序贯共培养体系对小鼠体外受精胚胎发育效果的影响

采用体外分离培养的兔输卵管上皮细胞和子宫内膜细胞构建了序贯共培养体系,并与体外受精得到的受精卵进行共培养。试验结果表明,HTF液受精率显著高于T6液(P<0.05),更适用于卵母细胞的体外受精。序贯共培养体系和输卵管上皮细胞培养组2-细胞率都显著高于单独培养液组和子宫内膜细胞培养组(P<0.05),二者均可克服2-细胞阻滞。序贯共培养体系胚胎的囊胚体外发育率显著高于其他共培养组(P<0.05)。表明序贯共培养体系比单一体细胞共培养体系能更好地模拟体内环境,提高早期胚胎的体外发育率。     

克服小鼠早期胚胎体外培养发育阻滞的研究

为探讨不同培养基及共培养对克服小鼠早期胚胎体外发育阻滞的影响,用不同成分组成的5种常用培养液对小鼠早期胚胎进行体外培养,后以KSOM作为基础培养基,KSOMFBS为对照,分别与小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和卵丘细胞(CC)进行共培养,观察从2细胞发育到4细胞的胚胎数和囊胚数的变化。结果发现5种培养液中从2-细胞发育到4-细胞的胚胎率为30.5%~43.5%,差异不显著。KSOM组囊胚率为40.9%,显著高于其他各组(27.9%~30.0%)。共培养后,各组中克服发育阻滞的胚胎数和囊胚数均有显著提高,其中添加胎牛血清组4细胞胚胎数和囊胚数显著高于不添加组,输卵管上皮细胞组显著高于卵丘细胞组。结果显示共培养对克服小鼠2-细胞发育阻滞作用明显,添加胎牛血清效果明显好于不添加,输卵管上皮细胞共培养效果好于卵丘细胞。     

猪输卵管上皮细胞对小鼠早期胚胎体外发育的影响

研究了不同生殖时期猪输卵管上皮细胞对小鼠早期胚胎体外发育的影响,以此建立了适于早期小鼠转基因胚胎体外培养的猪输卵管上皮细胞共培养体系,并用PCR法对体外培养发育到不同阶段的小鼠转基因胚胎进行了外源基因整合检测。结果表明,在受孕初期的猪输卵管上皮细胞(无论是原代还是传代细胞)上,培养的小鼠1-细胞期胚胎的囊胚率显著高于发情间期的猪输卵管上皮细胞(P<0.01);在相同生殖时期猪输卵管原代和传代上皮细胞上,培养的小鼠1-细胞期胚胎的囊胚率差异不显著;在转基因胚胎不同发育阶段,PCR检测呈阳性的胚胎比率分别为:2-细胞期为96%,4-细胞期为63%,8-细胞期为43%,囊胚期为19%。由此可见,受孕初期的猪输卵管上皮细胞可促进与之体外共培养的小鼠早期胚胎的发育;随着早期小鼠转基因胚胎的发育,PCR检测呈阳性的转基因胚胎的比率逐渐降低。     

共培养对小鼠胚胎内部活性氧含量影响

文章旨在研究输卵管上皮细胞共培养对小鼠胚胎内部活性氧含量影响,探索共培养克服胚胎发育阻滞机理。用小鼠输卵管上皮细胞对合子进行共培养,DCFDA测定胚胎内部H2O2含量,以外源性H2O2对输卵管上皮细胞和胚胎进行阴性对照,用Hochest 33342和PI染色检测细胞凋亡情况,以MTT法测定输卵管上皮细胞活力。结果表明,共培养能显著提高2-细胞发育率、降低胚胎内部H2O2含量(P<0.05),提高4-细胞率及降低胚胎内部H2O2含量(P>0.05)。外源性H2O2能够使合子凋亡甚至死亡,导致共培养细胞活力下降(P<0.05),未能显著地促进胚胎发育(P>0.05)。结果表明共培养能够降低胚胎细胞内部活性氧,克服胚胎发育阻滞,促进胚胎发育。     

血清及山羊卵丘细胞共培养对猪胚胎体外发育的促进作用

为进一步完善猪胚胎体外发育系统,以孤雌激活胚胎为研究对象,依次对胚胎培养液种类、培养期间血清添加方式、卵丘细胞共培养体系进行筛选优化。结果表明,与常规的PZM3培养液相比,CR1aa并不适合猪胚胎的体外发育;猪胚胎在PZM3中培养4d后添加10%胎牛血清培养至第6天,体外发育能力得到显著改善,卵裂率、囊胚率、囊胚孵化率、囊胚细胞数分别达到95.1%、56.5%、27.3%、79.3;在此基础上,利用山羊卵丘细胞与猪胚胎进行共培养,将囊胚孵化率进一步提高至36.6%,初步建立了一套高效稳定的猪胚胎体外发育系统。     

TCZB培养液提高小鼠早期胚胎热耐受性的研究#br#

【目的】研究改良的CZB培养液(TCZB)对小鼠早期胚胎发育的影响,寻找一种可以提高动物胚胎热耐受性的新型培养液。【方法】利用原核表达的方法得到TAT蛋白和小鼠Hsp70的串联表达体-Tat-Hsp70,通过在CZB培养液中添加Tat-Hsp70蛋白,配制成TCZB培养液。比较热应激组及对照组胚胎发育率和囊胚孵出率的不同。【结果】小鼠胚胎经39℃热应激处理后,CZB组、TCZB组及对照组的囊胚发育率及囊胚孵出率无显著差异。41℃热应激处理后各组则有显著差异,对照组囊胚发育率及囊胚孵出率(83.7±6.1和75.6±4.5)显著高于TCZB组（81.3±4.5和76.5±7.6）（P＜0.05）,TCZB组显著高于CZB组（80.2±5.4和73.4±6.2）（P＜0.05）。【结论】TCZB培养液可以提高小鼠早期胚胎在41℃强烈热应激条件下的发育率,提高小鼠胚胎的热耐受性。     

不同培养液对昆明小鼠体外受精率及早期胚胎体外发育的影响

在TYH受精液中添加促卵泡素（FSH）和苯甲酸雌二醇（E2），检测不同浓度的FSH和E2对昆明小鼠的体外受精率的影响；检测在M16、CZB两种培养液中添加胎牛血清（FCS）与否对昆明小鼠早期胚胎体外发育的影响．结果表明：在．rYH中添加1．0IU／mL FSH，受精率和2-细胞胚率显著高于对照组；在TYH中添加0．1μg／mL E2，受精率和2-细胞胚率也显著高于对照组．在CZB中添加体积分数为10％FCS，可显著减少2一细胞期体外发育阻断，并显著提高小鼠胚胎体外发育的囊胚率，可见，以TYH添加1．0IU／mL FSH和0．1μg／mL E2为受精液，以含体积分数为10％FCS的CZB为胚胎培养液，小鼠胚胎可获得较高的囊胚率．葡萄糖并不是小鼠胚胎形成囊胚所必需的．     

TCZB培养液提高小鼠早期胚胎热耐受性的研究

【目的】研究改良的CZB培养液(TCZB)对小鼠早期胚胎发育的影响,寻找一种可以提高动物胚胎热耐受性的新型培养液。【方法】利用原核表达的方法得到TAT蛋白和小鼠Hsp70的串联表达体—Tat-Hsp70,通过在CZB培养液中添加Tat-Hsp70蛋白,配制成TCZB培养液。比较热应激组及对照组胚胎发育率和囊胚孵出率的不同。【结果】小鼠胚胎经39℃热应激处理后,CZB组、TCZB组及对照组的囊胚发育率及囊胚孵出率无显著差异。41℃热应激处理后各组则有显著差异,对照组囊胚发育率及囊胚孵出率(83.7±6.1和75.6±4.5)显著高于TCZB组(81.3±4.5和76.5±7.6)(P0.05),TCZB组显著高于CZB组(80.2±5.4和73.4±6.2)(P0.05)。【结论】TCZB培养液可以提高小鼠早期胚胎在41℃强烈热应激条件下的发育率,提高小鼠胚胎的热耐受性。     

FCS和BSA对小鼠早期胚胎体外培养的影响

本实验是在CZB和Whitten’s Medium 2种培养液中添加胎牛血清(FCS)和牛血清白蛋白(BSA),比较它们对小白鼠早期胚胎体外发育的影响。结果如下:在培养注射HCG后37～39h的小鼠胚胎时,添加FCS的CZB培养液中通过发育阻断期的胚胎和发育到囊胚的胚胎均明显高于添加BSA的CZB培养液(80.9%、64.3%和41.7%、29.6%),差异显著(P0.05);当用上述液培养注射HCG后44h的小鼠胚胎时,不管是进口培养皿还是国产培养皿,胚胎发育率的差异均不显著(P0.05);在用CZB和Whitten’s培养液分别添加FCS和BSA后,培养注射HCG后44h2-细胞小鼠胚胎时,不论添加FCS还是BSA,在CZB培养液中胚胎发育率均高于Whitten’s培养液(P0.05),但添加FCS和BSA之间的差异不显著(P0.05)。     

小鼠孤雌胚胎体外共培养体系的建立

[目的]在输卵管上皮细胞和/或垂体细胞饲养层下培养小鼠孤雌胚胎,探讨促进小鼠孤雌胚发育突破2-cell阻滞的机制,建立完善的培养体系。[方法]复式激活小鼠卵母细胞后分别在不同饲养层的CZB培养液中进行培养,并观察、比较各培养条件下孤雌胚胎的发育情况。[结果]培养至24 h,各组无显著差异,都有较高卵裂率。培养至48 h,2类饲养层细胞下的孤雌胚胎48-cell发育效果好,与单独一类饲养层细胞培养差异显著,与对照组比较差异极显著。培养至96 h,2类饲养层细胞下有49.4%（42/85）孤雌胚胎发育为桑囊胚,与其他各组比较差异极显著。[结论]含有输卵管上皮细胞＋垂体细胞的CZB培养液可有效促进小鼠孤雌胚胎发育突破2-cell阻滞,并进一步提高其发育率。     

猪胚胎体外培养体系优化对胚胎干细胞建系的影响

为提高体外胚胎发育质量和体外胚胎建立胚胎干细胞系效率,研究以N2B27为基础的干细胞培养体系对猪孤雌胚胎体外发育和后续建立胚胎干细胞系的影响。设立3个试验组:PZM-3组,孤雌激活的胚胎全程PZM-3培养体系中培养; N2B27组,孤雌激活的胚胎全程N2B27培养体系中培养; PZM-3-N2B27组,孤雌胚胎在PZM-3培养体系中培养至桑葚胚后更换为N2B27培养体系。结果表明,N2B27组无法获得囊胚,但PZM-3-N2B27组胚胎可正常发育至囊胚,囊胚率未显著提高,但囊胚细胞总数显著提高(P<0.05)。PZM-3-N2B27组获得孤雌囊胚用于建立猪胚胎干细胞系,显著提高原代克隆形成率(P<0.05),获得猪胚胎干细胞系呈碱性磷酸酶阳性,表达Oct4、Sox2和Nanog等多能性基因。结果表明,采用PZM-3和N2B27培养体系结合获得的猪孤雌囊胚利于猪胚胎干细胞系建立。研究为进一步优化猪胚胎体外培养体系,获得初始态胚胎干细胞系提供参考。     

猪体细胞克隆胚胎的体外生产试验

 【目的】通过优化猪体细胞核移植程序,建立获得克隆囊胚的有效方法。【方法】比较不同电激活参数、不同体外培养条件对猪体细胞克隆胚发育能力的影响。【结果】选用1.5 kV?cm-1、80 μs 和1 DC的参数组合,对猪核移植重构胚进行电融合和电激活,可获得较高的卵裂率和最高的囊胚发育率（分别为71.4%和14.3%）,且囊胚发育率显著高于其它组（P＜0.05）;0.4% BSA NCSU 23 培养液培养克隆重构胚72 h,半量换液并未改善克隆胚的发育,但添加10% FBS 可显著提高囊胚发育率（15.1%对10.3%,P＜0.05）和DNA 完整率(56.8%对46.6%,P＜0.05) ;采用猪卵泡颗粒细胞（pGC）共培养体系未能显著提高克隆胚发育率（P＞0.05）,但卵丘细胞（pCC）单层共培养时,囊胚发育率显著高于对照组（16.7%对9.8%,P＜0.05）,培养5 d 的克隆胚凋亡率也显著低于对照组（39.5%对54.2%,P＜0.05）。【结论】采用1.5 kV?cm-1、80 μs 和1 DC 的参数组合对猪克隆重构胚进行电融合和电激活,以0.4% BSA NCSU 23培养液作 pCC 单层共培养72 h,然后换用10% FBS NCSU 23 培养液,可明显提高囊胚发育率。     

不同培养条件下小鼠体外胚泡着床模型的研究

用对比的方法观察不同培养条件对小鼠体外胚泡着床的影响,从而建立在体外研究着床机制的简易着床模型。在无血清单独培养系统、子宫内膜上皮细胞(EEC) 无血清共培养系统、EEC 3%胎牛血清(FCS)系统和EEC 0.4%牛血清白蛋白(BSA)系统中分别移入胚泡,观察并统计脱带率、粘附率和扩展率。结果显示后面两组的脱带率、粘附率、扩展率明显高于前面两组,差异显著(P<0.05);而EEC 3?S共培养组的脱带率、粘附率、扩展率和EEC 0.4%BSA共培养组相比,差异不显著(P>0.05)。因此胚泡与子宫内膜上皮细胞用FCS共培养与用BSA共培养都是比较理想的着床模型,可以用来体外研究着床的影响因素。     

程序化冷冻对小鼠胚胎发育的影响

取小鼠原核(220枚)、2～4细胞胚胎(227枚)、桑椹胚(127枚),将其分为3组,每一时期胚胎分成两半,一半取出后立即冷冻复苏并体外培养至囊胚,另一半体外培养至囊胚后冷冻复苏,子宫冲取囊胚(78枚)冷冻复苏为对照组;各组囊胚均移植至于宫,比较程序化冷冻对小鼠早期胚胎存活率的影响.结果表明:原核、2～4细胞胚胎、桑椹胚体外培养至囊胚后冷冻复苏率分别为56.4%、72.2%、81.6%,移植产仔率分别为38.1%、41.6%、56.8%,原核、2～4细胞组复苏率和产仔率极显著或显著低于对照组,桑椹胚组与对照组差异不显著,显示体外培养对早期胚胎冷冻存活有影响;原核、2～4细胞胚胎、桑椹胚冷冻后体外培养至囊胚,胚胎移植后产仔率分别为25.3%、28.2%、42.1%,与对应胚胎时期体外培养至囊胚冷冻复苏后移植产仔率相比,原核、2～4细胞组均存在显著差异,而桑椹胚组差异不显著,显示原核、2～4细胞的早期胚胎体外培养至囊胚后冷冻可提高冷冻存活率.     

山羊转基因克隆胚在体内和体外发育的研究

探讨了体内/外成熟卵母细胞、体内/外培养系统、输卵管液和输卵管上皮细胞共培养系统对转基因克隆胚发育的影响。结果表明:体内/外成熟卵母细胞对转基因克隆胚各阶段发育率无显著影响。体内/外培养系统中,转基因克隆胚2～3-细胞、4-细胞、8-细胞发育率差异不显著;16-细胞和桑/囊胚发育率差异显著。对照组和20%输卵管液中,转基因克隆胚2～3-细胞、4-细胞、8-细胞发育率均显著高于50%输卵管液;在20%输卵管液中16-细胞的发育率显著高于对照组和50%输卵管液。转基因克隆胚在输卵管上皮细胞共培养系统和SOF培养系统中培养,2～3-细胞和4-细胞发育率无显著差异;8-细胞、16-细胞和桑/囊胚的发育率差异显著。