换锦花LsMYB4基因的克隆与表达分析

以换锦花（Lycoris sprengeri）为材料,采用RT-PCR方法和RACE技术相结合的方法,从花瓣中克隆了MYB基因的cDNA全长序列,命名为LsMYB4。该序列全长793 bp,包含606 bp完整开放阅读框,编码201个氨基酸,具有明显的R2R3-MYB结构域,与中国水仙NtMYB相似性达96%。实时荧光定量PCR分析结果表明,LsMYB4在换锦花不同组织和不同花期均有表达,其中在花瓣中的相对表达量比叶中多9 ~ 10倍,在盛花期的相对表达量比花苞期多20倍。不同花色无性系花瓣中表达量存在差异,花色较浅的无性系高于其它无性系,推测LsMYB4在调控换锦花花色形成的过程中起着负调控作用。     

R2R3-MYB转录因子CitMYB21对柑橘类黄酮生物合成的影响

以‘巴西酸橙’（Citrus aurantium L.）、‘本地早橘’（C. reticulata Blanco）、‘桂花蒂南丰蜜橘’（C. reticulata Blanco）、‘北碚447锦橙’[C. sinensis(L.)Osbeck]等30份柑橘种质为试材，挖掘与柑橘类黄酮生物合成相关的R2R3-MYB转录因子。通过比较转录组分析发现ERF、MYB以及Dof转录因子家族与果实发育过程中类黄酮的代谢密切相关，其中两个R2R3-MYB转录因子基因CitMYB21(Ciclev10021699m)和CitMYB33(Ciclev10012152m)的表达水平与类黄酮生物合成途径中的关键结构基因CitCHS2的表达量明显负相关。系统发育分析显示，这两个基因分别属于R2R3-MYB中的第2和第1亚族。从‘北碚447锦橙’中克隆得到了CitMYB21编码区的全长序列，共804 bp，编码267个氨基酸。CitMYB21的表达有显著的组织特异性及明显的种质特异性，并与类黄酮的含量呈显著负相关。CitMYB21沉默的柑橘植株叶片中类黄酮含量显著增加，而瞬时过表达的果皮中类黄酮的含量明显降低。...     

欧洲葡萄VvMYB6正向调控花青素合成

从欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’中克隆到1个MYB转录因子基因VvMYB6。VvMYB6蛋白定位在细胞核,其N端包含1个保守的R2R3结构域。在葡萄中,VvMYB6主要在在根、花器官及果实发育早期表达。在烟草中异位表达VvMYB6,显著促进花瓣和雄蕊中花青素的积累;代谢组分析发现,相比野生型,转基因植株花中累积高含量的飞燕草色素和矢车菊色素。转基因烟草植株中查尔酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮4–还原酶(DFR)、花青素合酶(ANS)和UDP葡萄糖–类黄酮–O–葡萄糖基转移酶(UFGT)基因表达显著上调。结果表明VvMYB6正向调控花青素合成。     

刺葡萄R2R3-MYB转录因子VdMYB14调控类黄酮合成功能解析

【目的】类黄酮作为葡萄果实中一类重要次生代谢物质,进一步研究其合成调控机制对于提高果实品质具有重要意义。【方法】结合前期研究基础,以会同黑果刺葡萄(Vitis davidii‘1338’)为试材,通过qRT-PCR分析VdMYB14在6个果实不同发育阶段果皮中的表达水平变化。利用MEGA软件构建系统发育树,分析VdMYB14蛋白与其他类黄酮相关MYB蛋白的系统发育关系。利用亚细胞定位技术分析VdMYB14在细胞中的位置。在烟草中异源表达VdMYB14基因,验证其对类黄酮合成的调控功能。【结果】VdMYB14蛋白与苹果花色苷合成负调控因子MdMYB111同源度较高,亚细胞定位发现VdMYB14定位在细胞核中。与野生型相比,VdMYB14转基因烟草株系的花中原花色素含量增加,花色苷积累减少。过表达VdMYB14烟草花中,原花色素合成关键基因NtLAR和NtANR的表达量显著上调,而花色苷合成关键基因NtUFGT的表达量显著下调。【结论】VdMYB14基因能够促进原花色素合成途径关键基因的表达,抑制花色苷合成关键基因的表达,导致类黄酮前体物质倾向于原花色素合成途径,从而抑制花色苷合成,促进原花色素积累。     

利用VIGS技术研究草莓FaMYB5的功能

以‘丰香’草莓(Fragaria×ananassa‘Toyonaka’)为材料,采用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced Gene Silencing,VIGS)对果实中类黄酮化合物代谢相关转录因子基因FaMYB5进行沉默,并对沉默后果实类黄酮化合物代谢途径相关的结构基因和其他转录因子基因表达量进行半定量RT-PCR及RT-qPCR分析。并分别采用HPLC和香草醛—硫酸比色法对沉默后果实中花青素苷和原花青素含量进行测定。成功构建了pTRV2-FaMYB5的VIGS沉默载体,并建立了草莓果实VIGS沉默体系,FaMYB5基因沉默效率达60%;FaMYB5基因沉默处理与阴性对照相比,草莓类黄酮化合物代谢途径相关结构基因和转录因子表达量均发生改变,其中FaMYB9、FaLAR、FaDFR、FaANR表达量显著增加,从而导致果实中原花青素含量增加;而花青素合成相关基因FaANS的表达量减少1/2,FaMYB10表达量变化并不显著。此外,bHLH家族的转录因子基因FabHLH3和FabHLH3Δ随着FaMYB5的沉默表达量显著下降,而FaGL3显著升高。结果进一步证明FaMYB5转录因子对草莓类黄酮化合物代谢途径中的原花青素合成途径起负调控作用。     

‘秋姬李’PsMYB18基因克隆与功能分析

【目的】克隆在采后‘秋姬李’果皮积累花色苷过程中高表达的MYB抑制因子PsMYB18基因,研究其序列特征、表达特点与功能。【方法】以‘秋姬李’为试材,采用qRT-PCR分析不同温度和光照处理条件下‘秋姬李’果皮中PsMYB18基因的转录水平,采用RT-PCR克隆PsMYB18基因,并通过烟草叶片瞬时表达试验分析PsMYB18的功能。【结果】q RT-PCR分析表明20℃和光照处理可促进‘秋姬李’果皮PsMYB18基因表达。PsMYB18基因的开放阅读框(ORF)为702 bp,编码233个氨基酸的蛋白。进化树分析表明PsMYB18与其他植物的花色苷合成抑制因子亲缘关系较近。序列比对结果表明其具有保守的R2R3结构域和抑制基序C1和C2。烟草瞬时表达试验表明,PsMYB18可抑制正调控因子PsMYB10.1和PsbHLH3的花色苷合成诱导功能。【结论】‘秋姬李’PsMYB18为花色苷合成抑制因子。     

鹤望兰八氢番茄红素脱氢酶基因SrPDS 的克隆及表达分析

 采用RT-PCR和RACE方法从鹤望兰黄色花萼中克隆到类胡萝卜素合成途径关键基因SrPDS, 该 cDNA 全长2 069 bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1 746 个碱基,编码581 个氨基酸。氨基酸 同源性分析表明,SrPDS 推导的氨基酸序列与已报道的其他植物的PDS 蛋白具有很高的同源性。系统进 化树分析显示,鹤望兰SrPDS 与番红花首先聚为一类,其次与百合、水仙PDS 蛋白亲缘关系较近。应用 半定量PCR 分析表明,SrPDS 在黄色花萼和叶片中高表达,在蓝色花瓣和根中低表达;且在花发育的始 花期表达量最高,表明该基因在黄色花萼发育过程中起着重要作用。     

‘云香’水仙ACC氧化酶基因克隆及遗传转化

以‘云香’水仙花瓣为试验材料,采用RT-PCR技术克隆出乙烯生物合成途径中的关键酶ACC氧化酶(ACO)基因的全长序列1 162 bp,命名为NtACO1(GenBank登录号为KX082935)。其开放阅读框(ORF)长度为939 bp,编码312个氨基酸。NtACO1蛋白包括ACO家族保守的DIOX_N和20G-FeⅡ_Oxy结构域。分子进化树分析表明,NtACO1蛋白与‘金盏银台’水仙亲缘关系最近。通过qRT-PCR检测NtACO1在‘云香’水仙花朵开放过程中的表达模式,结果表明,NtACO1在花瓣和副冠中的表达量随着花朵发育衰老而逐渐上升,并且各个时期花瓣中的表达量都高于副冠,推测NtACO1可能参与了‘云香’花的发育和衰老。构建了NtACO1的正、反义植物表达载体,并以烟草叶片为外植体,通过根癌农杆菌介导的遗传转化体系,获得NtACO1过表达转基因植株。转基因烟草与野生型相比缩短了营养生长期,开花较早,叶片较少。该研究为进一步探究水仙花ACO基因功能,以及延长水仙花花期的分子育种奠定了试验基础。     

百香果（Passiflora edulis）R2R3-MYB基因家族的结构和功能分析

【目的】探究R2R3-MYB转录因子在代谢、发育等多种生物学过程中发挥的调控作用。对百香果R2R3-MYB基因家族进行表达分析并探究其在花果发育过程中的调控机制,对深入研究R2R3-MYB转录因子在百香果中的生物学作用中具有重要意义。【方法】基于百香果全基因组数据,通过HMM搜索对R2R3-MYB家族成员进行筛选鉴定,并利用实时荧光定量PCR分析其在百香果花不同组织中的表达模式。【结果】从百香果基因组中鉴定出99个R2R3-MYB基因,根据系统进化分析将其分为36个亚组。99个R2R3-PeMYB基因随机分布在9条百香果染色体上。基序和基因结构分析表明,R2R3-PeMYB在同一亚组中具有相对保守的结构特征。共线性分析表明,片段复制事件促进了百香果R2R3-MYB家族的扩张。基于转录组数据和qRT-PCR分析,发现R2R3-PeMYB基因在百香果花的不同组织的不同发育阶段中表现出差异的表达模式,说明R2R3-PeMYB基因在花不同组织和果实的发育过程中发挥重要作用,尤其是PeMYB62和PeMYB63在百香果果皮转色期的高表达,说明其可能参与百香果花青素的合成。同时8个R2R3-PeM...     

百子莲MYB家族鉴定及蓝色形成关键基因功能分析

利用生物信息鉴定百子莲MYB家族成员，挖掘并验证了调控百子莲蓝色花色形成的关键基因。以全长转录组测序数据作为参考序列，鉴定得到百子莲123个MYB家族成员，包括60个R2R3-MYB、4个3R-MYB、2个4R-MYB和57个1R-MYB基因。对调控类黄酮生物合成的主要亚家族R2R3-MYB进行分析发现，R2-和R3-repeats的序列较为保守，根据系统进化关系分为22个亚组（A1～A22）。特殊的是，相较拟南芥的25个亚组，百子莲缺乏正向调控花色素苷合成的典型亚组S6。与花色形成相关的其他亚组有A18、A17和A16，其成员ApMYB4、ApMYB6、ApMYB7、ApMYB12和ApMYB111定位于细胞核，ApMYB123集中分布于核仁中。在蓝色百子莲花瓣着色过程中，ApMYB12显著上调表达，而ApMYB111显著下调表达。ApMYB4、ApMYB6和ApMYB7在蓝花各发育阶段的表达量均低于白花，预示这些基因可能是百子莲蓝色形成的负调控因子。ApMYB123在白花的开放前期大量表达，说明该基因可能在此阶段促进花瓣合成原花青素。在烟草中过表达ApMYB12，烟草花瓣颜色较野生...     

越橘果实转录组及R2R3-MYB转录因子分析

以‘泽西’越橘（Vaccinium corymbosum‘Jersey’）不同发育阶段的果实为试材,构建De novo转录组测序文库并进行数据分析,利用WebLogo 3、CLC Sequence Viewer 6等软件和荧光定量PCR技术对所获数据中的R2R3-MYB转录因子进行生物信息学分析和表达分析。结果表明,转录组测序共获得有效数据6.01 Gb,通过组装得到Unigene序列60 481个。功能注释结果显示,有39 612个Unigene可以注释到GO和COG等数据库上;20 869个Unigene无匹配信息。利用GO和COG分类工具可将这些序列分别划分为55个和25个功能类别,涉及信号转导和转录调控等功能。利用所获数据分析越橘R2R3-MYB基因,结果表明共得到21个R2R3-MYB。序列分析显示,这21个基因均含有完整的R2R3-MYB区域,在此区域内2（G）和4（W）等30个氨基酸保守不变。进化树分析结果显示,越橘R2R3-MYB基因分为11个亚组。其中,S4、S5和S6亚组中有6个基因涉及到花青苷生物合成。荧光定量PCR结果分析显示,这6个基因在果实发育的7个阶段均能表达,但表达模式不同,这6个基因可能对越橘果实着色具有一定作用。     

苹果SUPERMAN家族基因的组织特异表达及MdSUP3的功能分析

通过半定量RT-PCR分析SUPERMAN家族基因在‘富士’苹果（Malus × domestica Borkh.‘Fuji’）叶芽、幼叶、花芽、花蕾、花、皮部组织和幼果中的表达模式,通过MdSUP3自主启动子驱动的GUS基因表达和MdSUP3异位表达分析其功能。结果表明,MdSUP3、MdSUP11和MdSUP9a在所检测的组织器官中均有表达,MdSUP9b主要在营养器官中表达,MdSUP5a、MdSUP1b主要在生殖器官中表达。MdSUP3启动子驱动GUS基因在植株根尖、幼叶、幼茎和花等器官中表达。超表达MdSUP3的转基因烟草植株矮化、节间缩短、叶片卷缩、花器官颜色改变和部分花器官形态异常;与对照相比,转基因烟草中ABA合成酶基因NtNCED3-2,花青素合成途径的NtDFR2和NtANS1基因表达显著上升,细胞分裂素氧化酶基因NtCKX和赤霉素氧化酶基因NtGA2ox4表达显著下降。异位过量表达删除C端DLELRL基序的MdSUP3基因不影响转基因烟草的生长发育,证明DLELRL是基因必不可少的功能域。     

瓜叶菊花青素合成关键结构基因的分离及表达分析

 本文通过RT-PCR的方法分离了花青素合成途径上的关键结构基因片段：CHS、CHI、F3H、F3'H和DFR。在白色系、红色系、紫色系和蓝色系瓜叶菊舌状花中,采用半定量RT-PCR的方法分析CHS、CHI、F3H、F3'H、DFR、F3'5'H、3MaT这7个结构基因在花不同发育阶段的表达模式。结果表明：在白色花中,不存在CHS的表达;在红色花中,检测到F3'H基因的高丰度表达,但没有检测到F3'5'H的转录本;在蓝色花中,没有F3'H表达的信号,但在花序开放的第Ⅰ阶段有较强的F3'5'H的表达信号;而在紫色花中,可以同时检测到F3'H和F3'5'H的转录本。此外,瓜叶菊花青素合成相关结构基因在花序开放初期高丰度表达,随后逐渐降低,在第Ⅳ阶段表达量再次出现升高现象,而在花序开放末期表达量极低或没有表达信号。     

发根农杆菌介导的荔枝LcMYB1转化烟草叶片的研究

利用荔枝果皮花青苷生物合成的关键调节基因LcMYB1为标记，构建植物表达载体pBA002-LcMYB1，电转法转入发根农杆菌A4菌株，通过叶盘法转化烟草K326。结果表明，烟草叶片侵染一周后长出白色的毛状根，约3周后部分毛状根逐渐变成红色，毛状根诱导率为100%，红色毛状根诱导率为19.9%。当筛选培养基中添加5 mg ? L-1 Basta，毛状根诱导率降低为33.3%，但红色毛状根诱导率提高到75%。高效液相色谱分析表明，红色毛状根中积累矢车菊素–3–葡萄糖苷和矢车菊素–3–芸香糖苷，PCR检测证实红色毛状根是由LcMYB1的转入引起的。实时荧光定量PCR表明转LcMYB1可以诱导烟草毛状根中花青苷生物合成相关的结构基因和调节基因表达。     

MrMYB1-MrbHLH1:一个有潜力的园艺植物转基因可视化报告基因

将杨梅果实中参与花色苷生物合成的转录因子编码基因MrMYB1和MrbHLH1同时搭载到双元表达载体的多克隆位点内,重组成双价表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法将其分别转入烟草、番茄和森林草莓,成功转化MrMYB1-MrbHLH1的烟草、番茄和森林草莓不定芽因大量积累花色苷而呈红色,与野生型或假阳性不定芽相比,表型差异明显;转化35S::MrMYB1-MrbHLH1的烟草和番茄植株中可显著积累花色苷呈红色,且该性状可稳定遗传。MrMYB1-MrbHLH1在3种园艺植物具有调控花色苷积累而使阳性转化植物部分组织器官呈现红色的功能,是1个有潜力的遗传转化可视化报告基因。     

花色素苷生物合成与分子调控研究进展

花色素苷是决定植物花色的主要色素,其生物合成是目前研究得最为清楚的植物次生代谢途径之一。花色素苷的生物合成主要由于F3H,F3'H和F3'5'H三个关键酶的作用形成3个分支,最终分别生成橙色到砖红色的天竺葵素糖苷,红色的矢车菊素糖苷和蓝色到紫色的飞燕草素糖苷,因此, F3'H,F3'5'H和DFR基因是利用遗传转化引入花卉植物原本缺乏的花色代谢途径的关键基因。花色素苷合成结构基因的转录调控是目前研究的热点,对结构基因的转录进行调控的转录因子主要包括两大类相互作用的因子－bHLH和MYB类转录因子,花色素苷合成的转录调控机理的基本模式,包括bHLH和MYB类因子之间的相互作用,以及它们对结构基因顺式元件的识别和结合已经阐述的比较清楚。另外,对于一些处于bHLH和MYB上游的, WD40类因子和光敏色素的研究开启了从信号传导到花色素苷合成的整个调控过程的研究。     

ABA对葡萄花色苷合成相关基因表达的影响

以京优葡萄为试材．研究果实成熟过程中果皮花色苷含量及其生物合成相关酶基因和转录因子转录水平的变化．同时研究不同浓度ABA处理对花色苷含量和相关基因转录水平的影响。结果表明,葡萄果实发育进入着色期,CHSs、CHIs基因家族中的CHS3、CH12和UFGT、MybAJ、MybAl-2随花色苷合成而大量表达,其转录水平与花...     

马铃薯抗晚疫病基因R3a、R1和RB在番茄中的表达

 晚疫病由疫霉菌( Phytophthora infestans) 引起, 主要侵染番茄和马铃薯等茄科作物, 造成巨大的经济损失。马铃薯已有5个抗晚疫病基因被克隆。为了研究已克隆的马铃薯抗晚疫病基因是否在番茄中起作用, 将马铃薯的抗晚疫病基因R3a、R1和RB 通过农杆菌介导法分别导入番茄品种Moneymaker中。筛选得到的再生植株经PCR检测结果表明, 目的基因已整合入番茄基因组; 转基因番茄离体叶片接种验证结果表明, 接种马铃薯晚疫病菌株8914829 (即小种0) , 转基因番茄产生了抗病的过敏反应(HR反应) 。为了验证转基因番茄是否对番茄晚疫病菌株产生抗性, 用番茄晚疫病的主流小种和强致病力菌株共5个菌株接种转基因番茄植株, 结果表明转R3a和R1 基因的番茄对部分番茄晚疫病菌株能够产生抗性, RB转基因植株叶片对5个番茄晚疫病菌株均产生抗性。该研究为番茄抗晚疫病的基因工程育种开辟了新的途径。     

光照对荔枝果实着色和花色素苷生物合成影响的分子机制研究

以‘桂味’荔枝为试材,花后45 d用双层牛皮纸对整个果穗进行完全遮光处理,14 d后(采收前7 d)解除遮光,比较遮光和解除遮光处理果皮着色以及花色素苷生物合成途径中LcUFGT等8个结构基因和调控基因LcMYB表达的变化,探索光照调控荔枝果实花色素苷合成和着色的分子机制。研究发现:遮光处理显著抑制了果皮花色素苷的合成,延缓了果实的正常着色;解除遮光后,花色素苷迅速合成,7 d后呈现荔枝典型的红色;遮光处理抑制了花色素苷生物合成途径中LcUFGT等8个重要结构基因和调控基因LcMYB1的正常表达;解除遮光后LcUFGT和LcMYB1等基因的表达量均有不同程度的增加,其中LcDFR、LcF3'H、LcUFGT和LcMYB1的表达与花色素苷含量的变化规律基本一致。可见,荔枝果皮花色素苷积累和着色依赖光照,花色素苷生物合成途径中主要的结构基因和转录因子都可以被光诱导,其中LcDFR、LcF3'H、LcUFGT和LcMYB1可能在光照调控荔枝果实色泽形成中扮演更为重要的角色。