农杆菌介导甜高梁转Bt cry1Ah的研究

[目的]建立一套高效、稳定的甜高梁农杆菌遗传转化体系,并在甜高梁中验证来源于苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因cry1Ah表达产物的杀虫活性.[方法]以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法将密码子优化过的Bt cry1Ah导入2个甜高梁品种"BABUSH"和"MN-3025"中.对获得的再生植株进行 PCR检测、RT-PCR分析及除草剂抗性、目的蛋白表达水平和抗虫性鉴定分析.[结果]对336块幼穗愈伤组织块进行了农杆菌侵染,经双丙氨膦(Bialaphos)梯度筛选后共获得66株再生植株,PCR鉴定在8个转化事件中有22株为阳性植株,平均转化率为2.38%.RT-PCR检测结果表明,cry1Ah在T.甜高梁转基因植株中能够正常转录.Western blotting分析和ELISA定量测定显示,有5株可检测到Bt蛋白,但Bt蛋白含量差异较大,最高可达165.69ng·g-1叶片鲜重(FW),最低的仅为1.93 ng·g,-1叶片鲜重(FW),平均为87.50 ng·g-1FW.饲虫试验表明,有2株转基因甜高粱植株对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)表现为抗性.[结论]利用建立的以甜高粱幼穗为外植体的农杆菌遗传转化体系,可获得具有玉米螟抗性的转基因甜高粱植株,其后代遗传稳定性还有待于进一步的研究.     

转cry1Ab13基因玉米新种质的创制

【目的】构建包含抗鳞翅目害虫基因cry1Ab13的重组植物表达载体,并利用其创制对玉米螟Ostrinia furnacalis具有优良抗性的转基因玉米Zea may L.新种质。【方法】利用同源重组法将cry1Ab13基因连接到表达载体pCAMBIA3300-Bar上,获得以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar。通过农杆菌介导法转化玉米自交系H99幼胚,对再生植株进行逐代除草剂筛选、PCR检测及T2代植株的Southern blotting检测、实时荧光定量PCR检测,并对转基因植株进行田间及室内抗虫性鉴定。【结果】构建了cry1Ab13基因的植物表达载体,转化玉米获得3株高抗玉米螟和1株抗玉米螟的T2代转基因植株。Southern blotting证明cry1Ab13基因已经整合到玉米基因组中,实时荧光定量PCR结果表明cry1Ab13基因已经在玉米植株内表达。抗虫性鉴定结果表明,与对照相比转基因植株对玉米螟的抗性显著提高。【结论】将cry1Ab13基因导入玉米并成功表达,显著提高了转基因玉米对玉米螟的抗性,为抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

利用密码子优化提高Bt cry1Ah基因在转基因玉米(Zea mays L.)中的表达

Bt cry1Ah基因是本实验室从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株BT8中克隆的一种新型杀虫蛋白基因。在前期工作中已根据植物密码子偏好性对cry1Ah基因进行过一次优化。根据玉米密码子偏好性对cry1Ah基因进行第二次优化,并将两次优化的cry1Ah基因分别构建了pAhmG和pmAhb植物表达载体,利用农杆菌介导法转化玉米自交系综31,分别得到10株和9株阳性转基因玉米植株。通过ELISA、Western blot检测及生物活性检测,比较不同优化的基因在玉米中的蛋白表达量及抗虫情况。初步结果表明外源基因在玉米植株中可以稳定表达并可以遗传。二次优化基因比一次优化基因在玉米中的蛋白表达量更高,抗虫性更好。表明密码子优化有利于提高外源基因的表达。     

cry1Ia1基因转化大豆及抗虫性的初步评价

cry1Ia1基因编码的是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)的杀虫晶体蛋白(ICPs),产物对鳞翅目(Lepidoptera)和鞘翅目(Coleoptera)昆虫具有毒害作用,可防治大豆食心虫等害虫.利用农杆菌介导的方法将cry1Ia1基因转入大豆栽培品种黑农35中,并获得了5株转cry1Ia1基因的株系.PCR、Southem blotting和RT-PCR检测结果表明cry1Ia1基因已经整合到大豆基因组中并稳定表达.通过人工接种的方法对转基因植株抗大豆食心虫的水平进行了初步的评价,结果表明其中的2株对大豆食心虫具有高度的抗性,2株具有中等程度的抗性,1株与对照无明显差异.cry1Ia1基因首次成功导入大豆栽培品种黑农35中并获得抗大豆食心虫的转基因植株.     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab22的克隆与表达

【目的】克隆并表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiens,Bt)杀虫晶体蛋白cry1Ab22基因,为解决昆虫抗性问题提供有效途径,并为构建新型转基因工程菌和转基因植物提供基因材料。【方法】根据GenBank中cry1Ab型基因序列设计1对引物,并加入BamHⅠ和PstⅠ酶切位点。用全长基因PCR产物粘端定向克隆的方法,从苏云金芽孢杆菌S249菌株中扩增到1个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白cry1Ab型基因cry1Ab22,将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌TB1,进行诱导表达,并对表达产物的杀虫活性进行检测。【结果】cry1Ab22基因长度约为3.5 kb;其与已知的cry1Ab3型基因同源性最高,所编码的蛋白质存在5个氨基酸差异。cry1Ab22基因已在GenBank中登录,登录号为EU220269,并被Bt毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ab22。SDS-PAGE电泳结果表明,cry1Ab22基因表达了170 ku左右的融合蛋白。cry1Ab22蛋白对小菜蛾(Plutella xylostella)的LC50为225.1μg/mL。【结论】S249菌株含有新型的cry1Ab基因,且该基因表达的蛋白具有较强的杀虫活性。     

大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1的克隆及功能分析

【目的】获得大豆疫霉根腐病抗性相关基因,为培育大豆抗病品种提供理论依据。【方法】在以大豆抗病品种绥农10构建的受疫霉菌诱导后差异表达的cDNA消减文库的基础上,选取文库中一条与其它植物的DR1基因具有较高同源性且上调表达的EST序列。通过RT-PCR方法从绥农10中克隆该基因,并构建到植物表达载体pCAMBIA3301上,以感病品种东农50的子叶节为外植体通过根癌农杆菌介导的方法进行大豆遗传转化。【结果】该基因全长805 bp,开放读码框为471 bp,编码156个氨基酸,在此命名为SDR1。遗传转化获得转基因PCR鉴定阳性植株5株,Real-time PCR检测T1转基因植株较非转基因植株SDR1表达量提高20倍以上的有3株,经Southern杂交分析表明,出现杂交信号的有3株。经离体叶片接种大豆疫霉菌,转基因大豆的抗性较非转基因大豆明显提高。【结论】成功克隆了大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1,并通过对过量表达的大豆转基因植株的抗病性鉴定初步确定了SDR1的抗病功能。     

兼抗虫、除草剂、干旱转基因玉米的获得和鉴定

【目的】培育抗玉米螟、抗草甘膦、抗旱的转基因复合性状玉米种质。【方法】通过农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化法,把重组到同一植物表达载体的cry1AcM、epsps、GAT和ZmPIS转入玉米骨干自交系9801和齐319（Q319）,获得转基因植株。通过逐代除草剂筛选、分子检测和抗虫性鉴定,从大量转基因株系中优选出6个优良玉米株系。在此基础上,以非转基因自交系9801、Q319为对照,在严格控制条件下对6个转基因株系进行抗虫、抗除草剂和抗旱性检测。由于不同生长时期植株对玉米螟危害的敏感程度有差异,在抗虫性检测试验中,对不同生长阶段的转基因玉米的抗虫性,分别进行了田间和室内玉米螟接种试验,并以灌浆期玉米的籽粒和苞叶饲喂玉米螟幼虫检测其杀虫性。在草甘膦抗性鉴定试验中,对6叶期田间玉米植株喷洒大田除草用量的草甘膦溶液评估其应用价值;采用3倍应用剂量的草甘膦溶液喷施3叶期玉米植株测试其草甘膦耐受力。在抗旱性鉴定试验中,对10叶期玉米植株进行干旱胁迫处理,观测转基因植株的表型变化并测定光合作用和叶绿素荧光等参数。【结果】选择出6个遗传稳定的兼抗亚洲玉米螟、抗草甘膦和抗旱性提高的转基因玉米株系,其中株系L1-L3来自自交系9801,Q1-Q3来自自交系Q319。通过RT-PCR检测4个转基因的转录强度,证明它们在转基因植株中有效表达;利用Western blot方法检测cry1Ac蛋白的表达水平,确定其在玉米植株中稳定表达。植株抗虫性鉴定结果显示这6个株系在玉米营养生长期和灌浆期的抗虫能力均显著高于未转基因自交系。在草甘膦抗性测试中,转基因植株表现出明显高于未转基因自交系的草甘膦抗性。在干旱控水期间,转基因植株能维持较强的光合能力和光系统Ⅱ活性,对干旱胁迫的抗性显著高于对照植株。【结论】将cry1AcM、epsps、GAT、ZmPIS一同转入玉米,赋予了植株抗玉米螟、抗除草剂草甘膦特性,提高了植株的抗旱性,达到生产中应用标准。培育出具有优良复合性状的转基因玉米新材料。     

农杆菌介导的2mG_2-epsps基因转化玉米自交系18-599R幼胚的研究

【目的】对农杆菌介导的抗草甘膦新基因2 mG2-epsps转化玉米18-599R幼胚的体系进行优化,以获得具有明显草甘膦抗性的转基因植株。【方法】以玉米18-599R幼胚为受体,采用农杆菌介导法,对转化时的预处理条件、菌液浓度×浸染时间、草甘膦筛选浓度设置处理,以优化转化体系;并用PCR、实时荧光定量PCR和喷洒草甘膦鉴定外源基因在转基因植株中的表达情况。【结果】热激处理对抗性愈伤率没有明显的提高作用,离心处理会降低抗性愈伤率;菌液浓度为OD600=0.6,浸染时间为10 min时,平均抗性愈伤率最高,为37.33%;草甘膦浓度为2.0mmol/L是比较理想的筛选浓度;实验共得到46株再生植株,5株PCR检测呈阳性,阳性率为10.87%;实时荧光定量PCR表明外源基因在T2代植株的根、茎、叶中均有表达;对T2代转基因植株喷洒1.5g/L的草甘膦,表现出耐受性。【结论】实验成功将2 mG2-epsps导入18-599R基因组,并获得了明显的草甘膦抗性。     

转cry1C~*籼型抗虫节水抗旱稻的获得及鉴定

通过农杆菌介导的遗传转化方法,将cry1C*基因导入籼型节水抗旱稻品种‘旱恢3号’中。通过对Basta抗性植株的PCR筛选和Southern检测证实,cry1C*基因已整合到受体品种中;田间自然感虫试验显示,转基因植株对稻纵卷叶螟具有明显的抗性。     

小麦大龄幼胚再生性能改进与农杆菌转化

 【目的】小麦幼胚再生率与幼胚大小关系密切,改进小麦大龄幼胚再生性能促进小麦转基因研究。【方法】以18个普通小麦基因型和5个硬粒小麦基因型为材料,对其开花授粉后15—17 d的大龄幼胚进行破碎处理、组织培养和农杆菌转化,对转化后的幼胚组织和获得的抗性再生植株分别进行组织化学染色检测和PCR检测。【结果】大龄幼胚培养2 d后破碎处理的再生率为18.2%,显著高于完整胚对照(.7%),培养2 d后进行破碎处理的再生效果高于4和6 d后破碎处理;不同基因型小麦大龄幼胚破碎处理后再生率为16.9%—46.7%,其中,Bobwhite和中8423大龄幼胚再生率达到了40%以上;大龄幼胚破碎后在弱光条件下培养,再生率进一步提高,较对照(完整胚黑暗培养)提高5.4%—47.4%;农杆菌侵染后GUS瞬时表达率为0—76.7%,其中科农199高达76.7%,其次为Verry(64.4%)和Alondra(47.2%);经PCR检测,农杆菌转化小麦大龄破碎幼胚获得了候选转基因植株。【结论】破碎处理和弱光培养显著提高了小麦大龄幼胚再生率,比对照提高5—10倍;科农199、Verry和Alondra大龄幼胚对农杆菌侵染比较敏感,适宜作为农杆菌转化的受体材料;农杆菌转化小麦大龄幼胚可以获得转基因植株。     

甜高粱玉米螟虫害调查及防治技术研究

对甜高粱田内玉米螟进行了调查,并研究了不同药剂对其的防治效果。结果表明,甜高粱玉米螟以在1节内或钻过1节为害为主,且主要为害第6～8节。在成熟期,处理1和处理2的株高、生物产量和锤度均显著高于对照,透孔数显著低于对照;处理2的防治效果最好,增产率达18.77%。在天津甜高粱产区,可在心叶末期,用0.1%氯氟氰菊酯颗粒剂拌10倍细炉渣撒入心叶防治玉米螟。     

干旱胁迫下小麦（Triticumaestivum L.）幼苗中ABA 和IAA的免疫定位及定量分析

【目的】干旱是农业生产中存在的严重问题,是制约作物生长和限制农业种植面积进一步扩大的最主要因素,探明植物抗旱机理,将为农业增产增收提供重要保障。本试验旨在分析干旱胁迫下小麦幼苗中（根、叶鞘、叶片）脱落酸（ABA）和吲哚乙酸（IAA）的定位及含量,探索其动态变化规律,为干旱地区作物栽培的激素调控、干旱条件下小麦的化学调控提供理论依据。【方法】以冬小麦品种鲁麦21号为材料,采用温室盆栽自然干旱法,以免疫组织化学定位方法研究干旱胁迫下小麦幼苗（根、叶鞘、叶片）中内源激素ABA和IAA的定位,并用间接酶联免疫吸附测定法（icELISA）进行内源ABA和IAA含量分析。通过比较免疫组织化学定位的化学信号强度和icELISA检测的内源ABA和IAA含量,验证本试验结果的有效性。【结果】称重法控制水分持续干旱4周后,对照组（CK）小麦植株直立生长,叶片健康呈绿色,长势良好。干旱处理组（ND）小麦植株矮小,叶片面积减小,有不同程度的萎蔫和发黄现象。干旱胁迫下小麦幼苗根、叶鞘、叶片中的ABA免疫组织荧光信号均强于对照,其中叶片强弱差异最显著,叶鞘次之,各器官中保卫细胞和维管的强弱对比最为明显;IAA免疫荧光信号强度也高于对照,但相比ABA不明显;用icELISA进行定量分析,比较免疫组织化学定位的信号强度和icELISA检测的内源激素含量表明,上述免疫组织化学定位结果与icELISA的测定结果相一致,其中,根中的ABA含量为61.51 ng•g-1 FW,是对照的2.82倍（21.8 ng•g-1 FW）;叶鞘中ABA含量增加幅度较大,为175.35 ng•g-1 FW,是对照的3.65倍（48.02 ng•g-1 FW）;叶片中ABA含量增幅最大（512.12 ng•g-1 FW）,为对照的10.16倍（50.42 ng•g-1 FW）。显著性分析表明,干旱胁迫与正常供水小麦幼苗根、叶鞘、叶片中ABA含量差异均呈极显著（P＜0.01）。用icELISA对IAA进行检测,正常供水时,小麦幼苗根、叶鞘、叶片中的IAA含量分别为72.81、274.46 和195.75 ng•g-1 FW。水分胁迫条件下,IAA含量增加但幅度不大,分别为123.56、400.48 和417.30 ng•g-1 FW。叶片中IAA上升的幅度稍大为对照的2.13倍,根、叶鞘中的IAA含量分别为对照的1.70和1.46倍。显著性分析（t检验法）显示,在干旱胁迫与正常供水条件下小麦幼苗根中IAA含量差异不显著（P＞0.05）,但叶片和叶鞘中IAA含量差异极显著（P＜0.01）。【结论】水分胁迫下小麦幼苗根、叶鞘、叶片中ABA和IAA含量均增加,ABA含量增加幅度较大,IAA较ABA含量增加幅度较小。二者之间协调的总趋势是向着气孔关闭,促进根系生长,减缓茎叶生长速率的方向发展,可有效的避免缺水伤害。     

建立甜高粱(Sorghum bicolor)高频、高效再生体系的研究

【目的】建立能源植物甜高粱(Sorghum bicolor L.Moench)的高频、高效离体培养再生体系,为遗传转化奠定基础。【方法】以甜高粱品种凯勒的芽顶端分生组织为外植体,探讨在甜高粱直接诱导丛生芽的培养过程中,无菌实生苗的适合苗龄,适宜的激素组合与比例;并将获得的最佳培养方法应用于其它两个甜高粱品种:M-81E和意达利,以研究此途径的基因型依赖性。【结果】利用3d苗龄的芽顶端分生组织作为外植体容易获得较高的分生组织膨大率。甜高粱丛生芽诱导的适宜激素组合为4.0mg·L-16-苄基腺嘌呤+0.5mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸+0.5mg·L-1噻重氮苯基脲,可获得91%的丛生芽诱导频率。适合甜高粱快速生根的激素配方为0.5mg·L-1萘乙酸。通过芽顶端分生组织直接诱导丛生芽途径,每个外植体可诱导出上百个芽,最终产生30—40株再生苗。M-81E和意达利具有与凯勒相似的丛生芽诱导频率及效率。【结论】本研究成功地建立了甜高粱的高频、高效离体培养再生体系,且具有外植体来源不受限制,基因型依赖性弱,遗传稳定性好的优点。     

苏丹草诱集带对玉米田亚洲玉米螟的诱集效应

[目的]以新疆近年来引进种植的优质牧草苏丹草作为诱集植物,探讨不同播种方式对亚洲玉米螟的诱集效应,为玉米螟治理的生态调控技术提供科学依据.[方法]通过在玉米田以不同播种期、不同密度播种苏丹草诱集带和玉米-苏丹草同行混作以及不同品种的玉米田种植苏丹草诱集带等方式对玉米田的亚洲玉米螟发生、为害情况进行比较,明确苏丹草诱集带对玉米螟的生态调控作用.[结果]5月2日、5月27日和6月14日三个不同播种期的苏丹草诱集带对降低玉米田亚洲玉米螟为害率都有显著作用,效果达14.29;～100;;以不同密度播种的苏丹草诱集带和苏丹草-玉米按不同比例同行混作对亚洲玉米螟的诱集效果不显著;玉米螟为害甜玉米美糯2号的程度显著高于普通饲料玉米SC704.[结论]尽管美糯2号甜玉米田的苏丹草诱集带对玉米螟的诱集率较SC704普通饲料玉米田显著高9.4;,但苏丹草的诱集作用对减轻玉米受害程度在玉米品种间并无显著差异.     

过量表达棉花GhSAP1提高转基因烟草的耐盐性

【目的】SAP（stress-associated protein）是一类涉及胁迫应答和调控的锌指蛋白。克隆并分析其对逆境胁迫应答的反应,为棉花抗逆育种提供候选基因。【方法】通过电子克隆方法并经RT-PCR验证获得棉花锌指蛋白基因GhSAP1,将带有目的基因的载体质粒通过PEG介导转化棉花叶肉原生质体细胞,瞬时表达分析其编码蛋白的特性及亚细胞定位信息。通过qRT-PCR技术分析目标基因的组织表达特征及非生物胁迫条件下的表达特性。通过农杆菌介导叶盘转化法,经组织培养获得转基因烟草进行异位表达,检测其与抗逆相关的生理指标,证明其提高植物抗逆能力。【结果】GhSAP1 ORF长度为543 bp,编码一条含180个氨基酸残基的多肽。其理论等电点8.97,分子量19.3 kD,具有典型的A20/AN1锌指结构域。亚细胞定位显示该基因编码的蛋白定位于细胞核上。不同组织器官表达分析显示,GhSAP1在根、茎、叶中的表达量高,而在开花后5 d的胚珠中表达量很低。GhSAP1受盐胁迫诱导,高盐处理2 h后表达量最高。利用含100 μg•mL-1 Kan的培养基进行抗性筛选转基因后代,结合目标基因的PCR与RT-PCR验证,获得转GhSAP1的转基因烟草阳性株系10个。目标基因GhSAP1均能在烟草基因组中整合并异位过量表达。随机选择3个转基因烟草株系,盐胁迫处理显示,发芽一周的种子在含200 mmol•L-1 NaCl培养基上胁迫12 d,转基因植株幼苗平均成活率为81.7%,比非转基因对照植株增加近3倍,其平均根长为3.05 cm,极显著高于非转基因对照。利用GhSAP1表达较高的L2纯系进行成株期烟草盐胁迫处理30 d,转基因烟草后代的SOD活性和可溶性总糖含量增幅分别为23.89 U•g-1 FW和8.37 %,均显著高于非转基因对照;与未胁迫处理相比,转基因植株的叶绿素含量降低幅度仅为0.17 mg•g-1 FW,而非转基因对照降低了0.39 mg•g-1 FW;盐胁迫处理后,转基因植株的MDA含量增幅为7.42 nmol•g-1FW,而非转基因对照增幅达20.85 nmol•g-1FW;在盐胁迫下,转基因植株具有更强的K+根部运输到植株绿色组织能力,其地上部的K+/Na+为1.23,显著高于非转基因对照。【结论】GhSAP1在参与植物的逆境应答反应机制中具有重要作用,过量表达GhSAP1可显著提高转基因烟草的耐盐能力。     

转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究

构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。T0和T1代植株的分子检测结果证明了外源基因已经整合到玉米基因组中并能够稳定遗传和表达,转基因株系在田间生物活性检测中表现出较好的抗虫性,这为培育抗虫玉米新品种提供了参考,同时本研究中采用了基因枪片段转化法,提高了转基因的生物安全性。     

甜高粱蔗糖积累与茎秆中SPS表达的相关性研究

 【目的】以甜高粱为原料生产酒精作为替代能源近年来引起人们的广泛关注,本文试图通过检测蔗糖合成的关键酶-蔗糖磷酸合成酶（SPS）在高粱叶片（源）与茎秆（库）中的表达量,了解高粱体内SPS表达与蔗糖积累的关系,进而探讨蔗糖的代谢机理。【方法】以甜高粱和普通高粱为材料,利用Western blot技术对SPS的蛋白质表达进行检测。【结果】在高粱的生长发育过程中,茎秆中蔗糖含量、叶片和茎秆中SPS蛋白质表达量持续上升,灌浆期达到最高,腊熟期略有下降,它们之间的变化趋势基本一致,甜高粱茎秆蔗糖含量与叶片SPS蛋白质的表达相关系数为0.895,与茎秆SPS蛋白质的表达相关系数为0.781;甜高粱和普通高粱相比,其叶片中SPS表达量差别不明显,而甜高粱茎秆中SPS表达量明显高于普通高粱。【结论】蔗糖为高粱糖分的主要形式,蔗糖积累与叶片和茎秆中SPS的表达相关。在甜高粱中,蔗糖积累主要与茎秆中SPS的表达相关。     

不同盐碱地对甜高粱农艺性状的影响

[目的]探索甜高粱在盐胁迫条件下各农艺性状的变化动态.[方法]以2种甜高粱品种为材料,研究不同盐分含量对2种甜高粱农艺性状的影响.[结果]2品种耐盐能力存在着明显的差异.从不同盐分含量的试验地,2品种的出苗率、茎粗、株高和生物产量的变化情况来看,新高粱9号比新高粱3号具有比较强的耐盐能力.2品种在不同盐碱地含糖量差异不一致,新高粱3号含糖量高于新高粱9号.[结论]盐分含量对甜高粱各农艺性状都有影响.研究甜高粱耐盐能力对盐碱化地区甜高粱栽培与种植具有很大的意义.