紫花苜蓿几丁质酶基因MsChiⅣ克隆及序列分析

本研究根据截形苜蓿(Medicago truncatula)根部的几丁质酶基因保守序列(GenBank登录号:AF167328)设计引物,通过RT-PCR直接扩增的方法得到了紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)根部几丁质酶基因保守序列.根据得到的保守序列设计3'端和5'端特异引物,分别从3'端和5'端扩增延长该片段,最后通过序列拼接获得紫花苜蓿根部一种几丁质酶基因的全长cDNA序列,命名为MsChiⅣ(GenBank登录号:FJ487629).MsChiⅣ基因全长为1 025 bp,开放性阅读框全长为849 bp,编码282个氨基酸,分子量为30.5 kD,预测等电点为4.66,其结构包括信号肽、几丁质结合区、糖苷水解酶区,为Ⅳ类几丁质酶,属于几丁质酶第19家族,在氨基酸水平上与截形苜蓿几丁质酶蛋白同源性最高,达到98%.蛋白结构分析表明该基因编码蛋白为非跨膜蛋白,存在于细胞质中.     

柽柳MnSOD基因的克隆及功能验证

根据已克隆得到的柽柳MnSOD基因片段,采用RACE技术从柽柳中获得MnSOD的cDNA全长序列.该基因全长为1 087 bp.其中,5'非编码区40 bp,3'非编码区333 bp,开放读码框(ORF)长699 bp,编码232个氨基酸.分子量为26 KD,等电点为7.10.该MnSOD氨基酸序列与拟南芥MnSOD序列同源性最高为83%,从12个物种的序列比对可以看出MnSOD氨基酸序列保守性较高.该序列的Genbank注册号为AY573576(基因)和AAS77885(蛋白).将MnSOD基因与酵母表达载体pYES2连接,并进一步转化到酵母基因组中.对重组酵母INVSc1(pYES2-SOD)和对照INVSc1 (pYES2)进行干旱、高温胁迫实验.结果表明:重组酵母的抗干旱、高温能力明显高于对照,证实了来源于柽柳的MnSOD基因具有抗干旱和耐高温能力.     

疣粒野生稻金属硫蛋白(OMMT-2)基因的获得及序列分析

从疣粒野生稻叶片cDNA文库中分离出1个金属硫蛋白基因的cDNA序列,命名为OMMT-2。该基因全长532bp,其中5’非翻译区为111bp,3’非翻译区171bp,开放阅读框长249bp,编码82个氨基酸,该蛋白的分子量为7775.9,理论等电点为6.49;基因编码的氨基酸含有14个半胱氨酸(Cys),占了总氨基酸的17.07%,且集中分布在肽链的N端和C端,呈CXC和CXXC排列方式。疏水性分析表明,该蛋白在43~56个氨基酸之间有较强的疏水区。通过氨基酸序列分析表明,金属硫蛋白中半胱氨酸的位置和数目有较强的保守性,揭示了半胱氨酸对金属硫蛋白的功能十分重要。     

金花茶黄烷酮3-羟化酶基因CnF3H的克隆及表达分析

本研究利用反转录PCR和RACE方法,从中国珍稀濒危植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中获得了黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)基因的c DNA全长,命名为Cn F3H,Gen Bank登录号为HQ290517。碱基序列分析表明,该Cn F3H基因c DNA序列全长为1 360 bp,5'非翻译区(untranslated regions,UTR)长54 bp,3'UTR长202 bp,开放阅读框长为1 104 bp编码367个氨基酸。氨基酸序列比对分析表明,Cn F3H与茶(C.sinensis)F3H同源性高达99%。二级结构预测表明,无规则卷曲在Cn F3H蛋白结构中所占比例最大,其次为α-螺旋和延伸链。相对荧光定量PCR分析表明,Cn F3H基因的表达量在幼蕾期、初蕾期和膨大期的表达量较高,之后逐渐降低;Cn F3H基因在花器官不同部位中均有表达,其表达量高低顺序为雄蕊、花瓣、萼片、雌蕊和苞片。本研究为全面深入地研究金花茶花色形成的分子调控机理提供了充实的理论依据。     

胡杨耐盐基因PeuHKT1的克隆与表达分析

阳离子转运载体HKT(high-affinity K~+transporter)类蛋白既是高亲和的K~+转运载体,也是一种Na~+转运体,具有Na~+和K~+转运的双重功能,对调节细胞内Na~+/K~+动态平衡起着决定性作用。胡杨长期生长在盐渍化和干旱的土壤环境,对高盐和干旱形成了极强的适应能力,是典型的耐盐抗旱植物,成为研究多年生林木抗逆适应机制的理想材料。以胡杨根系为材料,本研究克隆鉴定了一个胡杨Peu HKT1基因,该基因含有3个外显子和2个内含子;其c DNA全长为1 076 bp,包括13 bp的5'端非翻译区(5'UTR)和232 bp的3'端非翻译区(3'UTR);长831 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)可编码276个氨基酸;其编码蛋白含有丰富的α-螺旋,存在多个跨膜结构域,蛋白质相对分子量(MW)为31.54 k D;理论等电点(p I)9.36;实时定量PCR技术构建了Peu HKT1基因在高盐胁迫条件下的动态表达模式,探讨了该基因参与胡杨高盐胁迫响应的信号转导途径。     

琯溪蜜柚果肉过氧化物酶cDNA的克隆及序列分析

以琯溪蜜柚果肉为材料,运用cDNA克隆的方法,克隆得到了琯溪蜜柚果肉过氧化物酶的cDNA的全长,并对得到的序列进行了一些分析,从分子生物学角度对粒化的研究做了初步的探索。结果表明:琯溪蜜柚果肉PODcDNA全长1263bp,有完整的阅读框,编码351个氨基酸。另外5'非翻译区42bp,3'非翻译区168bp(不包含终止密码子TAA),其中包括一个多聚腺苷酸化信号AATAAA,以及一个含24个腺苷酸的poly(A)尾。由琯溪蜜柚果肉PODcDNA推导的氨基酸序列与无花果(Fi-cuscarica)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、杨属植物(Populus)等同源性较高,分别为:58.6%,67.61%,65.24%,67.14%等。     

青稞hblt14．2基因的克隆及功能分析

根据大麦blt14.2基因序列设计引物,用青稞基因组DNA为模板扩增低温反应基因的全长序列,命名为hblt14.2,在GenBank登录号为EF514912.该基因含470 bp,包括249 bp的开放阅读框、69 bp的5'非翻译区和152 bp的3'非翻译区,编码82个氨基酸残基,富含G1y、A1a、Leu和Va1,与其他冷诱导基因编码蛋白具相似性.与大麦bit14.2基因具98.9%同源性,所编码的蛋白存在2个氨基酸的差别.将hblt14.2基因连接CaMV35S启动子和NOS终止子后定向插入质粒pCAMBIA1301的多克隆位点中,构建植物表达载体pCAMBIA-BI-hblt,通过农杆菌介导转化烟草,并对转基冈烟草进行抗寒性检测.结果表明,青稞hblt14.2基因与植物的抗寒性有一定关系.     

金花茶CnLCYE基因cDNA克隆及表达载体构建

利用RT-PCR和RACE技术,从珍稀观赏植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中克隆得到了一个番茄红素ε-环化酶(lycopeneε-cyclase,LCYE)基因c DNA全长,命名为CnLCYE。碱基序列分析显示,CnLCYE基因全长2 149 bp,包含291 bp的5'非翻译区(untranslated regions,UTR)、265 bp的3'UTR和1 593 bp编码530个氨基酸的开放阅读框。该基因编码的蛋白质含有2个跨膜结构域,一个NADB_Rossmann superfamily结构域以及番茄红素ε-环化酶结构域(PLN02697)。CnLCYE蛋白二级结构以无规则卷曲为主,其次为α-螺旋,β-折叠所占比例最少。氨基酸序列比对分析结果显示,CnLCYE与茄科、蔷薇科等植物LCYE蛋白同源性都在70%以上,与普洱茶(Camellia sinensis var.assamica)LCYE同源性最高。根据该CnLCYE全长序列设计带有KpnⅠ和Bam HⅠ位点的全长扩增引物扩增基因全长,用KpnⅠ和Bam HⅠ双酶切后与表达载体p CAMBIA1300连接,成功构建了CnLCYE基因的正义表达载体,为深入研究CnLCYE基因的功能及其对花色的调控作用提供了帮助。     

灵芝金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和3′-RACE相结合的方法获得了灵芝（Ganoderma lucidum）金属硫蛋白的cDNA序列。该序列全长为315bp,5′-端非翻译区为47bp,3’端非翻译区具有166bp,开放阅读框长度为102bp（包括一个终止密码子）,可编码33个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸（Cys）含量最高,占21.2%,其次是丝氨基酸Ser(S)和丙氨基酸Ala(A),均占12.1%。对其编码的氨基酸序列进行分析发现该序列具有金属硫蛋白的保守序列模式,是金属硫蛋白家族的成员。     

三色堇4,5-多巴雌二醇双加氧酶基因的克隆及生物信息学分析

本实验以三色堇(Viola wittrockiana)的花瓣为研究材料,提取其总RNA,通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术扩增4,5-多巴雌二醇双加氧酶(4,5-DOPA dioxygenase extradiol)基因的cDNA全长,并对其进行生物信息学分析。本实验成功克隆VwDODA的cDNA全长1 055 bp,其中3'端非编码区157 bp,包含29 bp Poly(A),5'端非编码区103 bp,其开放阅读框为795 bp,编码263个氨基酸。通过NCBI的BLAST比对表明VwDODA编码的氨基酸序列与其他植物相关基因的相似性达到80.29%,与大豆(Glycine max)亲缘关系最近。通过生物信息学分析软件对VwDODA的蛋白质结构与功能进行预测,结果表明Vw D-%ODA是一种亲水稳定蛋白,不存在跨膜区域和信号肽,分子式为C1337H2026N356O384S7,等电点为6.70,分子量为29 455.37。本研究为将来三色堇中甜菜色素与花色素的互斥现象研究打下了基础。