闭锁连接蛋白-1核酸适配体的筛选与初步应用

基于配体指数富集系统进化技术筛选闭锁连接蛋白-1的核酸适配体，最终筛选到15条ZO-1的核酸适配体(APT_ZO-1).排除线性结构与相似结构后，采用酶联免疫吸附法表征了9条APTZO-1与ZO-1亲和力的大小，排序依次为：APT_ZO-1 8>APT_ZO-1 2>APT_ZO-1 7>APT_ZO-1 13>APT_ZO-1 1>APT_ZO-1 5>APT_ZO-1 15>APT_ZO-1 12>APT_ZO-1 4.采用Cy5荧光基团标记APT_ZO-1 8(Cy5-APTZ_O-1 8)，证实了其能对人结直肠腺癌细胞(Caco-2)与人脑微管内皮细胞(hCMEC/D3)的ZO-1进行荧光定位与半定量分析，且与基于ZO-1抗体法的免疫荧光与蛋白印迹实验结果基本相似.本研究首次筛选到了ZO-1的系...     

基于适配体的胶体金色谱层析试纸条快速检测肌酸激酶同工酶

研究基于适配体的胶体金色谱层析试纸条快速检测肌酸激酶同工酶,用于揭示长期飞行下航天员潜在的心肌和肌肉损伤.利用SELEX方法筛选得到的肌酸激酶同工酶适配体,并优选出与肌酸激酶同工酶有较强亲和能力的核酸适配体应用于胶体金免疫层析试纸条,通过优化胶体金颗粒大小、缓冲液浓度等条件,成功建立了一种基于适配体的胶体金试纸法用于CK-MB的快速检测.实验结果表明,通过基于磁珠的核酸适配体筛选方法筛选出的与肌酸激酶同工酶有亲和力的核酸适配体,能够用于构建适配体-适配体夹心胶体金免疫层析试纸条并成功应用于82 nM以上的肌酸激酶同工酶的快速、可视化检测,同时,该免疫层析试纸条具有良好的特异性和稳定性,可用于未来空间医学即时检测.     

基于氧化石墨烯的磺胺嘧啶核酸适配体的筛选与鉴定

[目的]利用GO-SELEX方法对磺胺嘧啶(Sulfadiazine)核酸适配体进行筛选与鉴定.[方法]基于氧化石墨烯(Graphene oxide)与ssDNA的π-π堆积作用,将氧化石墨烯作为结合ssDNA与分离的介质,以磺胺嘧啶为靶标分子,利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)和磁分离技术建立了基于氧化石墨烯的核酸适配体筛选方法GO-SELEX,对筛选产物测序所得的核酸序列进行了同源性分析和二级结构预测,亲和力和特异性分析以及方法学考察.[结果]经过9轮筛选,获得了对磺胺嘧啶具有较高亲和力(Kd = 411 nmol·L-1)的核酸适配体Ap-41,且Ap-41对磺胺嘧啶的特异性良好;磺胺嘧啶质量浓度在1.0～40μg·mL-1范围内与荧光强度的线性关系良好,检出限为0.029 μg·mL-1,水样中加标回收率范围为95.0％～104.0％,相对标准偏差不超过6.1％.[结论]基于核酸适配体Ap-41的检测方法灵敏度较高,可用于后续传感器的构建及实际样品中磺胺嘧啶的检测.     

琼脂磁珠消减SELEX技术筛选HIV P24抗原适配体

建立以羧基化琼脂磁珠为筛选介质,快速筛选高特异性、高亲和力的HIV P24抗原适配体的方法.利用消减SELEX技术及靶标替换的方法,以HIV P24抗原作为靶分子,羧基化琼脂磁珠为载体,进行6轮筛选,筛选到3条特异性核酸适配体.特异性检测表明,筛选得到的HIV P24抗原适配体与HIV P24抗原的结合解离常数均在纳摩尔级水平.该方法为HIV早期检测提供了新的检测技术,对适配体与靶分子相互作用机理的研究具有重要价值.     

水生生物病原核酸适配体研究进展

核酸适配体(Aptamer)是指利用指数富集配体系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选得到的能特异性识别和结合靶标的ssDNA或RNA分子,具有高亲和力和高特异性的特点,在快速检测和靶向治疗方面应用广阔。近年来,水生生物细菌和病毒性病原疾病的频繁暴发,严重制约了水生态的健康以及水产养殖业的迅速发展。核酸适配体作为一种新型的识别分子,在水生生物病原的应用上也已取得了一些进展。本文对水生生物细菌和病毒性病原核酸适配体的筛选,及其在检测和治疗领域的研究现状进行综述,并对该领域核酸适配体技术的应用方向进行展望。     

毛细管区带电泳技术研究龙血竭有效单体与核酸适配体及凝血酶之间的相互作用

利用毛细管区带电泳技术（CZE）研究5个龙血竭有效单体与牛凝血酶（B-Thr）、29碱基凝血酶核酸适配体（Apt29）之间的相互作用.电泳条件为有效长度是40 cm的非涂层石英毛细管,气压进样3.45 kPa,进样时间5 s,分离电压+15 kV,分离温度15℃,检测波长分别为214 nm（牛凝血酶体系）和330 nm（核酸适配体体系）.结果表明,龙血素A和B-Thr之间的结合常数K_b为4.73×104 L/mol,白藜芦醇、龙血素B、7,4'-二羟基黄酮、龙血素C与B-Thr没有显著结合;龙血素B和7,4'-二羟基黄酮与核酸适配体的结合常数K_b分别为1.98×104,1.83×104 L/mol,白藜芦醇、龙血素A、龙血素C与核酸适配体之间没有表现出明显的结合现象.本文结果对进一步研究龙血竭在凝血酶上的潜在结合位点,以及核酸适配体能否向凝血酶靶向转运龙血竭,提供了科学数据支持.      

P-糖蛋白的核酸适配体筛选及应用研究

基于SELEX技术筛选P-糖蛋白（permeability glycoprotein,P-gp）的特异性核酸适配体（aptamer,Apt）,并用酶联免疫吸附测定（ELISA）法、表面等离子体共振（SPR）法表征了Apt与P-gp的结合能力,采用与P-gp结合能力最强的Apt5在人结直肠腺癌细胞（Caco-2）、人脑微管内皮细胞（hCMEC/D3）两种细胞系上考察了对P-gp外排功能的抑制效果.筛选得到10条长度为81 bp的P-gp核酸适配体,结合能力大小顺序为:Apt5>Apt8>Apt1>Apt4>Apt6>Apt10>Apt7>Apt2>Apt9>Apt3.Apt5使hCMEC/D3及Caco-2细胞内罗丹明123的蓄积量分别增加了40.77%（P<0.01）,32.39%（P<0.05）,能潜在抑制P-gp的外排功能.本研究首次报道了P-gp的多条核酸适配体,与P-gp有较强的结合能力,并能抑制P-gp的外排功能,有望成为P-gp的潜在新型抑制剂.      

东北东部山区主要树种枝条及其组分水力特征

【目的】针叶树种和阔叶树种木质部孔性特征的分化,导致两个功能类群在水力学结构上存在显著差异,分析针叶与阔叶树种枝条及其组分间导水率对比特征,了解树木枝-叶水力传导机制。【方法】以东北温带森林中常见的3种针叶树种红松(Pinus koraiensis)、红皮云杉(Picea koraiensis)、兴安落叶松(Larix gmelinii)和4种阔叶树种白桦(Betula platyphylla)、五角槭(Acer mono)、春榆(Ulmus japonica)、蒙古栎(Quercus mongolica)为研究对象,利用高压流速仪(HPFM)的准稳态法,测定枝条的整枝(K_wb)、茎段(K_b)、叶片(K_lb)和叶柄导水率(K_p),并分别计算基于叶面积和叶质量的整枝(K_wb-area和K_wb-mass)、茎段(K_b-area和K_b-mass)、叶片导水率(K_lb-area和K_lb-mass)。比较同一树种枝条水力阻力分配以及不同树种同一组分间导水率差异,并探索标准化后的枝条及其组分导水率与叶性状[包括比叶质量(LMA)和叶干物质含量(LDMC)]的关系。【结果】①红松的K_lb约是K_b和K_wb的4倍,针叶阻力(R_lb)仅占枝条总水力阻力(R_wb)的20%;其余树种K_lb和K_wb差异不显著,并显著低于K_b,R_lb占R_wb的61%~80%,茎段阻力(R_b)占R_wb的20%左右,叶柄阻力(R_p)占R_wb不足10%。② 不同材性树种K_lb-area表现为无孔材最高、散孔材和环孔材树种相似,阔叶K_lb-area显著低于针叶。不同材性或叶习性树种间K_wb-area或K_b-area均无显著差异。③ K_lb-area、K_wb-area和K_b-area与比叶质量(LMA)、干物质含量(LDMC)均正相关,其中K_lb-area与两者相关极显著(P<0.01);K_lb-mass、K_wb-mass和K_b-mass与LMA、LDMC均为负相关,K_lb-mass与两者相关不显著。【结论】除了红松,其余6个树种均可采用枝条或带叶柄的叶片代替叶片导水率数据。针叶导水率高于阔叶,一定程度上弥补了针叶树种木质部输水效率低的限制。对针叶树种采用枝条代替K_lb-area分析与叶性状的关系需慎重,基于单位叶质量的枝条及其组分导水率指标,能够如实反映针阔叶树种叶导水率与叶性状的关系。     

核酸适配体氯化血红素比色法检测牛奶中的氯霉素

利用一种基于适配体氯化血红素(hemin)比色分析法快速检测牛奶中的氯霉素(chloramphenicol,CAP) 含量。设计两条DNA链,其中一条为CAP的核酸适配体,在其3′端修饰氯化血红素;另一条为CAP核酸适配体的互补链(cDNA),在其5′端修饰hemin。当体系中无CAP时,两条DNA单链杂交形成DNA双链,两个hemin单体形成二聚体使其过氧化物酶活性降低,以致不能催化过氧化氢氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)产生蓝色产物。而体系中有CAP时,CAP与CAP适配体特异性结合,DNA双链解离,hemin单体的过氧化物酶活性恢复,并催化过氧化氢氧化TMB产生蓝色产物,加入反应终止液后,检测452 nm处的吸光度值。在优化条件下,该比色法检测CAP的线性范围为1～30 nmol·L-1,以3倍标准偏差计算其检出限为0.315 nmol·L-1。将该方法用于牛奶样品的检测,加标回收率为955%～1160%,表明该方法能够快速、准确和灵敏地检测牛奶中CAP含量。     

β-环糊精敏化荧光法测定黄柏中盐酸小檗碱的含量

采用β-环糊精敏化荧光法测定黄柏提取液中盐酸小檗碱的含量.盐酸小檗碱是黄柏的主要提取物,与β-环糊精可以形成包合物,产生敏化荧光作用.在7.50 mg/mL β-环糊精水溶液中,选择荧光激发波长(λ_ex)345 nm,发射波长(λ_em)540 nm,工作曲线线性范围0.10～1.00μg/mL,检出限1.33 ng/mL,测得黄柏中盐酸小檗碱的含量为1.56%.此方法操作简单、准确,对中药中盐酸小檗碱的含量测定具有一定的参考价值.     

Novel protein detection method based on proximity-dependent polymerase reaction and aptamers

In recent years, specific detection of proteins is one of the hot issues about aptamers in proteomics. Here we reported a simple, sensitive and specific proximity-dependent protein assay with dual DNA aptamers. Thrombin was used as the model protein, and two aptamer probes with complementary sequence at 3′-end were designed for the two distinct epitopes of the protein. Association of the two aptamers with thrombin resulted in stable hybrids due to the proximity of 3′-end, then polymerase reaction was induced. The amount of obtained dsDNA was indicated using the fluorescence dye Sybr Green I. The results showed that the initial velocity of polymerase reaction had a positive correlation with concentration of thrombin. The advantages of this dual-aptamer-based approach included simple and flexible design of aptamer probes, high selectivity and high sensitivity. The detection limit was 6.9 pmol/L.     

壳聚糖对活性污泥动力学参数的影响

壳聚糖具有良好的吸附性以及生物降解性,作为一种天然高分子絮凝剂,具有絮凝效果好、无毒无害,不会造成二次污染等优点,在水质净化工艺中具有广阔的应用前景。以活性污泥为研究对象,在壳聚糖(分子量为50kDa、脱乙酰度85 %)添加质量浓度分别为0,15,25,35 mg·L^-1时,采用耗氧速率表征方法,测定计算了活性污泥的动力学参数:COD_Cr 最大比去除速率(v_mS)、COD_Cr去除半饱和常数(K_S)、氨氮最大比去除速率(v_mN)、氨氮去除半饱和常数(K_N)。结果表明,一定质量浓度的壳聚糖能导致活性污泥的v_mS及v_mN降低,K_S及K_N增大,对活性污泥降解COD_Cr和氨氮有抑制作用。壳聚糖的抑制作用受壳聚糖浓度的影响,但并不随之增大而增强,即存在最大抑制作用。当壳聚糖质量浓度为25 mg·L^-1时,抑制作用最强,而壳聚糖的絮凝作用则不受此影响。     

结合适配体技术的磁性粒子表面蛋白分子印迹材料研制

本文将具有高度特异性的生物分子核酸适配体引入分子印迹技术,并结合磁性纳米粒子材料比表面积大、操作简便性和易于修饰性于一体,制备出了新型蛋白分子印迹材料.首先获得性能更好的硅烷化的磁性微球,之后加入功能单体、交联剂和衍生化适配体,以溶菌酶为模板分子,制备出磁性溶菌酶蛋白分子印迹适配体-纳米粒子.实验结果显示,不同材料的蛋白吸附能力顺序由高到低分别为结合适配体的蛋白印迹材料,结合适配体的非蛋白印记材料,蛋白印迹材料和无适配体的非蛋白分子印记材料.初步研究表明,适配体与磁性粒子的结合可以有效提高蛋白质分子印迹材料的印迹效果.     

水曲柳幼苗水力结构和光合生理对光强梯度变化的耦合响应

【目的】 研究水曲柳(Fraxinus mandschurica)幼苗对不同光照强度的响应及适应机理,为育苗造林和林下天然更新研究提供参考。【方法】 以2年生盆栽水曲柳幼苗为材料进行不同光照处理,1年后测定幼苗在4种强度日光处理(相对光强100%、60%、30%和15%)下的生长、光合生理和水力性状等指标。【结果】 遮阴处理显著影响了水曲柳幼苗的生长、光合和水分生理特性。与60%和30%相对光强处理相比,100%相对光强下水曲柳具有更高的气孔导度(G_s)、净光合速率(P_n)、根系水力导度(K_root)、地上部分水力导度(K_shoot)和整株水力导度(K_plant)。随光照强度的减弱,水曲柳的生长速率显著降低,根生物量占比(R_MR)减少,最大净光合速率(P_n,max)、光补偿点(L_CP)和光饱和点(L_SP)降低,而茎、叶生物量占比(S_MR、L_MR)以及表观量子效率(A_QY)增加;枝条木质部解剖结构在不同光照处理下存在显著差异,相对光强100%处理时的导管密度显著高于相对光强30%和60%处理,而导管直径显著低于30%和60%处理。【结论】 水曲柳幼苗通过调节形态、光合和水分生理特性来适应一定程度的弱光环境,但总体上对光强有较高的需求。水曲柳的光合和水力性状随光照强度的改变都具有较大的可塑性,二者对光照强度梯度变化的响应存在显著耦合关系。这些性状的可塑性响应有利于提高水曲柳幼苗在异质性光环境下的生存适合度,对于其更新阶段在林下不同光照条件下的生存有重要意义。     

Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin.

Aptamers are double-stranded DNA or single-stranded RNA molecules that bind specific molecular targets. Large randomly generated populations can be enriched in aptamers by in vitro selection and polymerase chain reaction. But so far single-stranded DNA has not been investigated for aptamer properties, nor has a target protein been considered that does not interact physiologically with nucleic acid. Here we describe the isolation of single-stranded DNA aptamers to the protease thrombin of the blood coagulation cascade and report binding affinities in the range 25-200 nM. Sequence data from 32 thrombin aptamers, selected from a pool of DNA containing 60 nucleotides of random sequence, displayed a highly conserved 14-17-base region. Several of these aptamers at nanomolar concentrations inhibited thrombin-catalysed fibrin-clot formation in vitro using either purified fibrinogen or human plasma.     

运用SELEX技术筛选嗜水气单胞菌适配子

以嗜水气单胞菌为研究对象,采用适体筛选技术(SELEX,system evolution of ligands by expo-nential enrichment),利用体外合成的长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库,以嗜水气单胞菌为靶目标进行12轮的筛选,利用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统检测DNA适配子与嗜水气单胞菌的亲和力.研究结果表明:随着筛选轮数的增加,DNA适配子与嗜水气单胞菌结合后显色,A(absorbance)值逐渐增加,亲和力由最初的0.32升到第9轮的0.72.研究已初步筛选到与嗜水气单胞菌具有高亲和力的DNA适配子,为嗜水气单胞菌的二级结构研究及其检测试剂盒的研发提供了基础.     

特异性检测卵形鲳鲹源哈维氏弧菌的核酸适配体的筛选与鉴定

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖动物常见的主要致病菌之一,严重危害着我国华南沿海地区水产养殖业的健康可持续发展。针对哈维氏弧菌的快速检测诊断技术和抑菌技术等方面进行系统研究,并开发具有市场发展潜力的快速检测试剂盒和抗菌功能产品,对控制哈维氏弧菌的危害极其重要。为此,本研究以哈维氏弧菌为靶标,利用指数富集的配基系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)技术,筛选特异性识别哈维氏弧菌的核酸适配体,并对核酸适配体的性质进行系统性研究。结果显示,核酸适配体H10、H13能高特异性和高亲和性地识别哈维氏弧菌,并且无毒副作用。同时,靶标性质分析表明核酸适配体(H10,H13)的靶标可能是细胞膜蛋白或膜蛋白相关成分。本研究运用SELEX技术筛选获得的ssDNA核酸适配体H10和H13,具有高特异性和亲和性,可用于研发操作便捷、灵敏度高的哈维氏弧菌快速检测技术。