台兰 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化

[目的]建立台兰稳定可靠的ISSR-PCR分子标记反应体系。[方法]用改良的CTAB法提取叶片的基因组DNA,并对影响台兰ISSR-PCR反应体系的主要成分进行筛选和优化。[结果]台兰的ISSR-PCR优化反应体系为:25μl PCR反应体积中,2.5μl 10×PCR buffer,2.0 mmol/L MgCl2,100 ng模板DNA,0.5 mmol/L dNTPs,0.22 U Taq DNA聚合酶,0.4μmol/L引物,15.78μl双蒸水。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,然后进行40个循环:94℃变性30 s,复性温度根据各引物的TM值略低1~2℃,30 s,72℃延伸50 s,循环结束后72℃延伸7 min。[结论]台兰ISSR-PCR优化反应体系为今后利用ISSR技术进行台兰种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

人参SRAP-PCR体系优化条件的建立（摘要）

[目的]研究人参基因组SRAP-PCR的扩增条件,建立其优化扩增体系。[方法]采用单因子实验方法探讨模板DNA、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2＋浓度等因素对PCR结果的影响。[结果]优化后的扩增程序为：94℃预变性2min;94℃变性30s,48℃复性30s,72℃延伸1min,共40次循环;72℃延伸7min。最佳反应体系为：DNA模板30ng,上下游引物浓度2.0μmol/L,dNTP浓度0.3mmol/L,Mg^2＋2.5mmol/L,总体积25μl。[结论]建立了满足人参SRAP-PCR的优化扩增体系,为人参亲缘关系和遗传多样性SRAP分析提供快速、简便、重复性好的实验方法。     

人参SRAP-PCR体系优化条件的建立

[目的]研究人参基因组SRAP-PCR的扩增条件,建立其优化扩增体系。[方法]采用单因子实验方法探讨模板DNA、引物浓度、dNTPs浓度、Mg^2＋浓度等因素对PCR结果的影响。[结果]优化后的扩增程序为：94℃预变性2 min;94℃变性30 s,48℃复性30 s,72℃延伸1 min,共40次循环;72℃延伸7 min。最佳反应体系为：DNA模板30 ng,上下游引物浓度2.0μmol/L,dNTPs浓度0.3 mmol/L,Mg^2＋2.5 mmol/L,总体积25μl。[结论]建立了满足人参SRAP-PCR的优化扩增体系,为人参亲缘关系和遗传多样性SRAP分析提供快速、简便、重复性好的实验方法。     

荸荠基因组DNA的提取及RAPD反应体系的建立

以荸荠叶状茎为试验材料,采用改良的SDS法提取其基因组DNA,并对其RAPD反应体系进行优化,建立了荸荠的RAPD—PCR优化反应体系和程序。结果表明,提取的基因组DNA纯度和完整性较好,OD260/OD280值在1．8～2．0之间,DNA无降解现象,完全可以满足RAPD—PCR扩增要求。建立了荸荠RAPD反应体系：总体积为25μl,各有关成分的最佳浓度分别为25mmol／L Mg^2＋,1．0UTaqDNA聚合酶,0．2mmol／L dNTPs,1μmol／μl引物,1．5ng／μl DNA模板。PCR反应程序为：94％预变性3min;94℃变性1min,37℃退火30s,72℃延伸60s,40个循环;最后72％延伸10min。     

白木香基因组DNA的提取及ISSR反应条件的优化

[目的]以白木香为试验材料,研究基因组DNA提取方法,并优化ISSR-PCR反应体系。[方法]利用快速提取仪和微量液氮法提取DNA,并对ISSR-PCR反应体系进行单因素筛选。[结果]微量液氮法提取的DNA质量好于快速提取仪,但2种方法得到的DNA对后续ISSR研究没有明显的差异。同时,建立了最适的白木香ISSR-PCR体系,即25lμPCR反应体积中,1×PCR buffer,2.0 mmol/L MgCl2,4ng/μl模板DNA,200μmol/L dNTPs,1.1 UTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,然后进行45个循环,94℃变性45 s,复性温度根据各引物的TM值略低1~2℃,45 s,72℃延伸75 s,循环结束后72℃延伸7 min。[结论]优化系统的建立为进一步利用ISSR分子标记技术进行白木香遗传多样性研究提供了基础。     

建兰ISSR-PCR反应体系的建立和优化（摘要）（英文）

[目的]研究建兰[Cymbidium ensifolium（Linn.） Sw]总基因组DNA的提取方法,并对建兰ISSR-PCR反应体系进行优化,建立更为完善的反应体系。[方法]用改良的CTAB法提取叶片的基因组DNA,用1.0%琼脂糖电泳检测DNA质量;用分光光度计测定其纯度和浓度,DNA纯度以OD260/OD280的比值来估算,浓度估算法为：DNA浓度（ng/μl） =OD260×50×稀释倍数。计算DNA获得率（DNA量/所用叶片量×100%）。对建兰ISSR-PCR反应的4项影响因素（DNA模板、TaqDNA聚合酶、Mg2 ＋和dNTPs）逐个作5水平进行研究,以筛选最优的建兰ISSR-PCR反应体系。[结果]获得高质量的建兰基因组DNA,以及优化了的建兰ISSR-PCR反应体系,即25μl PCR反应体积中,2.5μl 10×PCR buffer,2.5 mmol/LMgCl2,240 ng模板DNA,160μmol/LdNTPs,1.25 UTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物,双蒸水15.78μl。最佳扩增程序为：94℃预变性5min,然后进行40个循环：94℃变性30 s,50 ～60℃退火（退火温度随引物不同而定） 30 s,72℃延伸50 s,72℃延伸7 min。[结论]建立了建兰ISSR-PCR反应体系最适合的条件,为进一步利用ISSR分子标记技术进行建兰遗传多样性研究提供了基础。     

蕙兰ISSR-PCR反应体系的建立和优化（英文）

[目的]以蕙兰（Cymbidium faberi Rolfe）基因组DNA为模板,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素进行筛选和优化,建立适合蕙兰的ISSR-PCR的最佳反应体系。[方法]利用改良的CTAB法提取蕙兰基因组DNA,并对影响ISSR-PCR扩增结果的因素进行优化。[结果]获得了高质量的蕙兰基因组DNA并建立了最适的蕙兰ISSR-PCR体系（25μl）,即2.5μl10×PCRbuffer,2.0mmol/LMgCl2,60ng模板DNA,160μmol/LdNTPs,1.25UTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物,双蒸水15.85μl;最佳扩增程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s,复性温度比引物的Tm值低2～3℃,30s,72℃延伸50s,40个循环;72℃延伸7min。[结论]该优化体系的建立可为今后利用ISSR标记技术进行蕙兰遗传多样性研究提供依据。     

正交设计优化番茄基因组DNA SSR-PCR反应体系

以21份番茄品种为材料,应用正交试验设计对影响番茄SSR—PCR的主要参数进行优化,建立适于番茄的SSR反应体系和扩增程序。在15μl体系中各反应的最适合含量为：2．5μl ddH2O,1μl 40ng模板DNA,3μl 200μmol／L dNTP,3μl 0．8μmol／L SSR引物,0．1μl 0．5U／μl Taq DNA聚合酶,1．5μl 10×PCR Buffer,0．9μl 1．5mmol／L MgCl2。PCR适宜扩增程序为：94℃预变性2min;94℃变性1min,45℃退火25s,共35个循环;68℃延伸25s,68℃延伸10min,然后4℃保存。利用此反应体系对21个番茄品种进行PCR扩增并电泳检测,扩增结果清晰且有较高的多态性,表明该体系适合番茄的遗传多样性研究。     

马齿苋ISSR-PCR反应体系与反应条件的优化

[目的]优化马齿苋ISSR-PCR反应体系与反应条件。[方法]以马齿苋为试验材料,采用改良的CTAB法提取总DNA,对ISSRPCR引物进行筛选,同时进行ISSR-PCR反应体系和反应条件的优化,电泳检测ISSR-PCR产物。[结果]8个ISSR引物适合马齿苋的ISSR-PCR分析;最适反应体系为总体系25.0μL,其中2×Taq Platinum PCR Master Mix 12.5μL,10μmol/L引物2.0μL,40 mg/L DNA模板1.0μL,dd H_2O 9.5μL;最适反应条件为94℃预变性360 s;94℃变性60 s,54℃退火60 s,72℃延伸90 s,30次循环;72℃再延伸300 s。[结论]建立了马齿苋ISSR-PCR扩增的最佳反应体系和扩增程序,为进一步研究马齿苋提供基础资料。     

龙眼ISSR反应体系的建立和优化

对影响龙眼ISSR-PCR扩增反应的各个参数进行优化,建立适合龙眼的ISSR反应体系:PCR反应体积为20μl,其中模板DNA 25ng,引物0.2μmol/L,dNTP 100μmol/L,Taq DNA聚合酶0.5U,MgCl2 2.5mmol/L,10×PCR缓冲液2.0μl;扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性1min,退火温度1min,72℃延伸90s,40个循环;72℃延伸7min。     

亚麻RAPD-PCR体系的优化及引物的筛选

[目的]优化亚麻RAPD反应条件,筛选亚麻RAPD引物。[方法]DNA条带扩增采用PCR技术,条带的分离采用琼脂糖凝胶电泳法,成像利用紫外成像系统。[结果]试验优化亚麻RAPD反应条件：25出反应体系中,含10×Buffer,Mg^2＋ （1mmol／L）,Taq酶1U,Genome DNA 50ng．dNTP 0．25mmol／L．RAPD primer1．5μmol／L。PER反应程序为：94℃预变性4min;97℃变性40s,37℃退火1min,72℃延伸90s,40个循环;72℃延伸10min。试验利用3个有代表性的亚麻品种从70条引物中筛选出12条多态性好,重复性高的引物。[结论]该试验筛选出12条引物,并优化了亚麻RAPD反应条件,为亚麻的分子鉴定奠定了基础。     

温郁金ISSR-PCR反应体系的建立及条件优化

[目的]寻找一个可用于温郁金ISSR-PCR的最适宜反应体系。[方法]利用CTAB法提取基因组DNA,同时利用PCR扩增技术和方法,对引物、模板DNA、Mg2+d、NTP、Taq聚合酶等反应条件进行优化。[结果]反应体系的最佳条件是总体积为25μl,其中Mg2+浓度(25mmol/L)2.2μl,Taq聚合酶(5 U/μl)0.4μl,引物浓度(20μmol/L)1.5μl,模板DNA(5 ng/μl)1.5μl,dNTP(2.5 mmol/L)2.2μl,10×PCRbuffer2.5μl;PCR扩增程序为:1个循环的94℃预变性5 min;94℃变性35 s,相对应的引物退火温度退火1 min,72℃复性1.5 min,共36个循环;最后72℃延伸10 min。[结论]该体系是适合温郁金ISSR-PCR反应的最适宜体系,具有省时、经济、简便以及扩增条带清晰而稳定等特点,为今后温郁金遗传多样性的研究奠定了基础。     

石鲽基因组DNA的提取及其RAPD体系的优化

[目的]研究石鲽基因组DNA的提取及其RAPD体系的建立和优化。[方法]以石鲽为试材,按常规酚/氯仿抽提法提取其基因组的DNA,对影响RAPD反应的各因素进行优化,建立了石鲽的最佳RAPD反应体系和程序。[结果]采用常规酚/氯仿抽提法获得的DNA完全能够满足RAPD分析的要求。通过优化建立一套适合石鲽的稳定的RAPD反应体系:反应体系总体积为25μl,包括10×buff-er2.5μl,MgCl22 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.2μmol/L,模板30 ng,Taq酶1 U。扩增程序为:94℃预变性5 min,45次PCR循环(94℃变性45 s,36℃退火45 s,72℃延伸2 min和72℃延伸10 min。利用该体系对OPK和OPV系列共40条引物进行扩增,发现其中部分引物能产生稳定、清晰的条带。[结论]该体系为石鲽遗传多样性以及相关分子标记的研究奠定了基础。     

荷包猪RAPD-PCR反应条件研究

[目的]建立适合荷包猪RAPD-PCR反应的最佳反应体系。[方法]以荷包猪为试验材料,以MgCl2浓度、引物浓度、dNTP浓度、模板DNA用量、TaqDNA聚合酶用量及退火温度为影响因子,在保持其他影响因子一致的条件下,变化单一因子,筛选最优参数,研究各影响因子对RAPD-PCR反应的影响。[结果]最佳反应体系的总体积为20.0μl,MgCl2浓度为2.5μmol/L、引物浓度2.0μmol/L、dNTP浓度400.0μmol/L、模板DNA为100 ng/μl、TaqDNA聚合酶为1.0 U。PCR反应程序:94℃预变性2 min(94℃变性1 min,36℃退火1 min,72℃延伸1 min,循环40次),72℃延伸5 min。此反应体系所扩增出来的结果比较稳定,带型清晰且亮度适中。[结论]该研究为应用RAPD技术对荷包猪作进一步的遗传分析奠定了基础。     

柑橘转基因成分多重PCR检测体系的建立(英文)

[目的]建立柑橘转基因成分的多重 PCR 检测体系。[方法]根据 GenBank 中 pBI121 质粒序列和柑橘(Citrus.)Actin 基因序列,分别设计CaMV35S 启动子、NOS 启动子、NOS 终止子特异引物和 Actin 基因的特异引物,建立能同时检测出 4 种序列的多重 PCR 检测体系,同时通过正交试验确定该体系的最佳引物浓度和比例及 PCR 反应体系中各因素的浓度及反应程序,并对该方法的灵敏度进行验证。[结果]试验得到的最佳MPCR 反应体系为:10×buffer 2.5 μl,25 mmol/L MgCl22.0 μl;dNTP Mixture (2.5 mmol/L each)2.0 μl,10 μmol/L 的 Actin 基因、35S 启动子、NOS 启动子、NOS 终止子引物分别加入 1.0、1.0、1.5、0.5 μl,模板 DNA 0.1 μg,Taq DNA 聚合酶 1.25 U,加 ddH2O 至 25 μl。PCR 反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s,64.1 ℃ 45 s,72 ℃ 50 s,31个循环;72 ℃ 10 min。试验中,经正交优化后的4重PCR反应灵敏度达0.1%。[结论]该研究建立的MPCR检测体系,理论上已能满足柑橘或其深加工产品的转基因成分检测。     

柑橘转基因成分多重PCR检测体系的建立

[目的]建立柑橘转基因成分的多重PCR检测体系。[方法]根据GenBank中pBI121质粒序列和柑橘(Citrus.)Actin基因序列,分别设计CaMV35S启动子、NOS启动子、NOS终止子特异引物和Actin基因的特异引物,建立能同时检测出4种序列的多重PCR检测体系,同时通过正交试验确定该体系的最佳引物浓度和比例及PCR反应体系中各因素的浓度及反应程序,并对该方法的灵敏度进行验证。[结果]试验得到的最佳MPCR反应体系为:10×buffer 2.5μl,25 mmol/L MgCl22.0μl;dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)2.0μl,10μmol/L的Actin基因、35S启动子、NOS启动子、NOS终止子引物分别加入1.0、1.0、1.5、0.5μl,模板DNA 0.1μg,Taq DNA聚合酶1.25U,加ddH2O至25μl。PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃30 s,64.1℃45 s,72℃50 s,31个循环;72℃10 min。试验中,经正交优化后的4重PCR反应灵敏度达0.1%。[结论]该研究建立的MPCR检测体系,理论上已能满足柑橘或其深加工产品的转基因成分检测。