根癌农杆菌介导获得粳稻转基因植株研究

以水稻粳稻品种空育131、垦鉴稻6号、垦鉴稻7号为材料,用根癌农杆菌感染成熟胚诱导的愈伤组织,将反义蜡质基因导入受体材料。经两次抗性筛选后,转入分化培养基中分化培养后获得转基因小苗。将转化植株进行GUS染色、PCR鉴定,能证明外源目的基因已经整合到植株中。     

根癌农杆菌介导获得粳稻转基因植株

以水稻粳稻品种空育131、垦鉴稻6号、垦鉴稻7号为材料，用根癌农杆菌感染成熟胚诱导的愈伤组织，将反义蜡质基因导入受体材料。经两次抗性筛选后，转入分化培养基中分化培养后获得转基因小苗。将转化植株进行GUS染色、PCR鉴定，能证明外源目的基因已经整合到植株中。     

运用农杆菌介导法将PTA和反义Wx双基因导入水稻的研究

利用根癌农杆菌将含多基因(hyg选择标记基因、反义Wx 基因、PTA基因、GFP和GUS报告基因)的pCAMBIA1304载体导入水稻品种(501R、中花9号和日本晴)的幼胚愈伤组织,分别在含35mg/L、45mg/L和65mg/L潮霉素浓度的筛选培养基上筛选获得抗性愈伤。后经PCR检测,从415株T0代再生植株中选出92株(其中501R、中花9号和日本晴分别为4株、43株和45株)。对这些转基因后代植株进行Southern blotting分析表明：hpt、反义Wx 和 PTA基因已经整合进植物基因组中,绝大多数转基因植株后代的表型正常。成熟种子直链淀粉含量分析表明,部分转基因植株的T1代种子中的直链淀粉含量有部分程度的下降,最低的已下降至6.3%,与对照相比下降了9.8%。     

利用农杆菌介导法将反义Wx基因导入水稻的研究

利用根癌农杆菌将含多基因(hpt选择标记基因、反义Wx基因、GFP和GUS报告基因)的pCAMBIA1304载体导入水稻品种(501R、中花9号和日本晴)的幼胚愈伤组织,分别在含35mg/L、45mg/L和65mg/L潮霉素浓度的筛选培养基上筛选获得抗性愈伤。后经PCR检测,从415株T0代再生植株中选出92株(其中501R、中花9号和日本晴分别为4株、43株和45株)。对这些转基因后代植株进行Southern blotting分析表明：hpt、反义Wx基因已经整合进植物基因组中。绝大多数转基因植株后代的表型正常。成熟种子直链淀粉含量分析表明,部分转基因植株的T1代种子中的直链淀粉含量有不同程度的下降,最低的已下降至6．3％,与对照相比下降了9．8％。     

CryIA(a)-pta双价抗虫基因转化粳稻及二化螟抗性评估

向作物中转多价抗虫基因是增强作物抗虫性、拓宽抗虫谱、延长抗虫时限的有效措施。从粳稻品种吉粳81、吉粳88和通887的成熟胚诱导出愈伤组织,以愈伤组织作为转化的受体,利用农杆菌介导法,转化苏云金杆菌毒蛋白基因CryIA(a)和半夏凝集素(Pinelliaternataagglutinin,PTA)基因。表达双价抗虫基因的载体p3300-bt-pta的bt和pta分别由Ubiquitin启动子和CaMV35S启动子驱动,宿主菌株为EHA105。用除草剂草丁膦(PPT)筛选得到转基因植株25株。以bt基因和pta基因两端序列为引物在一个反应体系同时做2个基因的PCR检测,检测到bt、pta基因的2条带,Bar基因的PCR检测也显阳性。转化株对PPT除草剂抗性鉴定呈抗性,证明外源基因已整合到水稻基因组中。水稻二化螟接虫鉴定结果表明,23株转基因植株抗虫性比对照明显提高,2株表现感虫。     

基因枪介导抗除草剂基因2mG2-epsps转化玉米的初步研究

本研究以优良玉米自交系X2211和78599的幼胚胚性愈伤组织为受体材料,采用基因枪介导法将抗除草剂基因2mG2-epsps导入玉米胚性愈伤组织,经草甘膦(glyphosate)筛选,产生抗性愈伤组织并获得320株再生植株,通过喷施除草剂筛选,有65株表现良好的耐除草剂特性。PCR分析表明,其中的7株表现PCR阳性,初步证明2mG2-epsps基因整合到玉米基因组中,平均转化率为2.2%。同时研究了金粉用量和轰击距离对玉米基因枪转化效率的影响。转化时以金粉用量100μg/枪,发射点与靶细胞距离60mm最佳。     

提高农杆菌介导法将PinII抗虫基因导入滇型水稻的转化效率

本论文对滇型水稻品种玉优一号、HT-7的愈伤组织诱导、基因转化及植株再生进行了研究。通过实验，将质粒pCAMBI1300上带有的PinⅡ抗虫基因导入水稻愈伤组织细胞中，获得了一批Hyg抗性植株。185株抗性苗经过PCR检测和叶片对潮霉素的抗性试验，证明其中有59株为转基因阳性植株。结果显示，受体、农杆菌状态以及共培养方式等是影响基因转化效率的关键因素；以叶片对潮霉素的抗性作为转基因植株的快速筛选是可行的，大大提高了检测效率。     

通过基因枪和农杆菌介导用BADH基因转化小麦

土壤盐碱是一种严重障碍作物生产的环境因子,甜菜碱醛脱氢酶BADH基因是一种重要的可赋予植物渗透调节抗性的基因。本研究用基因枪法及农杆菌介导法向小麦幼胚和成熟胚愈伤组织导入了BADH基因。用PDS-1000／HE基因枪轰击2933块幼胚愈伤组织,分化出了45株再生植株,分化率为1．53％。PCR分析表明,其中的5株为BADH基因转化植株。用PPT涂抹其叶片,进一步证实了PCR的结果。以小麦成熟胚愈伤组织为受体,用农杆菌介导转化1968块愈伤,仅再生出了5株绿苗,PCR检测结果均为阴性。但对其转化愈伤组织的PCR检测表明,外源基因已在受体细胞中实现了整合。以幼胚愈伤组织为受体,用农杆菌介导转化2933块愈伤,共再生出了21株绿苗。对其进行PCR检测,仅有5株为BADH基因转化植株。转化处理过的幼胚愈伤组织的绿苗再生率（0．72％）高于成熟胚愈伤（0．25％）。与对照相比,所有的转化植株均能够在0．5％NaCl（w／w）条件下正常生长,表明外源BADH基因已经整合并表达。     

基因枪介导法向小麦导入黄花叶病毒复制酶基因的研究

筛选出适宜小麦转化的优良基因型扬麦158和扬麦10号.以扬麦158幼胚愈伤组织为受体,利用基因枪介导法将含有小麦黄花叶病毒复制酶基因(WYMV-Nib8)的pubiNib8质粒转入了小麦.T0代经PCR扩增分析,获得了14株含WYMV-Nib8基因的转化植株,转化率为0.43%.T1、T2代跟踪分子检测和T2代田间病毒抗性鉴定结果表明,获得了4个抗WYMV的转基因     

农杆菌介导水稻BADH2基因RNA干涉表达载体的转化

利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导将水稻BADH2的RNAi载体导入多个水稻品种幼胚、成熟胚诱导的愈伤组织。试验表明，不同外植体来源影响愈伤组织的诱导和转化，并且愈伤组织的诱导和转化效果受基因型的影响。在农杆菌转化过程中，潮霉素和除草剂都是较好的筛选剂，前者筛选所得的抗性愈伤分化成苗所需时间较短；但后者筛选所得的抗性愈伤形成的苗更健壮。T0代PCR检测表明，通过转化确已获得一定数量的转基因植株。     

农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因sb401导入水稻

培育高赖氨酸的水稻品种是提高稻米营养品质的重要途径。本研究利用农杆菌介导法将水稻胚乳特异表达启动子PGlu驱动的马铃薯花粉特异水溶性蛋白基因sb401导入粳稻品种日本晴和籼稻恢复系501R的幼胚愈伤组织中,以期提高水稻胚乳中赖氨酸的含量。经PCR检测,从70株T0再生植株中筛选出18株转基因植株(日本晴13株,501R5株)。对转基因植株的Southern blotting分析表明,sb401基因已经转入并整合进了水稻基因组中。测定10株T0代转基因植株成熟种子的总蛋白含量和赖氨酸含量,结果表明,有8株的总蛋白含量,5株的赖氨酸含量皆提高了20％以上;其中,8号样品(日本晴转基因植株)的种子总蛋白含量和赖氨酸含量分别为10．5％和0．383％,与对照相比分别提高了32．74％和35．34％,表明sb401基因在大部分转基因植株中的翻译水平上得到了比较有效的表达。     

高效的水稻基因枪转化和可育转基因植株再生

从水稻品种台北309成熟胚诱导生长3~4周的愈伤组织,经过1~3次继代培养后,可以形成大量颗粒状胚性愈伤组织,适用于基因枪转化实验。将分别含有雪花莲凝集素(GNA)基因、h pt基因的质粒pIP860和p35H混合包裹在金粉上轰击转化上述胚性愈伤组织,在含30~50mg/L潮霉素的培养基上进行筛选、预再生、再生及长根培养。使用干燥处理     

根癌农杆菌介导获得稗草Ecppc转基因小麦的研究

采用携带pUbi-Ecppc质粒的3个根癌农杆菌菌株（LBA4404、EHA105和C58c1）,对经过预培养10~12 d的春小麦品种扬麦158、Bobwhite和扬麦12的幼胚愈伤组织进行了遗传转化。对筛选中的抗生素浓度、菌液浓度、共培养温度和时间、受体基因型、菌株-质粒组合等影响转化的重要因素进行了研究。首次将单子叶野生C₄植物稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（Ecppc）导入小麦受体基因型,并得到具有潮霉素（Hyg）抗性的转化植株。从816块共培养愈伤组织中转化得到34株抗性植株,其中14株PCR检测为阳性。扬麦158的转化效率达3.03%。Southern和RT-PCR分析表明外源基因已整合到小麦基因组并得到正确的转录。生理学检测显示,转基因小麦植株的光合速率和PEPC活性都有所提高。说明Ubiqintin基因启动子控制的稗草PEPC cDNA基因在小麦中可以正确表达和起到一定的生理作用。这些工作为进一步探讨PEPC对小麦光合作用及其他生理过程的影响奠定了基础。     

广谱抗稻瘟病基因Pi9对籼稻的转化研究

通过农杆菌介导法，将由CaMv35s启动子启动的广谱抗稻瘟病基因Pi9转入5个籼稻品种（丰源B、湘晚籼13号、R996、527、1701）的愈伤组织中，所用质粒为pCAMBIA1301，pCAMBIA1301的T-DNA区含有潮霉素（hygmycin）抗性基因和β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因。以潮霉素作为筛选剂对籼稻愈伤组织进行筛选，结果表明，不同品种在转化过程中抗性愈伤率在73．9％～83．3％之间，获得的部分抗性苗经PCR检测为阳性，阳性植株的转化率差异显著，其转化率为5．7％～25．9％之间，对获得的抗性苗和T2代幼苗的根和叶进行GUS组织化学染色分析，有些抗性苗和T2代幼苗的根和叶呈蓝色反应，表明广谱抗稻瘟病基因Pi9基因己整合到水稻基因组并能正常表达。对T2代进行稻瘟病小种接种试验，结果显示了抗性分离。并且建立了一套较为有效的水稻遗传转化体系。     

延缓衰老基因PPF1转化水稻的初步研究

利用农杆菌介导法,把短日豌豆花后特异表达、具有延缓衰老作用的基因PPF1（post-floral-specific gene expressed in short-day-grown G2 pea）转入水稻,以期获得延缓衰老的转基因植株。约970块未成熟胚性愈伤组织与农杆菌共培养后,得到了约280块抗性愈伤组织,从中分化出抗性绿苗54株。PCR和Southern blotting检测结果表     

利用Bt基因和Xa21基因转化获得抗螟虫、白叶枯病的转基因水稻

利用水稻的愈伤组织作受体, 采用PIG基因枪法, 首先成功地将Bt基因[cryIA(b)]连同抗除草剂bar基因导入栽培水稻品种中国91, 选育出纯合稳定的株系T91系. 然后将T91系与黄淮区主栽品种豫粳6号杂交, 并辅以标记基因选择, 选育出纯合稳定、综合性状优良的转Bt基因株系C48. 利用农杆菌介导的转化系统将Xa21基因转入C48, 根据标记     

以抗除草剂Bar基因稳定转化谷子技术研究

农杆菌介导的谷子遗传转化效率一直是制约谷子功能基因研究及转基因育种效率的主要因素。本研究以冀谷11谷子幼穗为外植体, 选取0.5~1.0 cm的幼穗, 切成0.5 cm左右的小段, 置改良后的MS培养基上诱导15~20 d形成胚性愈伤组织3120块。愈伤组织侵染转化前用侵染液悬浮浸泡, 并经45°C热激预处理3 min, 可以有效提高26.1%的瞬时遗传转化效率。将转化后的愈伤组织经草丁膦(PPT)筛选后获得513块抗性愈伤组织, 抗性愈伤组织获得率为16.4%。抗性愈伤组织经分化、壮苗培养后获得7株抗性植株, 经PCR和Southern杂交检测得到6株T₀代转基因阳性株, 对T₃代转化植株叶片进行PPT抗性分析, 并结合Bar蛋白抗体试纸条鉴定, 表明Bar基因已稳定整合到谷子基因组中。本研究建立了农杆菌介导转化谷子优良品种的遗传转化体系, 对提高谷子转基因育种效率和谷子模式研究系统的建立有重要意义。