鸡新城疫病毒HN蛋白多表位抗原的表达与免疫原性研究

有效抗原及表位的预测和筛选是疫苗研究的基础,在对鸡新城疫病毒HN蛋白抗原表位预测的基础上,对多表位抗原进行表达与免疫原性测定。根据生物信息学表位预测方法获得的家禽新城疫病毒抗原表位,利用PCR技术合成基因,构建pBVIL1-HN重组载体,转化大肠杆菌HB101,进行基因工程表达;经纯化蛋白后免疫小鼠,抗体滴度用酶联免疫吸附方法测定,确定抗原的免疫原活性。结果表明,多表位抗原基因经测序结果正确,融合基因在大肠杆菌得到高效表达,电泳纯融合多表位抗原经三次免疫得到抗血清,抗体滴度为1：8000。鸡新城疫病毒HN蛋白多表位抗原得到高效表达,且具有良好的免疫原性。     

猕猴B病毒妒和gC合成基因重组杆状病毒质粒的构建

目的构建猕猴B病毒gB和gc合成基因的杆状病毒重组质粒（rBacmid）。方法根据本室已经合成的猕猴B病毒gB基因和gc基因,利用BamHI和XhoI特异性酶切,将其亚克隆于昆虫杆状病毒的pFastBacHTA转座载体。将该阳性转座载体转化到DHlobac感受态细胞,从中筛选出阳性重组细菌,并提取重组质粒。结果获得了重组质粒bacmid—gB和bacmid—gC。结论该研究为猕猴B病毒gB和gc蛋白在杆状病毒系统内的表达奠定了基础。     

含FMDV中和表位的重组病毒颗粒的构建及鉴定

针对FMDV的疫苗研究一直是防控口蹄疫的重点,而病毒样颗粒(VLPs)形式的疫苗因其安全性和近似传统灭活疫苗的良好免疫效果,近年来逐渐成为疫苗研究的一个新方向.本实验利用猪圆环病毒PCV2的衣壳蛋白(CAP)作为载体,分别插入FMDV MYA98毒株的抗原表位组合——VP1蛋白上B细胞表位141~160aa(B)与串联的B细胞和T细胞表位141~160aa-21~40aa-141~160aa(BTB),构建对应重组杆状病毒,分别命名为reBAC-CAP-B,reBAC-CAP-BTB.将上述病毒颗粒转入Sf9细胞表达,收获重组杆状病毒并再次感染Sf9细胞扩大病毒滴度,获得目的蛋白CAP-B,CAP-BTB,经过SDS-PAGE,Western blot鉴定正确,透射电镜观察到20~30nm大小的目的颗粒.     

对虾白斑病毒多抗原决定簇重组蛋白的抗原性分析

为研究重组多表位蛋白制备疫苗的方法的可行性,研究通过利用目前有研究证实与对虾白斑综合征病毒(WSSV)感染与致病力相关的重要决定因子囊膜蛋白VP28、VP19和被膜蛋白VP26,从这三种蛋白基因中筛选表位基因,将这些筛选到的抗原表位通过最优化的方式组合以及密码子优化,组成新的表位基因序列,命名为Y1798G,长度为509 bp。将该基因克隆到p ET-32a原核表达载体,生产抗原表位蛋白。将纯化的抗原蛋白注射到小白鼠体内,获得抗体;并通过蛋白免疫印迹(western blot)实验验证获得的抗体能否识别结合WSSV。结果表明所构建的抗原表位重组蛋白对WSSV具有特异抗原性,可见此种制备对虾白斑病毒疫苗的策略具有可行性。     

利用Tn5转座子构建杆状病毒AcMNPV随机突变体的初步研究

以杆状病毒模式种AcMNPV为研究对象,应用基于Tn5转座子的随机转座的方法,构建杆状病毒突变体库将果蝇hsp70启动子后接绿色荧光蛋白基因后插入Tn5转座子,构建了可以在昆虫细胞中表达,易于跟踪的转座载体．利用体外转座系统将转座子随机插入AcMNPV基因组,并用转座反应液转染Sf21细胞,得到了表达绿色荧光蛋白的病毒突变体库进一步纯化了两株病毒B9F和Li6A,进行了转座子插入位点的分析,确定两株病毒中,转座子分别插入了94K基因和p10基因．该方法将为杆状病毒功能基因组研究提供重要的手段。     

恒河猴犬瘟热病毒基因疫苗制备单克隆抗体的研究

从感染犬瘟热病毒死亡的恒河猴肝脏组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增H全基因并克隆到真核表达质粒pVAX中,构建了基因疫苗pVAX-H。用制备的基因疫苗免疫BaLb/c小鼠,小鼠可以产生免疫应答,免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,经间接ELISA法筛选,获得5株稳定分泌抗CDV H蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该5株单抗对应不同的病毒抗原表位,且均不与CPV和MV发生反应, McAb诱生的腹水可体外中和犬瘟热病毒,其中2株中和效价大于1:256。结果表明,CDV H基因疫苗可制备具有一定中和效价的抗CDV的单克隆抗体。     

恒河猴犬瘟热病毒基因疫苗单克隆抗体的制备

从感染犬瘟热病毒死亡的恒河猴肝脏组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增H全基因并克隆到真核表达质粒pVAX中,构建了基因疫苗pVAX-H.用制备的基因疫苗免疫BaLb/c小鼠,小鼠可以产生免疫应答,免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,经间接ELISA法筛选,获得5株稳定分泌抗CDV H蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株.该5株单抗对应不同的病毒抗原表位,且均不与CPV和MV发生反应,McAb诱生的腹水可体外中和犬瘟热病毒,其中2株中和效价大于1∶256.结果表明,CDV H基因疫苗可制备具有一定中和效价的抗CDV的单克隆抗体.     

含T细胞表位和B细胞表位的抗O型FMDV基因工程疫苗诱导豚 …

用ＦＭＤＶ疫苗免疫接种是预防口蹄疫的主要手段之一,研制既含Ｂ细胞表位又含Ｔ细胞表位的基因工程疫苗对口蹄疫的防治具有更强的保护能力,用化学方法合成Ｏ型口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）外壳蛋白ＶＰ１中２１～４０位肽段的Ｔ细胞表位基因,与１４１～１６０肽段的Ｂ细胞表位基因串联后,与β－半乳糖苷酶基因相边,构建成一重组质粒,并在大肠杆菌中表达出融合蛋白疫苗,动物实验表明,该疫苗不仅能诱导豚鼠产生滴度很高的中和抗体,     

表达鸡传染性支气管炎病毒SD/97/01株S1蛋白的重组杆状病毒的构建

采用BAC－TO－BAC杆状病毒表达载体体系构建了表达鸡传染性支管炎病毒（IBV）呼吸型毒株SD／97／01S1蛋白的重组杆病病毒，含SD／97／01株S1基因原重组质粒p MDSD9701S1用BamHI和SalI双酶切后，回收的片段并克琶杆病病毒转座载体pFASTBACHTa中多角体基因启动子的下游，筛选出重组转座质粒pFASTSD9701S1U并转化大肠杆菌DH10BAC后,获得重组穿梭质粒rBacmidSD9701S1，用重组穿俊质粒DNA转染昆虫Sf9细胞，获得了含SD／97／01S1基因的重组杆状病毒rAcSD9701S1，重组病毒感染Sf9细胞后，用SDS－PAGE、Westernblot和IFA对细胞表达产物进行检测和分析。结果表明：构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达SD／97／01的S1蛋白，该蛋白具有天然蛋白的抗原性。     

含T细胞表位和B细胞表位的抗O型FMDV基因工程疫苗诱导豚鼠产生免疫反应

用FMDV疫苗免疫接种是预防口蹄疫的主要手段之一 .研制既含B细胞表位又含T细胞表位的基因工程疫苗对口蹄疫的防治具有更强的保护能力 .用化学方法合成O型口蹄疫病毒 (FMDV)外壳蛋白VP1中 2 1～ 40位肽段的T细胞表位基因 ,与 1 41～ 1 60肽段的B细胞表位基因串联后 ,与 β 半乳糖苷酶基因相连 ,构建成一重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达出融合蛋白疫苗 .动物实验表明 ,该疫苗不仅能诱导豚鼠产生滴度很高的中和抗体 ,而且产生大量对病毒专一性T细胞 ,与不含 2 1～ 40肽段的疫苗相比 ,用该疫苗免疫的豚鼠血单个核细胞对FMDV的反应性提高 7倍以上 ,并能抵抗病毒攻击 .说明该疫苗可同时激活体液免疫及细胞免疫反应 ,有较强的保护作用 .     

具全期启动子盒的杆状病毒高效表达载体的组建与应用

通过ＰＣＲ扩增，得到苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａＮｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓ，ＡｃＮＰＶ）具早晚期启动子元件的ｐ３５基因启动子，将其插入到杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３多克隆位点上游，使之与ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３质粒中的人工合成后期启动子（ＰＳｙｎ）、多角体ＸＩＶ启动子（ＰＸＩＶ）串联构成早期、晚期、极晚期能持续启动外源基因表达的转移载体质粒ｐＳＸ３５．将ｐＳＸ３５用于组建含ＨＢｓＡｇ基因并形成多角体的重组ＴｎＮＰＶ，ＨＢ－ｓＡｇ基因的表达量显著提高，表达时间亦明显提前，从而实现了外源基因在杆状病毒表达系统的全期、高效表达．ｍＲＮＡ引物延伸试验结果显示，Ｐｐ３５在重组病毒中可产生２套转录本，分别于病毒感染的早期和晚期起始ＨＢｓＡｇ基因的表达．     

含果蝇肌动蛋白基因的重组棉铃虫核型多角体病毒的构建

本实验利用昆虫杆状病毒表达载体，将果蝇肌动蛋白基因5Cactin克隆入杆状病毒表达载体，以棉铃虫单核衣壳核多角体病毒为亲本病毒，在脂质体介导下共转染棉铃虫细胞，空斑纯化得到重组病毒，以深入研究棉铃虫病毒在入侵、复制及装配过程中，宿主肌动蛋白的动态变化对病毒复制的作用与影响。     

AcNPV增强子hr5增强HBsAg基因表达的研究

用形成包涵体（ＯＯＣ＋）并能利用人工合成启动序列和多角体ＸＩＶ启动子表达外源基因的转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３将多角体基因、乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢＳＡｇ）基因和苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）的增强子ｈｒ５部分序列同时插入无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－Ｇ基因组中，得到两株高效表达ＨＢｓＡｇ基因又形成包涵体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ３５－ＯＣＣ＋和ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ２６－ＯＣＣ＋．对重组病毒的酶切鉴定、ＤＮＡ斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析证实，外源基因及其相应的启动子和增强子序列已正确插入病毒基因组中．插入顺序中，ｈｒ５增强子是插入ＨＢｓＡｇ基因下游，多角体基因与ＨＢｓＡｇ基因方向相反．１２５Ⅰ－固相放射免疫检测和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明，ＨＢｓＡｇ基因在昆虫离体细胞中得到高效表达并保留了抗原活性．ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ２６－ＯＣＣ＋和ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ３５－ＯＣＣ＋表达的ＨＢｓＡ吕蛋白与没有插入增强子序列的重组病毒ＴｎＮＰＶ—ＨＢｓ８５－ＯＣＣ＋的比较，分别提高了４０％和４６％．     

细粒棘球绦虫AgB1抗原表位的生物信息学预测

 以细粒棘球绦虫AgB1基因序列为基础,采用PredictProtein软件预测其编码蛋白的二级结构;应用在线预测软件Bcepred、Abcpred、IEDB及SYFPEITHI等对细粒棘球绦虫AgB1的B细胞表位和T细胞表位进行预测。结果提示,AgB1抗原蛋白存在可以构成抗原表位的区域,经软件分析,分值高的B细胞表位区域:2~9、15~20、22~35和41~52氨基酸序列;T细胞表位区域:3~12、26~33、34~44和52~61氨基酸序列。研究运用生物信息学确定AgB1抗原的4个B细胞优势表位和4个T细胞优势表位,对进一步研究AgB1的抗原性和研发更有价值的免疫诊断方法具有重要意义。     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaC基因的克隆和序列分析及真核表达质粒的构建

参照GenBank上登录的副溶血弧菌鞭毛蛋白flaC基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaC全长基因,序列分析结果显示该基因为1 155 bp,编码384个氨基酸.与GenBank中其他弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaC基因与副溶血弧菌flaC基因的同源性最高(87%).将该基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,获得带溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因的真核表达重组质粒pcDNA-flaC,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

Expression of green fluorescent protein gene with baculovirus vector in insect cells

The green fluorescence of bioluminescent jellyfishAequorea victoria is due to the presence of the green fluorescent protein (GFP). To examine whether the GFP gene can be applied as a reporter gene in insect cells, a baculovirus transfer vector containing the neomycin resistance gene (neo) was established. The GFP gene was subcloned into the vector downstream of the polyhedrin gene (ocu) promoter. In the presence of G418, the recombinant virus can be purified. Expression of the GFP gene in the recombinant virus should give rise to synthesis of the GFP with a molecular weight of 30×10³ dalton, and is observable by the strong green light irradiated by ultraviolet or blue light in viable intact insect cells. The GFP produced in insect cells has typical fluorescent spectra indistinguishable from those of the purified native GFP. The GFP gene as a good reporter gene can be applied to the baculovirus-insect cell expression system. Supported by the National Natural Science Foundation of China Hu Jianhong: born in July, 1972, Master graduate student     

Production of human alpha-interferon in silkworm using a baculovirus vector

Microorganisms are generally used for mass production of foreign gene products, but multicellular organisms such as plants have been proposed as an economical alternative. The silkworm may be useful in this context as it can be cultured easily and at low cost. We have therefore developed a virus vector to introduce foreign genes, for example, the gene for human alpha-interferon (IFN-alpha), into silkworms. We used the baculovirus Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV) which has a large (greater than 100 kilobases, kb) double-stranded circular DNA genome within its rod-shaped capsid. Baculoviruses have been used previously as vectors for expression of beta-interferon and beta-galactosidase in established cell lines. Although BmNPV has not been used previously as an expression vector, it has an advantage over the baculovirus Autographa californica NPV in that it has a narrower host range and will not grow in wild insect pests in the field. In the present study, the polyhedrin gene encoding the major inclusion body protein of BmNPV was identified by hybridization with complementary DNA and cloned in a plasmid. For insertion of foreign genes, we constructed a recombinant plasmid carrying a polylinker linked to the promoter of the polyhedrin gene, and inserted the IFN-alpha gene into this plasmid. The resulting plasmid and the BmNPV genomic DNA were co-transfected into BM-N cells, and stable recombinant viruses isolated by plaque assay on BM-N cells. The recombinant virus replicated in silkworm larvae, which synthesized as much as 5 X 10(7) units (approximately 50 micrograms) of interferon in their haemolymph.     

细粒棘球绦虫重组pET30a-EgA31疫苗的构建和诱导表达

克隆细粒棘球绦虫EgA31抗原基因,构建pET30a-EgA31原核表达载体,并在大肠埃希菌宿主系统中表达EgA31重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE分析.从细粒棘球绦虫成虫组织中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板RT-PCR 克隆获得EgA31抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性.利用定向克隆技术将EgA31抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET30a上,转化E coli DH5α,根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆,通过PCR分析和酶切鉴定筛选出阳性克隆.IPTG初步诱导和表达pET30a-EgA31重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平.测序表明选取的pET30a-EgA31阳性克隆均为正确连接EgA31抗原基因的重组质粒.经IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约为31 kDa处有表达条带,表达量约占菌体总蛋白质的26%.成功克隆并构建了pET30a-EgA31原核表达质粒.初步诱导表达出EgA31重组蛋白,为进一步研究其免疫特性奠定了基础.     

分泌癌胚抗原肿瘤靶向性Cu,Zn-SOD的基因克隆及表达

将Cu,Zn-SOD与抗癌胚抗原（CEA）单链抗体基因（ScFvgene)融合,重组到含T7启动子的表达载体p ET-22b(＋）中,构建表达质粒pETSOD－ScFv,并转化大肠杆菌BL21（ED3）,进行了高效表达,表达物占菌体可溶性总蛋白的18％。SDS－PAGE和蛋白质印迹图谱显示表达物相对分子质量为41kD,与融合基因编码蛋白质的理论值相符。该蛋白质在磊肠杆菌中为分泌型表达,有利于纯化。RIA测定表明产物能特异性地与抗原CEA结合,邻苯三酚法测定也表明产物具有SOD酶的活性,该融合蛋白为分泌CEA肿瘤的靶向性治疗及放疗、化疗后的恢复提供新的途径。