烟草转录因子NtDREB4特性分析及功能鉴定

DREB转录因子参与调控多种抗逆相关基因表达,在抗逆应答反应中发挥着重要作用。本研究以烟草为研究对象,通过PCR方法从烟草根系中克隆NtDREB4基因,构建表达载体并农杆菌介导法转化烟草。转基因烟草中NtDREB4表达显著升高,表明成功构建了NtDREB4表达载体并转化了烟草;转基因烟草在抗旱性显著增强,同时和抗旱相关的脯氨酸含量和叶绿素含量显著增加,而丙二醛含量显著减少,表明NtDREB4参与到植物抗旱的过程中,过表达Nt DREB4可以提高植物抵抗干旱胁迫的能力,为利用基因工程的方法改良作物的抗逆性提供了优良的候选基因。     

中国烟草钾营养研究现状Ⅱ. 烟草生长过程中钾积累分配与钾素调控等研究综述

综述了烟草钾素的吸收积累分配规律和钾素调控技术。土壤生态因子和气候生态因子障碍均影响烟草钾的高效积累。钾在中、前期吸收积累速率高、量大，到成熟期钾吸收积累减缓甚至下降。钾在烟株中的分配不够合理，在烟叶中的分配率较低，而在其它非经济产品中的分配率较高也是烟叶含钾量较低的原因之一。钾素调控可从土壤中提高钾的有效性、增加营养供应协调性、烟株顶端涂抹激素、打杈等管理调控库源关系、吸钾高效基因转入和物理措施等方面进行。到目前为止所有这些调控技术未能大幅度提高烟叶钾含量。因此需要深入研究钾素营养内在生理机制及钾素营养障碍机制。     

GhWRKY44基因在烟草中遗传转化及功能分析

为了进一步验证GhWRKY44(登录号:KJ801807)基因在烟草异位表达后的功能,构建了Ca MV35S启动子调控、Nos为终止子的棉花抗枯萎病相关基因(GhWRKY44)的过表达载体;电击法将其导入农杆菌GV3101,菌液PCR筛选鉴定阳性菌株,采用农杆菌介导法转化烟草;T0转化植株经卡那霉素筛选、PCR检测后,随机从转基因T0中选取5株进行RT-PCR检测,均为阳性株,说明GhWRKY44基因不仅整合到烟草基因组中而且还能正常转录。对过表达GhWRKY44基因的转基因烟草T1株系进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。结果表明,在正常生长情况下,PR5和NPR1的表达量在转GhWRKY44株系中明显增加,枯萎病菌侵染后,在转GhWRKY44株系中,PR1a、PR2和NPR1的表达量迅速增加,明显高于野生型株系,而PR5的表达量则低于野生型株系,说明该目的基因能在烟草中异位表达并能激活病程相关蛋白基因的表达,但其功能仍需进一步研究。     

烟草orf25基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

杂种优势的利用可以有效地实现烟草高产、高抗、优质的育种目标,目前,培育雄性不育系是获取杂种烟草最有效的途径。研究发现orf25基因位于线粒体基因组中,与烟草雄性不育密切相关。本研究以烟草雄性不育相关基因orf25为研究对象,根据RNA干扰载体构建原则,将长度为606 bp的orf25基因干扰片段分别以正向、反向连接到大小为190 bp的linker连接片段的两侧,构成发夹结构的RNA干扰载体片段。将RNA干扰载体片段插入到中间载体pET30a上,最后克隆到植物表达载体pCAMBIA1301中,成功构建orf25基因的RNAi表达载体。利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-orf25-RNAi转入到烟草保持系中烟90中,经抗性筛选以及分子检测最终获得35株转pCAMBIA1301-orf25-RNAi烟草植株,其中阳性烟草有18株,转化率为51.4%。结果表明pCAMBIA1301-orf25-RNAi干扰载体已成功转入到烟草中烟90中。     

烟草MRS2/MGT基因家族的鉴定与表达分析

为鉴定烟草基因组中的镁转运蛋白(MGT)基因,探讨MGT对烟株镁离子运输的机制,首先以水稻和拟南芥基因组中的镁转运蛋白家族基因为参考序列,应用同源序列比对方法,从烟草基因组中鉴定获得7个NtMGTs,均具有保守的Gly-Met-Asn三肽基序。再设计不同镁供应水平和光强处理的实验,结果发现NtMGTs的表达具有组织特异性且受光诱导表达。强光处理使烟株根中NtMGT1与叶片中的NtMGT2、NtMGT4、NtMGT5的表达量上升。随着镁供应浓度的上升,根系NtMGT1基因表达量提高且与根系镁含量变化趋势一致,推断NtMGT1基因主要介导烟株根系对镁的吸收;而叶片中NtMGT2、NtMGT4与NtMGT5基因表达量先上升后降低,说明3个基因属于高亲和镁离子转运系统。高温强光胁迫下,适当施镁能提高烟株地下部NtMGT1表达,促进根系吸收镁离子;提升地上部NtMGT2、NtMGT4与NtMGT5基因表达,促进镁离子的转运,保障烟株正常的生长发育。研究结果可为烟草生产上合理施镁提供理论指导。     

转大豆GmPRP和SbPRP基因烟草对非生物胁迫耐受能力分析

为实现PRPs基因在植物抗逆基因工程中的应用,将大豆中的2个脯氨酸富集蛋白基因GmPRP和SbPRP构建到植物表达载体pRI101上,通过叶盘法转化烟草。共获得GmPRP阳性转基因烟草2株,SbPRP阳性转基因烟草4株。对转基因烟草植株进行高盐、干旱和低温胁迫处理。结果表明,高盐处理后,SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量和可溶性糖含量分别显著和极显著高于野生型,丙二醛含量极显著低于野生型。干旱处理对GmPRP和SbPRP转基因烟草脯氨酸含量、可溶性糖含量和丙二醛含量的影响均不明显。低温处理后,GmPRP和SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量均极显著高于野生型,丙二醛含量均低于野生型。由此推测SbPRP可以提高转基因烟草的耐盐性和耐寒性,GmPRP可以提高转基因烟草的耐寒性,为后续SbPRP和GmPRP的应用奠定基础。     

烟草硫素营养研究进展

硫是烟草必需的营养元素之一,是仅次于氮、磷、钾的第四要素。硫素对烟草的生长发育、烟叶的产量和品质有着重要的影响。就近年来国内外烟草硫素研究进展,包括国内主产烟区土壤硫含量的测定分析、烟株对硫元素的吸收利用、施硫对烟草产量和品质的作用等进行了综述,并就今后烟草硫素的研究方向谈了粗浅的看法。     

转盐地碱蓬SsDREB基因烟草的抗逆生理机制分析

为了研究盐地碱蓬SsDREB基因在转基因烟草中的功能,探究转基因烟草的抗逆生理机制,我们构建了Ss-DREB基因的植物高效表达载体pCAMBIA2301-SsDREB,并通过农杆菌介导法将其导入烟草NC89中,通过Kan抗性、PCR及RT-PCR 筛选鉴定阳性苗;对转基因烟草苗进行高盐、干旱等抗逆性分析,同时测定在不同浓度 NaCl 和PEG6000处理后转基因烟草叶片的净光合速率( Pn )、气孔导度( Gs )、光能转化效率( Fv/Fm )、实际光量子效率(φPSⅡ)以及脯氨酸和可溶性糖的含量。结果表明：通过Kan抗性、PCR及RT-PCR筛选鉴定,最终获得12个株系转基因阳性苗。转基因植株的抗逆性与对照相比明显提高。在不同浓度NaCl和PEG6000处理下,对照和转基因苗的Pn和Gs随着处理浓度的提高均呈现逐渐下降趋势,但在相同浓度处理下转基因苗的Pn和Gs均比对照高;随着NaCl处理浓度的增大,对照和转基因植株的Fv/Fm和φPSⅡ均逐渐降低,但转基因苗的降低幅度比对照小;随着PEG处理浓度的提高,对照和转基因植株的Fv/Fm逐渐降低,但转基因苗的降低程度较对照小,而φPSⅡ下降趋势基本相同。在不同浓度NaCl和PEG处理后,转基因植株和对照植株脯氨酸和可溶性糖含量均随着NaCl处理浓度的增加而提高,但是转基因植株较对照植株增高更快。     

林烟草Shaker钾通道基因NsylNKT6启动子的克隆与功能分析

Shaker家族钾离子通道在植物钾素的吸收转运中发挥重要作用。前期从林烟草(Nicotiana sylvestris)中克隆到Shaker家族GroupⅡ的一个成员NsylNKT6,但其具体的组织表达模式尚不清楚。本研究以林烟草基因组DNA为模板,克隆获得NsylNKT6上游长1 981 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,NsylNKT6启动子含有多个光、激素和胁迫等响应元件及分生组织表达元件。利用叶盘转化法,获得转NsylNKT6启动子驱动GUS报告基因的林烟草材料。GUS染色结果显示,正常培养条件下,在林烟草出苗期的叶片保卫细胞检测到GUS活性;在林烟草团棵期,叶片的叶脉维管组织、腺毛及保卫细胞均检测到GUS活性。上述结果表明NsylNKT6在保卫细胞、叶脉维管组织和腺毛细胞中表达。推测该基因可能通过调节钾吸收参与气孔运动,或介导维管组织和腺毛中的钾离子吸收转运过程,且其表达可能受光、激素和胁迫等的调控。本研究为解析NsylNKT6钾通道的生理功能提供理论基础。     

酿酒酵母NHX1基因克隆与烟草表达分析

提取酿酒酵母DNA，PCR法合成片段长度为1902bp的NHX1基因，构建植物高效表达载体转化烟草，经PCR扩增、GUS酶染色分子鉴定后，应用荧光定量PCR分析转化材料幼根NHX1基因的转录水平，并将各转化材料T1代烟苗移栽至中间试验隔离圃中，化验分析烟叶内在成分。获得抗卡那霉素、NHX1基因PCR扩增和GUS染色阳性的转化子42株，在转化材料幼根中可检测到外源基因NHX1转录的mRNA分子；烟叶内在成分化验结果表明T1代转化材料烟叶含钾量增加30％，总糖含量显著降低，证明NHX1基因除了与Na^＋运输有关还与K^＋的吸收和糖分运输有关。     

施肥位点调控对植烟土壤及烤烟钾含量的影响

烟叶钾含量作为评价烟叶品质的重要指标,如何进一步提升烟叶钾含量是本研究的主要目的。选取四川米易、仁和、河口及内东4个试验区,采用大田微区试验方式,设置4个施肥方式（CK不施钾、T1常规环施、T2底施、T3环施+洞施）,研究施肥位点对植烟土壤及烤烟钾含量的影响。结果表明：与常规环施相比,米易、仁和及河口地区,环施+洞施可使烟叶吸钾量提升31%、7%和25%,使烤烟产量提升22%、9%、18%;内东地区,底施可使烟叶吸钾量、烤烟产量分别提升6%、11%。不同的施肥方式决定着钾素在土壤中的分布特征,常规环施使得肥料钾主要分布在烟株根区顶部,而底施则是在较深的部位,只有环施+洞施使得烟株的大部分根系被钾肥所包围,此种施肥方式可有效提升土壤供钾能力,进而促进烟叶钾含量的提升。综合不同施肥方式对植烟土壤及烤烟钾含量的影响得出：环施+洞施施肥方式在米易、仁和、河口地区施肥效果最优,底施施肥方式在内东地区施肥效果最优。     

钾代谢相关基因在烟草中的表达

以钾高效基因型K2、K3、K5、K7、K9与常规烤烟品种K326为材料, 采用漂浮育苗、移栽砂培的方法, 利用实时定量PCR调查钾代谢相关基因在烟草叶片中的表达情况, 并测定不同材料的钾吸收动力学参数和钾利用率。结果表明, K2、K7和K9是典型的富钾型, 12个钾代谢相关基因中TORK1和NtTPK1的表达水平相对较高。5个富钾型的钾吸收能力显著强于K326。但它们在高钾环境下钾素吸收能力强而利用率较低, 在低钾环境下钾吸收能力强且利用率相对较高, 尤其是品系K2、K7和K9钾的经济利用率相对较高。     

稀土微肥对烟草镉胁迫的缓解效应

采用添加外源有效态Cd的土壤盆栽试验方法,研究稀土微肥对烟草生长发育及Cd吸收的阻止效应。结果表明：Cd胁迫抑制烟草的生长发育,降低N、P、K、Ca、Mg、Zn的吸收,促进Cu的吸收。施用稀土微肥0.4 g/kg土（相当于900 kg/hm²）,可缓解Cd胁迫对烟草生长发育及养分吸收的抑制作用,降低烟叶Cd含量,当Cd添加浓度为1.2 mg/kg时,中下部烟叶Cd含量较未施用稀土微肥处理降低19.7%。供试土壤条件下（未添加Cd）,施用稀土微肥0.4 g/kg土,降低烟草对Cd、Zn、Cu的吸收,促进烟草对K的吸收,上部烟叶和中下部烟叶Cd含量分别较对照降低23.4%和7.84%,K含量提高14.1%和9.51%。Cd在烟草中的分布规律为中下部叶＞上部叶＞烟秆。     

转EdHP1(氢离子焦磷酸化酶)基因烟草促进钾离子吸收的生理机制

钾是植物生长必须的重要矿质元素,提高作物对钾的吸收是提高作物产量的重要途径。本研究以前期遗传转化披碱草EdHP1(H+-pyrophosphatase)基因的烟草为材料,在低钾处理条件下比较了转基因烟草和野生型烟草的生理特性。结果显示,在低钾条件下,野生型烟草体内K+积累量只相当于转基因烟草的62.9%。野生型烟草的总根长、总根表面积、总根体积明显低于转基因烟草(P0.05),分别为转基因烟草的72.9%、68.1%和60.6%。在不同直径根系(0.5～2.0、2.5～4.5、4.5mm分别为细根、中等根和粗根)中,细根发育差异最大,野生型烟草为转基因烟草的72.9%。低钾条件下,转基因烟草根系活力是野生型烟草的1.2倍,野生型烟草根系焦磷酸化酶活力相当于转基因烟草的46.4%,根部游离IAA含量相当于转基因烟草的66.2%。通过非损伤方法测定根部K+和H+流速结果显示,在根系表面积相似情况下,低钾条件下野生型烟草外排钾速率显著高于转基因烟草,而氢离子外排速率显著低于转基因烟草。综上所述,发达的根系和较高的K+转运体活性综合作用显著提高了转基因烟草根部对K+的吸收。     

氮钾营养与氮钾平衡对几种烤烟病害的影响

云南是中国的主要烤烟生产区,目前由于单一品种大面积种植及施肥不合理等原因,烤烟病害比较严重,制约着烤烟的品质和经济收入。通过对云南中部地区烤烟中部叶片旺长中期（移栽后60~65d）氮、钾营养及氮、钾平衡研究及田间烤烟病害调查。结果表明;（1）烟叶氮含量普遍较高,而钾素偏低,导致氮/钾比偏高;（2）氮含量高时（N%>4%）,钾素过高（K%>4%）和过低（K%<2%）都增加了烤烟对炭疽病和赤星病的感染率;（3）在氮素含量正常,钾素含量也正常时,氮/钾比协调,抗病能力最强;（4）烤烟烟叶氮/钾>2%,烤烟对病害的抵抗能力下降,且随氮/钾比偏离最适水平,烤烟发病逐渐加重。     

富钾基因型烤烟的钾积累及根系生理特性

采用室内营养液培养(钾浓度为3 mmol L^-1)的方法, 以富钾基因型烤烟农大202与2个一般型品种净叶黄、NC89为材料, 研究富钾基因型烤烟钾积累及根系生理特性。结果表明, 3个烤烟品种根和茎中钾积累量无显著差异, 但农大202的叶片钾积累量、根系活力和根系总活力、根系H⁺分泌量、根系阳离子交换量(CEC)、根系可溶性蛋白含量和ATPase活性均极显著高于另两个品种。净叶黄、NC89间除根系活力和根系H⁺分泌量差异达显著水平外, 其他根系生理特性差异均不显著。根系钾吸收动力学参数结果显示,农大202苗期钾离子最大吸收速率(V_max)较高而米氏常数(K_m)和钾离子吸收临界浓度(C_min)较低, 而旺长期的V_max、K_m及C_min均较高, 说明其根系具有较高的钾吸收速率, 但旺长期后耐低钾能力较差。     

转Lchi1烟草T_2代对梨腐烂病菌的抗性研究

获得转化梨几丁质酶基因Lchi1的烟草,检测组成型表达Lchi1基因烟草是否能提高对梨腐烂病菌(Valsa ceratosperma)的抗性,从而初步确定Lchi1基因的功能,为进一步开展梨抗腐烂病分子育种工作提供参考。构建梨几丁质酶基因Lchi1的植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,进而对转化的烟草T2代进行PCR及RT-PCR检测。利用离体叶片接种法,更直观地验证转基因烟草对梨腐烂病菌的抗性。Lchi1基因已经整合到烟草基因组中,并在烟草T2代中有效表达,在接种腐烂病菌后转基因烟草较未转基因烟草的抗腐烂病菌能力明显增强。梨几丁质酶基因Lchi1与腐烂病抗性相关联,可作为今后梨的抗腐烂病分子育种研究重要的基因来源。     

固相萃取离子色谱法快速测定烟草中钾、钠、钙、镁和氨的研究

采用带固相萃取净化功能的样品萃取瓶超声萃取烟草样品,样品萃取液用石墨化炭黑球固相萃取净化。然后以IonPacCS12A阳离子交换色谱柱(3 ′ 150 mm,5 μm)为固定相,30 mM甲基磺酸为流动相,淋洗液流速1.0 mL/min,K+、Na+、Mg2+、Ca2+、和NH4+ 5种阳离子在6.0 min内可达到完全分离。采用自主设计的样品萃取瓶,可不经样品转移就完成样品的萃取、净化和过滤。和常规方法相比,操作流程得到简化,效率大幅度提高,灵敏度和回收率高、精密度好。为基因编辑素材钾、钠、钙、镁和氨的快速测定提供了高通量分析方法。