LeWRKY2基因的克隆及功能分析

【目的】克隆番茄WRKY2转录因子,为研究番茄抗病反应的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】根据克隆出的番茄LeWRKY2基因特异片段（GenBank登录号：EU755368.1）,运用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cNDA ends,RACE）技术克隆番茄LeWRKY2 cDNA全长,并用生物信息学的方法对其进行分析。用实时荧光定量PCR方法检测番茄经JA、番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、放线菌酮（cycloheximide）刺激时LeWRKY2基因的表达情况。【结果】①从番茄中克隆到一条全长为1 007 bp的cDNA序列,命名为LeWRKY2基因,阅读框471 bp,编码156个氨基酸。②LeWRKY2蛋白含有1个WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构,可能具有转录、转录调控、信号传导功能。③100 μmol•L-1 茉莉酸（jasmonic acid,JA）刺激番茄幼苗0-60 min时,LeWRKY2基因的相对含量与JA刺激时间成正比;而刺激60-150 min时,LeWRKY2基因的相对含量与JA刺激时间成反比;④番茄灰霉菌可以诱导LeWRKY2基因的的表达,且在4 h时表达量达到最高;⑤LeWRKY2基因的转录产物的合成不依赖于蛋白质的从头合成。【结论】LeWRKY2是一种参与番茄防御反应的早期快速反应基因。     

内生细菌TF28对番茄灰霉病的诱导抗性研究

[目的]研究内生细菌TF28对番茄灰霉病的诱导抗性.[方法]采用生化测定方法研究内生细菌TF28对番茄叶片6种防御酶活性和2种抗病信号分子含量的影响.[结果]内生细菌处理后番茄叶片苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、脂氧合酶（LOX）、几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶活性明显增强,6种防御酶最大活性分别为对照的2.7、2.5、1.6、1.5、2.7和4.1倍.水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）含量明显上升,SA含量第7天最高,JA含量第3天最高,分别为对照的2.1和2.9倍.[结论]内生细菌TF28可诱导提高防御酶活性抵抗番茄灰霉病侵染,诱导抗病信号传导途径可能与SA和JA介导有关.     

外源茉莉酸对稻瘟病菌引起褐点型坏死斑的水稻防御响应的影响

[目的]解析外源茉莉酸(JA)对JA合成/响应、水杨酸(SA)合成/受体及防御相关基因表达的影响,为进一步揭示JA调控稻瘟病菌侵染引起褐点型坏死斑的水稻抗病作用机制提供基础数据.[方法]以接种稻瘟病菌菌株Y92-66b后形成褐点型坏死斑的地方中抗水稻月亮谷为研究材料,分别利用400μmol/L JA和200μmol/L JA抑制剂(IBU)外源处理接种稻瘟病菌后引起褐点型坏死斑(72 h)的水稻月亮谷,调查水稻稻瘟病症状,同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测JA合成/响应、SA合成/受体、防御和蔗糖/果糖合成酶基因的表达.[结果]外源JA有效减轻了水稻稻瘟病症状.同时,JA诱导水稻JA合成基因OsLOX1、OsOPR1、OsOPR7、OsJIMT、OsHPL3和OsAOS2在72 h时上调表达,至96和120 h时,只有OsAOS2、OsOPR7和OsLOX1上调表达,其余3个基因下调表达;外源JA未诱导OsLOX3表达;JA诱导水稻JA响应基因OsCOI1a、OsMYC2、OsJAZ1、OsJAZ9和OsbHLH35在72 h时上调表达,至120 h时,只有OsCOI1a和OsJAZ1上调表达,其余3个基因均下调表达;外源JA未诱导OsCOI1b和JiOsPR10表达.JA诱导SA受体基因OsNPR4在72 h时显著上调表达(P<0.05,下同),96 h时下调表达,至120 h时又上调表达但不显著(P>0.05).JA诱导SA合成相关基因OsPAD4在72 h时显著上调表达,OsEDS1在120 h时显著上调表达.外源JA诱导防御基因OsPR5在72 h时开始上调表达,至96 h时显著上调表达;外源JA未诱导OsPR4a表达.外源JA诱导参与细胞壁合成的蔗糖合成酶基因OsRSUS1和果糖合成酶基因OsFRK-2表达,IBU则加重了水稻稻瘟病症状,同时抑制大部分JA合成/响应、蔗糖/果糖合成酶和防御基因的表达.[结论]外源JA主要通过诱导稻瘟菌引起的褐点型坏死斑的水稻JA合成/响应基因、参与细胞壁合成的蔗糖/果糖合成酶及防御基因表达参与水稻防御响应.     

不结球白菜抗病相关基因BcCPR1的克隆和功能分析

[目的]本文旨在探究BcCPR1基因对灰霉菌的抗性及对霜霉菌和非生物胁迫的响应。[方法]采用同源克隆方法从不结球白菜中克隆BcCPR1基因CDS序列;利用MEGA 7软件对其进行同源性分析;利用农杆菌介导法在烟草中进行亚细胞定位研究及转基因拟南芥植株的获取;利用RT-qPCR技术,对BcCPR1基因在生物及非生物胁迫处理下的表达水平进行分析。[结果]BcCPR1基因含有1个1 221 bp的开放阅读框(ORF),编码406个氨基酸,与同属的甘蓝和芜菁进化关系最相近,分别为97.54%和92.66%。亚细胞定位结果显示,BcCPR1蛋白定位在细胞膜上。霜霉菌、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)和盐处理BcCPR1基因均有响应,并存在时间表达差异。过表达BcCPR1基因的转基因拟南芥对灰霉菌抗性增强,同时茉莉酸(JA)途径标记基因PDF1.2表达量显著上升。[结论]BcCPR1蛋白定位于细胞膜,主要通过茉莉酸(JA)途径调节过表达拟南芥对灰霉菌的抗性,对霜霉菌及非生物胁迫均有响应。     

番茄环纹斑点病毒(TZSV)侵染对辣椒防御相关物质的影响

采用高效液相色谱法(HPLC)对番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)侵染后辣椒和健康辣椒植株(CK)叶片中茉莉酸(jasmonic acid,JA)、水杨酸(jalicylic acid,SA)和茉莉酸-异亮氨酸(jasmonoyl isoleucine,JA-Ile)含量进行测定。结果表明,SA含量在TZSV侵染24、48、96、120、144、168、192、216、240 h后显著高于对照组;JA含量在TZSV侵染8、24、72、96、144、216 h后显著高于对照组;JA-Ile含量在TZSV侵染24、48、72、96、144、216 h后显著高于对照组。TZSV侵染可使辣椒SA、JA及其衍生物JA-Ile含量增加。     

不结球白菜谷胱甘肽还原酶基因NhccGR1的克隆与表达分析

利用cDNA-AFLP技术,从芜菁花叶病毒(TuMV)侵染的不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)幼叶中分离到1条编码谷胱甘肽还原酶的基因片段,通过电子克隆得到其cDNA全长为1 503 bp,编码501个氨基酸,命名为Nhc-cGR1。对该基因进行生物信息学分析,并利用实时定量PCR研究其在TuMV侵染和水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)诱导下的表达情况。结果表明:该基因作为病原相关基因参与了TuMV病害响应,并通过增加自身表达量来激活细胞内的信号转导途径,诱导各种防卫反应相关基因的表达;同时,SA和JA抑制该基因的表达,外施ET能诱导其正向表达。     

稻瘟病菌侵染时水稻防御体系对外源茉莉酸的响应分析

[目的]探究特定时期稻瘟病菌与水稻互作对外源茉莉酸(JA)的响应,为揭示稻瘟病菌与水稻互作时水稻防御体系对外源JA响应的分子机制提供理论依据.[方法]以稻瘟病菌株95234I-1b和普通感病水稻品种丽江新团黑谷(LTH)为试验材料,通过外源JA以两种不同的方式(处理1,分别用100和400μmol/L JA处理水稻叶片,6 h后接种95234I-1b菌株;处理2,水稻叶片接种95234I-1b菌株72 h后,分别用100和400μmol/L JA处理水稻叶片)处理与稻瘟病菌互作过程中特定时期的水稻,调查水稻稻瘟病发病症状,并用即时聚合酶链锁反应(qRT-PCR)检测水稻防御相关基因的表达情况.[结果]外源JA的两种不同处理方式均能减轻受侵染水稻稻瘟病发病症状,并诱导水稻防御相关基因不同程度的上调表达.用100和400μmol/L JA喷雾水稻6 h后再接种稻瘟病菌株的诱抗效果分别为15.06%和25.63%;稻瘟病菌株孢子接种水稻72 h再喷雾100和400μmol/L JA的诱抗效果分别为36.60%和47.12%.与对照相比,JA抑制了水稻水杨酸(SA)途径相关基因的大幅上调表达.在一定JA浓度范围内,高浓度JA对SA途径相关基因表达抑制程度高于低浓度JA的抑制程度;高浓度JA诱导JA途径相关基因上调表达幅度高于低浓度JA的诱导程度;高浓度JA诱导PR1a上调表达幅度小于低浓度JA诱导的上调幅度,高浓度JA诱导PR10a上调表达幅度大于低浓度JA诱导的上调幅度.[结论]JA以两种不同的方式处理与稻瘟病菌互作过程中特定时期的水稻,均能诱导水稻病程相关基因和JA途径相关基因上调表达,抑制SA途径相关基因的大幅上调表达,表明水稻防御体系中的病程相关基因及JA途径的相关基因主要参与了水稻防御体系对外源JA的响应.     

拟南芥AtBT4对灰葡萄孢的抗性机制分析

【目的】揭示AtBT4在拟南芥抗灰葡萄孢中与SA、JA信号途经的相互关系。【方法】利用RT-PCR技术,检测用SA、SA类似物BTH、JA、ACC及灰葡萄孢处理拟南芥野生型Col-0后其AtBT4的表达情况;检测经SA和JA处理后拟南芥SA、JA途径相关突变体AtBT4的表达情况;并检测接种灰葡萄孢后拟南芥野生型Col-0、bt4突变体和回复突变体抗病相关基因的表达情况。【结果】JA处理和接种灰葡萄孢后,拟南芥野生型Col-0中AtBT4的表达明显增强。但经JA处理后,JA不敏感突变体jar1的AtBT4表达变化趋势与野生型明显不同,AtBT4的表达水平不受JA诱导。SA信号途径相关突变体eds5、sid2和npr1中AtBT4的表达明显低于野生型,但变化趋势与野生型基本一致。bt4突变体中抗病相关基因PR1、PR4、PDF1.2和BIK1的表达明显低于野生型和回复突变体。【结论】AtBT4的表达受JA和灰葡萄孢的诱导,AtBT4突变影响抗病相关基因PR1、PR4、PDF1.2和BIK1的表达,AtBT4可能通过SA、JA信号途径影响拟南芥对灰葡萄孢的抗性。     

内生细菌EBS05对番茄植物的促生和诱导抗病性信号转导途径的研究

以番茄品种江蔬14号为试验材料,研究了内生细菌EBS05对番茄的促生作用及其对番茄抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的诱导作用。研究结果表明,EBS05对番茄植株具有明显的促生作用,能诱导番茄体内细胞生长相关扩张蛋白基因LeEXP2、LeEXP5和LeEXP18的增量表达。EBS05菌悬液诱导处理后接种TYLCV,SA信号转导途径下游关键基因NPR1和PR1在第1天均被激活,且于诱导处理后3~5 d增量表达,至第7天达到最高峰值,分别比对照番茄植株增加了16倍和13倍。由此推测,内生细菌EBS05诱导番茄对TYLCV的系统抗性是通过SA信号转导途径实现的。同时,接种后5 d,JA信号转导途径标记基因Coi1被激活,且增量表达,表明在内生细菌EBS05诱导番茄对TYLCV系统抗性信号转导途径过程中,可能存在SA信号途径和JA信号途径的交叉协同作用。     

金针菇JA/SA信号通路基因鉴定及其对外源JA/SA应答

本研究鉴定了金针菇茉莉酸(JA)信号通路的4个关键基因:COI1、PDF1.2、MYC2-1、MYC2-2与水杨酸(SA)信号通路的4个关键基因:PR1-1、PR1-2、NPR1-1、NPR1-2。NBT染色法和荧光定量结果表明,金针菇JA/SA信号通路可应答外源JA/SA,50μmol·L~(-1)外源JA和500μmol·L~(-1)外源SA处理金针菇菌丝12h可显著提高JA/SA信号通路基因的转录水平,基因PDF1.2响应JA诱导最明显,可作为JA信号通路标记基因;JA/SA信号转导途径间存在协同或拮抗作用:SA信号转导通路中NPR1蛋白对JA信号转导通路中PDF1.2基因表达有抑制作用,外源JA/SA的相对浓度决定其作用的强弱。     

水杨酸诱导番茄对灰霉病的抗性研究

[目的]探讨水杨酸(SA)对番茄抗灰霉病的诱导作用。[方法]以SA作为诱抗剂处理番茄幼苗,研究了SA对番茄灰霉病病原菌菌丝生长和分生孢子萌发的影响,并测定了其诱导抗性产生过程中番茄植株体内过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)4种防御酶活性及丙二醛(MDA)含量的变化。[结果]SA在其浓度范围内对番茄灰霉病病原菌的孢子萌发和菌丝生长无抑制作用,而相对诱导效果在处理后也有不同程度的提高,其中用150 mg/L SA处理番茄植株后间隔3 d挑战接种灰霉病病原菌产生的诱导效果最好,且抗性持续期在10～15 d。经SA处理后,CAT、POD、PPO、PAL在番茄灰霉病系统诱导抗性中均呈先上升后下降的趋势,且明显高于对照,同时MDA含量以波浪线形式呈上升趋势。[结论]SA在一定浓度范围内使用是安全的;CAT、POD、PPO、PAL活性与番茄对灰霉病的诱导抗性呈正相关,MDA含量的增加与抗病性的提高也密切相关。     

亚油酸乙醇胺诱导番茄对灰葡萄孢抗性的作用及机制

【背景】灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是危害番茄（Solanum lycopersicum）的重要病害之一,防治不及时可造成30%—40%减产。目前生产上多以化学防治为主,但存在农产品安全及环境污染的风险。N-酰基乙醇胺（NAE）是植物体内天然存在的一类脂质生物活性化合物,其在哺乳动物中具有多种免疫功能,但其在植物免疫中的作用和机制尚不清楚。【目的】探讨N-酰基乙醇胺在诱导番茄对灰葡萄孢防御中的作用,为研发番茄灰霉病绿色防控技术提供依据。【方法】将灰葡萄孢分别接种在含有硬脂酰乙醇胺（NAE 18:0）、亚油酸乙醇胺（NAE 18:2）、廿二碳五烯酸乙醇胺（NAE 22:5）的培养基上,观察灰葡萄孢的生长情况。在此基础上,以番茄‘Moneymaker’植株为材料,硬脂酰乙醇胺、亚油酸乙醇胺、廿二碳五烯酸乙醇胺外源处理番茄叶片后接种灰葡萄孢,统计病情指数,测定荧光参数。采用qRT-PCR技术明确亚油酸乙酰胺处理后番茄叶片灰葡萄孢Actin的相对表达量,进一步测定番茄叶片中主要抗病基因PI I、PR-1、NPR1、Nr、ACO1、PYR1a等的相对表达量及茉莉酸（jasmonic acid,JA）、水杨酸（salicylic acid,SA）、乙烯（ethylene,ETH）、脱落酸（abscisic acid,ABA）、生长素（indoleacetic acid,IAA）含量。并以乙烯信号转导突变体植株never ripe（nr）及对照植株Pearson（PB）为材料,在外源亚油酸乙酰胺处理后接种灰葡萄孢,测定番茄叶片叶绿素荧光参数和灰葡萄孢Actin的相对表达量。【结果】体外培养试验结果表明灰葡萄孢生长并不受外源N-酰基乙醇胺的影响,外源施用N-酰基乙醇胺能显著提高番茄植株对灰霉病的抗性,缓解由灰葡萄孢侵染导致的番茄叶片光系统II实际光化学效率（Φ_PSII）的下降。3种N-酰基乙醇胺中,亚油酸乙醇胺施用后番茄叶片灰霉病病情指数下降最为明显,灰葡萄孢Actin的相对表达量下调60%,其诱导灰霉病抗性效果最佳。番茄植株接种灰葡萄孢后抗性基因PI I、PR-1、NPR1、Nr、ACO1的表达水平均有不同程度上调。外源亚油酸乙醇胺处理使得番茄响应灰葡萄孢接种后PI I、Nr、ACO1的表达进一步增强,其中乙烯合成基因ACO1的表达水平最高。番茄植株接种灰葡萄孢后叶片水杨酸、茉莉酸、生长素和乙烯含量增加,但外源亚油酸乙醇胺处理并接种灰葡萄孢后只有乙烯含量显著增加。进一步研究发现,番茄乙烯突变体nr植株中,外源亚油酸乙醇胺对灰葡萄孢的抗性诱导作用显著受到抑制。【结论】外源施用亚油酸乙醇胺能够提高番茄内源光合效率和抗病基因的表达及内源激素乙烯的含量,增强番茄植株对灰霉病的抗性,推测其诱导抗性作用可能与乙烯信号路径相关。     

番茄灰霉病的拮抗菌筛选及分子鉴定

[目的]筛选番茄灰霉病的拮抗菌,并采用分子生物学手段进行鉴定。[方法]以番茄灰霉病病原菌为供试菌,从耕作土壤中筛选拮抗菌,利用平板对峙法对拮抗菌进行初筛和复筛,并通过16S r DNA序列分析对拮抗菌进行鉴定。[结果]从番茄灰霉病发病植株根系土壤中筛选出13个拮抗性能较为稳定的分离物,其中3个菌株对番茄灰霉病菌的拮抗作用较强,抑制率达60.00%以上。结合形态学观察及16S r DNA系统进化树分析,分别鉴定为固氮类芽孢杆菌、多黏类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。[结论]该研究为番茄灰霉病的生物防治提供理论依据。     

外源壳聚糖诱导番茄抗灰霉病的作用

[目的]为了明确壳聚糖对番番茄茄幼苗抗灰霉病的诱导作用。[方法]采用叶面喷施的方法,测定了壳聚糖对番茄灰霉病诱抗效果以及番茄叶片中叶绿素含量、可溶性蛋白质、可溶性糖、愈创木酚过氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）、脯氨酸的影响。[结果]壳聚糖对番茄灰霉病的诱抗效果14d时达到58.26%;与灰霉病菌处理组相比,壳聚糖处理组番茄幼苗叶片中叶绿素含量最高增加34.63%、可溶性蛋白含量增加5.30%、可溶性糖含量增加10.83%、游离脯氨酸含量增加16.21%、POD含量增加16.88%、MDA含量降低16.54%。[结论]外源壳聚糖可以提高番茄幼苗光合利用率和保护酶活性从而提高番茄幼苗对灰霉病的抗性。     

壳聚糖与有机硅对番茄幼苗感染灰霉病后抗氧化酶活性的影响(英文)

[目的]为明确壳聚糖与有机硅对番茄抗灰霉病菌能力的影响。[方法]采用叶面喷施法,通过测定在 4 个处理下,即空白对照、灰霉病菌处理、壳聚糖+灰霉病菌处理、壳聚糖+有机硅+灰霉病菌处理,番茄的抗氧化酶活性来研究壳聚糖和有机硅对番茄抗氧化酶活性的影响。[结果]壳聚糖+有机硅+灰霉病菌处理组和壳聚糖+灰霉病菌处理组与灰霉病菌处理相比可提高番茄幼苗叶片中抗氧化酶活性,在第 6 天,壳聚糖+有机硅+灰霉病菌处理组和壳聚糖+灰霉病菌处理组的 PAL、SOD、POD、PPO、CAT 活性比灰霉病菌处理组分别提高 27.36%、52.07%、43.55%、82.02%、71.82%和 18.91%、30.22%、57.14%、38.09%、53.64%。[结论]壳聚糖和有机硅可增加番茄幼苗感染灰霉病后抗氧化酶的活性。     

拟南芥T1N6_22在抵抗Pst DC3000侵染过程中的功能分析

【目的】明确拟南芥抗灰霉病基因T1N6_22在抗Pst DC3000过程中的功能,分析T1N6_22影响拟南芥对Pst DC3000的抗性原因。【方法】对t1n6_22突变体和转基因回复突变体（t1n6_22/T1N6_22）接种Pst DC3000,检测其症状;采用间苯胺蓝染色法检测接种突变体中胼胝质的积累情况;测定接种叶片中Pst DC3000的生长量,明确T1N6_22在拟南芥抗Pst DC3000过程中的功能。利用RT-PCR技术,检测SA、JA和ET对T1N6_22表达的影响及T1N6_22对抗病防御相关基因表达的影响;利用quantitative real-time PCR技术,检测Pst DC3000对T1N6_22及抗病相关基因表达的影响,分析T1N6_22影响拟南芥对Pst DC3000的抗性原因。【结果】t1n6_22突变体接种Pst DC3000后表现明显的抗病症状,而回复突变体t1n6_22/T1N6_22和拟南芥野生型表现明显的感病症状。SA处理拟南芥野生型,T1N6_22的表达量明显增强,经JA和ACC处理,该基因的表达量无显著变化。t1n6_22突变体中,PAL、PR4、PPO、SOD和CAT的表达水平均明显高于野生型Col-0和转基因回复植株。接种Pst DC3000后,拟南芥野生型中T1N6_22及抗病相关基因PR1、PR3、PR5和PDF1.2的表达量明显增强。【结论】T1N6_22在拟南芥抗Pst DC3000过程中起负调控作用,T1N6_22的表达受SA诱导,可能主要通过调节植物的次生代谢产物的分泌影响拟南芥对Pst DC3000的抗性。     

ABA对TCV的防御作用研究

[目的]了解脱落酸(ABA)是否参与宿主对芜菁萎缩病毒(Turnip crinkle virus,TCV)的防御作用。[方法]外施ABA和选用相应突变体,利用Western-blot检测各植株中TCV外壳蛋白含量,并采用RT-PCR分析防御相关基因表达。[结果]外施SA、JA、ET和ABA后,仅SA和ABA对TCV积累有明显抑制作用。在拟南芥-TCV互作系统中,SA和ABA之间具拮抗效应,且ABA诱导对TCV的防御不依赖于SA途径。[结论]植物通过激活不同的信号途径调节宿主对病毒的防御。