拟南芥钙依赖蛋白激酶CPK12与bZIP转录因子ABF4相互作用研究

为分析拟南芥钙依赖蛋白激酶CPK12在不同物种中序列的相似性,并研究CPK12与ABA信号通路的关系,本研究对不同物种CPK12氨基酸序列进行比较,以及通过体内和体外实验验证CPK12与ABF4之间是否存在直接相互作用关系.通过对拟南芥(Arabidopsis thaliana),油菜(Brassica napus)与荠菜(Capsella rubella)等物种的同源氨基酸序列进行比较,获得了它们的亲缘关系.利用酵母双杂交系统,将CPK12与ABF4共转酵母后,在四缺型培养基上能够正常生长,这说明CPK12与ABF4在体外有相互作用.同时,利用双分子荧光互补实验,CPK12与ABF4共转烟草后能够在激发光下观察到烟草细胞核中出现明显荧光信号,这说明CPK12与ABF4在植物体内也存在相互作用,为CPK12参与ABA信号途径提供了直接证据.     

拟南芥E3泛素连接酶AtARRE与ABI5相互作用分析

为了阐述AtARRE与ABA信号通路关键转录因子ABI5的作用,本研究采用原生质体瞬间表达系统探究了AtARRE蛋白的亚细胞定位,证明AtARRE蛋白定位于细胞核.随后,采用酵母双杂交和GST-Pull down技术分析了AtARRE与ABI5在体外的相互作用,证明AtARRE与ABI5在体外存在相互作用.最后,本研究采用双分子荧光互补实验进一步分析AtARRE与ABI5在体内的相互作用,结果表明共表达AtARRE与ABI5在植物体内存在相互作用.这些结果共同表明AtARRE可能参与了ABI5介导的植物对逆境的响应.     

拟南芥ABA受体与UGT71B6的相互作用研究

为进一步分析ABA尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶UGT71B6参与植物抗逆反应的具体机制,本研究通过体外酵母双杂交实验与GST-Pull down实验、体内双分子荧光互补实验(BIFC)分析了ABA受体RCARs与UGT71B6之间的相互作用关系.实验结果显示ABA受体RCAR12、RCAR13与UGT71B6,在体内、体外均存在直接的相互作用.研究表明UGT71B6的生理功能与ABA受体之间存在重要联系, UGT71B6可能通过ABA受体的介导参与了植物逆境应答反应.实验结果也为初步探究ABA受体是否参与ABA稳态调节过程提供一定参考.     

拟南芥CARK3与RCAR12相互作用的研究

植物激素ABA是植物应对非生物胁迫的响应因子,广泛参与了植物生长发育的调控.ABA结合其受体后抑制PP2Cs的磷酸酶活性,释放SnRK2s,从而启动ABA信号转导途径.本文采用酵母双杂交系统,GST-pull down技术研究蛋白质激酶CARK3与ABA受体RCAR12在体外的相互作用,结果显示CARK3和RCAR12共转入酵母后,在三缺平板上能够正常生长;经His-Tag抗体检测,CARK3与RCAR12出现明显且单一的条带.同时,采用双分子荧光互补实验研究CARK3与RCAR12在体内的相互作用,结果显示CARK3与RCAR12共转化烟草后能观察到较强的荧光.体内外实验表明,CARK3与RCAR12存在明显的相互作用,CARK3可能通过直接磷酸化ABA受体RCAR12来调控ABA信号途径的生理应答.     

拟南芥蛋白质激酶CARK7与ABA受体RCAR12相互作用的研究

脱落酸(ABA)受体RCARs在ABA信号传导过程中起关键作用,研究ABA受体的相互作用蛋白质对进一步了解植物抗逆的分子机制有重要的意义.本研究通过酵母双杂交发现CARK7与ABA受体RCAR12共转化酵母能在营养缺陷型平板SD/-Trp-Leu-Ade上生长.将CARK7与RCAR12分别克隆到原核表达载体pET-28a(+)和pGEX-6p-1中,构建融合蛋白表达载体,并进行原核表达和亲和纯化.纯化所得蛋白进行GST-pull down实验,结果表明RCAR12能够把CARK7蛋白拉下来.上述结果说明CARK7与RCAR12在体外存在相互作用.进一步通过双分子荧光互补实验发现CARK7与RCAR12在烟草叶片表皮细胞中能产生荧光信号,说明两者在体内同样具有明显的相互作用.     

拟南芥膜相关转录因子bZIP60活化后与转录因子MYB7互作共同调控种子萌发

膜相关转录因子在调控植物生长发育、逆境响应中发挥重要作用.拟南芥膜相关转录因子bZIP60在响应生物和非生物胁迫中发挥功能.本研究发现bZIP60的非常规剪接受ABA诱导,bZIP60的突变体zip60在ABA处理后绿色子叶率显著降低,说明bZIP60负调控ABA诱导的种子休眠,促进种子萌发.为了进一步研究bZIP60在其中的作用,以bZIP60Δ为诱饵蛋白对cDNA文库进行筛选,最后筛选到24个可能与bZIP60Δ相互作用的蛋白.体外pull-down实验证明bZIP60Δ蛋白与其中一个MYB7蛋白有直接相互作用,荧光素酶互补实验和双分子荧光互补实验(BiFC)证明bZIP60Δ蛋白与MYB7蛋白在烟草细胞中具有相互作用.MYB7之前报道在种子萌发过程中通过抑制ABI5的表达来解除ABA对种子萌发的抑制.这些实验表明bZIP60活化后可能通过与MYB7相互作用协同拮抗ABA信号,促进种子萌发.     

拟南芥AtDWD与DDB1相互作用研究

本文通过酵母双杂交实验(Y2H)和双荧光互补实验(BIFC)分别从体外和体内条件下检测了AtDWD与CUL4型E3连接酶的底物识别蛋白结合蛋白DDB1a和DDB1b的相互作用,发现AtDWD与DDB1b有较强的相互作用,而与DDB1a的相互作用较弱,相互作用区域位于AtDWD的C末端部位.说明了AtDWD是潜在的CUL4型E3连接酶的底物识别亚基.此外,本文中还发现AtDWD过表达植株对冷冻胁迫更加敏感.AtDWD可能参与冷胁迫信号通路.     

拟南芥CARK4与RCAR12相互作用的研究

本研究采用酵母双杂交(Y2H)、GST-融合蛋白沉降技术(GST-pull-down)及双分子荧光互补实验(BiFC)实验方法研究蛋白质激酶CARK4与脱落酸受体RCAR12之间的相互作用.酵母双杂交(Y2H)试验显示,缺失氮端的CARK4(CARK4ΔN)与RCAR12具有明显的相互作用.体外GST-融合蛋白沉降技术试验进一步得出CARK4能拉下RCAR12,而不能结合负对照GST,这证明CARK4可以直接与RCAR12相互作用.为了确定CARK4与RCAR12在植物体内是否也存在相互作用,利用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达来进行BiFC实验,结果表明在烟草中共注射CARK4与RCAR12能发激发荧光,而负对照却没有,这说明CARK4与RCAR12在植物体内存在相互作用.研究结果表明,CARK4与RCAR12在植物体内、体外均具有相互作用.     

拟南芥AtHHR2与DREB2C的相互作用研究

已有研究表明拟南芥Highly Homologous RING domain 2(At5g43200,命名为AtHHR2)基因在盐胁迫中起正调控作用,并且其同源基因AtHHR3基因在酵母双杂交实验筛选中与DREB2C基因有相互作用.本研究利用体外、体内蛋白质相互作用实验以及生物化学方法进一步探究了AtHHR2的功能性.体外Pull-down实验证实了AtHHR2与DREB2C有体外的相互作用.体外泛素化实验进一步验证了它们之间的相互作用,且AtHHR2起到E3连接酶的作用.为了进一步确定它们的关系,我们用双分子荧光互补实验,在体内分别验证了AtHHR2与DREB2C之间确实有相互作用.综上所述在拟南芥中AtHHR2与DREB2C有相互作用关系,且AtHHR2起到E3连接酶的作用.     

过表达E3泛素连接酶ABRv1通过泛素化CPK3提高拟南芥干旱耐受

拟南芥基因ABRv1编码了一个E3泛素连接酶,其表达量受到干旱胁迫的诱导.为了探究ABRv1功能,我们构建了ABRv1的过表达株系并进行干旱处理,结果显示ABRv1过表达株系OE-3具有90.4%的存活率,ABRv1过表达株系OE-7有88.2%的存活率,野生型Col的存活率则为53.8%,而abrv1突变体仅有7.7%的存活率,说明过表达ABRv1提高了拟南芥对干旱的耐受能力.我们还测定了干旱处理下的失水率,也能得出与上述一致的结论.此外,我们使用纯化的GSTABRv1、His-CPK3蛋白进行了体外pull-down实验和体外泛素化实验,结果证明ABRv1能够和CPK3发生相互作用,ABRv1具有E3泛素连接酶活性并且能够把CPK3单泛素化.结果揭示了ABRv1作为一个正调控因子通过泛素化作用底物CPK3参与了拟南芥的干旱胁迫应答过程.     

具有激活RB蛋白生物活性小肽的研究

构建了慢病毒载体表达MP1多肽的RFP融合蛋白(RFP-MP1),并研究了它对人肺腺癌细胞株H1299和人骨髓瘤细胞株U2-OS增殖的影响.U2-OS和H1299细胞中RFPMP1的表达导致了RB在蛋白水平上的积累,使细胞生长受到抑制.此外,细胞流式结果发现RFP-MP1使细胞周期阻滞在G1期.进一步研究表明RFP-MP1能够阻滞RB对E2F活性的抑制.这些结果表明,11肽的MP1能够上调肿瘤细胞中RB蛋白的表达水平并且抑制其生长.     

Protein tyrosine phosphatases involved in signaling of the ABA-induced H2O2 generation in guard cells of Vicia faba L.

Although protein tyrosine phosphatases (PTPases) play an important role in signal transduction in animal cells, little is known about the function of PTPases in higher plants. Hydrogen peroxide (H2O2) and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are the critical components of ABA signaling pathway in guard cells. PTPase is an important regulator of MAPK, which is believed to mediate ABA-induced H2O2 generation in guard cells of Vicia faba L. Here, we investigate the possible role of PTPases in stomatal movement process. Phenylarsine oxide (PAO), a specific inhibitor of PTPases, could prevent ABA or H2O2-induced stomatal closure of Vicia faba L; furthermore, it could promote opening of the stomata closed by ABA or H2O2. The activity of PTPases can be effectively inhibited by PAO and H2O2. DTT had no effect on the PAO-induced inhibition of PTPases activity, but it could relieve the inhibition of H2O2 on PTPases activity. PAO could also inhibit the ABA-induced H2O2 generation in guard cells of V‘wia faba L. These results suggested that PTPases is a critical signaling component in ABA-induced stomatal closure, and serve as targets for H2O2 lying on the signaling pathways downstream of ABA induced H2O2 generation.