变群体中获得一份窄粒突变体gw4(grain width on chromosome 4);分析粒形和其他主要农艺性状,在扫描电镜下观察颖壳细胞变化;利用突变体与籼稻品种台中本地1号配组的F₂分离群体,选择隐性个体完成基因的精细定位;开展生物信息和测序分析,确定定位区间的候选基因;采用RT-PCR分析该基因在根、茎、叶、鞘、穗等组织中的表达模式及其他粒形相关基因的表达水平。【结果】与野生型相比,除了表现窄粒外,gw4的粒长、千粒重、每穗粒数、一次枝梗数和二次枝梗数等显著下降;扫描电镜发现gw4的颖壳内外表皮细胞均小于野生型;遗传分析表明该窄粒表型受一对单隐性核基因控制;通过开发的新标记最终将该基因定位在第4染色体BS6与EX49两个标记之间约31.74 kb的范围内;测序结果发现在LOC_Os04g01590基因编码区发生了一个由G至A的单碱基突变,导致原来编码的甘氨酸变成了天冬氨酸;qRT-PCR结果表明,LOC_Os04g01590主要在幼穗中表达,且在突变体中表达显著下降。【结论】GW4主要调控水稻粒宽的发育,预测LOC_Os04g01590为其候选基因。这为进一步丰富粒形的遗传调控网络打下了基础。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑粒长基因GS3改善粳稻花时

【目的】花时不遇是影响杂交水稻制种产量的直接因素之一,已有研究表明水稻粒型差异对花时有影响。本研究采用GS3功能缺失突变来研究粳稻花时差异,以期为粒型影响花时提供佐证。【方法】利用CRISPR/Cas9技术来定向编辑控制粒长基因GS3,获得13对粒型差异的近等基因系粳稻,小区种植,采用目测法来调查花时。【结果】获得转基因T₀植株并对其T₁植株测序分析,发现长白25、吉粳102、浙粳88、武运粳27和J42均发生单碱基插入移码突变,垦鉴稻6号、空育131、浙粳22、扬粳4227、南粳9108、J5933、J6167和J5938均发生部分碱基缺失突变。对T₁植株粒型考查表明,gs3突变体的粒长均显著长于野生型。对稳定的后代花时统计分析发现,粒型变长的突变体均比野生型花时有所提前,且吉粳102、空育131、浙粳88、武运粳27、扬粳4227这5个材料的gs3突变体花时均显著早于野生型,其余材料开花也提早,但不显著。【结论】长粒型粳稻GS3突变体的花时早于短粒粳稻野生型,这一研究可为粳稻粒型育种提供参考,加速长粒粳稻亲本选育,有望推动杂交粳稻发展。     

水稻回交群体剑叶性状综合评价及QTL定位

【目的】通过对水稻剑叶性状的综合评价,明确剑叶相关性状间及与6个农艺性状的关系。检测剑叶相关性状的QTL,为优良株型品种选育,剑叶性状基因的精细定位和克隆奠定基础。【方法】以日本优质粳稻品种越光和葡萄牙粳稻地方种Bertone构建的回交群体两个世代为实验材料,利用BC₃F₁群体基因型构建遗传连锁图谱;测定亲本和BC₃F₂群体各株系剑叶SPAD、剑叶长、剑叶宽,计算剑叶长宽比、剑叶面积;利用隶属函数和标准差系数赋予权重法获得剑叶性状综合评价值(D值),分析其与6个农艺性状间的关系。分别利用单标记分析(SPA)和区间作图(IM)检测水稻剑叶相关性状QTL。【结果】在抽穗灌浆期,两亲本剑叶SPAD值呈现先升高后降低的动态变化。BC₃F₂群体的5个剑叶相关性状变异丰富,总体表现趋向轮回亲本越光。4个剑叶形态性状间相关性均达到极显著水平,与剑叶SPAD的相关性不显著。主成分和逐步线性回归分析表明剑叶宽、剑叶SPAD、剑叶长、剑叶面积是影响剑叶综合评价值(D值)的主要因子。高D值株系的株高、穗长、茎基粗和单株产量均极显著高于低D值株系,两者的分蘖数和有效穗数差异不显著。共检测到18个控制剑叶性状的QTL,分布在水稻第1、4、7和8染色体上,贡献率分布范围为4.00%~28.00%(SPA)和3.41%~27.00%(IM),除qFLSPAD1之外的17个QTL增效基因均来自Bertone。在第8染色体上的RM22720-RM404区间发现1个QTL簇,含6个主效QTL,分别为qFLL8.1、qFLL8.2、qFLA8.1、qFLA8.2、qD8.1和qD8.2。【结论】获得了剑叶宽、剑叶SPAD、剑叶长和剑叶面积4个评价剑叶性状的关键指标;明确了剑叶性状与单株产量之间的正相关关系;检测到18个剑叶相关性状QTL,位于第8染色体RM22720-RM404区间的QTL簇,是影响剑叶性状的1个重要染色体区域。     

江苏近年育成粳稻新品种/系的稻瘟病抗性基因及穗颈瘟抗性分析

【目的】明确水稻品种携带的抗稻瘟病基育种应用价值,是利用抗病基因培育抗病品种控制病害流行的重要前期工作。【方法】利用功能标记分析了14个抗稻瘟病基因在江苏近年育成的195个粳稻新品种/系中的分布情况,并对其中158个品种和17份携带抗稻瘟病基因Pigm的高世代回交株系进行穗颈瘟接种鉴定。【结果】大多数品种携带2~5个抗病基因,但所有品种均不含有Pigm基因;Pib、Pita和Pikh基因在供试品种中的分布频率较高,均在45%以上,其余基因均在30%以内;Pid3、Pid2、Pia、Pb1在新育成品种中的出现频率明显高于审定品种。测试品种对穗颈瘟的抗性主要与3个基因显著相关,贡献率由高至低依次为Pia、Pi3/5/i和Pita;其中,Pia或Pi3/5/i与Pita间的聚合效应均显著高于各基因单独存在时的抗病效应,且以Pia和Pita间的聚合效应最强,携带该基因组合的所有品种对穗颈瘟均表现抗至高抗水平抗性。回交导入Pigm基因的所有17份株系对穗颈瘟的抗性均显著高于各自轮回亲本,且均达到了抗病以上水平。【结论】抗病基因Pigm及基因组合“Pia+Pita”在江苏粳稻抗穗颈瘟育种中具有重要的育种应用价值。     

利用分子标记辅助选择培育优良食味、低谷蛋白香粳稻新品系

【目的】选育低谷蛋白新品种是功能性水稻育种的一个重要方向。为满足肾脏病患者对人体健康和稻米品质的需求,迫切需要在育种中加强对功能性和食味品质的协同改良。【方法】以具有低直链淀粉含量基因Wx^mp和香味基因fgr的优良食味粳稻品种南粳46与含低谷蛋白基因Lgc1的日本粳稻品种LGC-1杂交、回交,利用与目标基因共分离的分子标记进行跟踪检测并结合田间选择,在BC₂F₆获得5个新品系。以亲本南粳46和LGC-1为对照,对新品系的农艺、产量、品质性状进行分析。【结果】与LGC-1相比,新品系的谷蛋白含量和可吸收蛋白含量相当,食味品质得到显著提升,且综合性状优良,表现出较高的产量潜力,适宜在江苏不同稻区进行种植。【结论】分子标记辅助选择作为一种快速、准确、有效的方法,与常规育种技术紧密结合,能够显著提高优质、高产、低谷蛋白水稻品种的选育效率。     

应用CRISPR/Cas9技术与分子标记辅助选择创制广东丝苗米新种质

【目的】创制优质香型丝苗米水稻新种质，探索水稻育种改良新途径，助力广东丝苗米品牌建设。【方法】以广东省农业主导品种粤农丝苗(YNSM)与优质稻粤王丝苗(YWSM)为材料，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点编辑上述品种的香味基因Badh2，创制香稻新品系，随后通过分子标记辅助选择(MAS)技术定向导入GW7/GL7位点，系谱选育优质香型丝苗米水稻新种质。【结果】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功创制两个香稻新品系yn-ko^badh2与yw-ko^badh2，其2-AP含量均极显著提高，达到239.39～440.79μg/kg，而有效穗数、每穗实粒数、糙米外观品质、千粒重与产量等主要农艺性状均未受到显著影响；MAS技术结合系谱选育的方法成功选育两个丰产性好、籽粒长宽比超过4.3的优质香型丝苗米水稻新品系NW^badh2GW7-1与NW^badh2GW7-2，达到广东丝苗米品种关于香味与外观粒型的认定标准。【结论】利用CRISPR/Cas9基因编辑与分子辅助选择技术相结合可精准、高效地创制新的优...     

敲除OsNramp5基因创制低镉优质粳稻新材料的应用评价

【目的】探究在粳稻中敲除Os Nramp5基因对镉等金属元素积累、产量和品质的影响,为科学高效地生产优质健康粳米提供新材料和理论参考。【方法】利用CRISPR/Cas9技术,在优良食味高产粳稻品种南粳46背景下对OsNramp5进行基因敲除,结合标记辅助选择,获得了无外源基因的Os Nramp5敲除突变系,考查其产量和品质性状变化特征,以及在不同镉含量土壤中和锌肥、硒肥喷施后的籽粒镉、锰、硒等七种金属元素的含量变化。【结果】在T0代获得了5种OsNramp5不同变异类型的转基因植株,设计开发了其中3种突变型的特异分子标记,进而结合标记辅助选择,在各植株的T2代中获得不含潮霉素选择标记基因和CAS9蛋白基因的纯合敲除系。与野生型相比,无论在高浓度还是低浓度镉含量土壤中,敲除系整株包括籽粒中的镉含量和地上部组织中锰含量均显著低于南粳46;敲除系的株高略微下降,穗粒数显著降低并导致其单株产量明显下降,但在低分蘖肥处理中产量下降未达显著。敲除系稻米外观总体好于对照,蛋白质和直链淀粉含量明显高于对照,导致其食味值明显降低。敲除系籽粒中铜、锰和硒的含量显著低于对照,但在施用锌肥和硒肥后可以显著提高...     

聚合Stv-bi和Wx-mq基因改良武育粳3号条纹叶枯病抗性和食味品质

以日本优质粳稻关东194为条纹叶枯病抗性基因Stv-bⁱ和低直链淀粉含量基因Wx-mq的供体, 采用回交育种的策略, 改良武育粳3号的抗性和食味品质。在连续回交和自交的过程中, 利用与Stv-bⁱ和Wx-mq基因相关的分子标记进行跟踪检测, 并结合条纹叶枯病的田间抗性鉴定以及农艺性状的系统选择, 在BC₃F₄世代中筛选到10个具有Stv-bⁱStv-bⁱWx-mqWx-mq纯合基因型的改良系。性状分析表明, 这些品系保留了受体亲本武育粳3号农艺性状, 条纹叶枯病抗性得到明显改良, 同时,食味、外观品质也大幅提升。综合分析, 最终筛选出K01和K04两个优异品系。