基于亲和素修饰磁珠的电化学检测特殊序列DNA的研究

报道了一种基于亲和素修饰磁珠表面的电化学检测特殊序列靶DNA的新策略.其方法如下:首先磁珠表面用亲和素功能化,然后利用生物素-亲和素的特殊识别作用,将生物素-探针DNA固定在磁珠表面,通过分子杂交,将另一条含有二茂铁标记互补碱基序列的靶DNA,进行识别,结合形成双链.利用示差脉冲伏安法检测二茂铁产生的电化学信号进行定量.在最佳条件下,二茂铁的峰电流强度与靶DNA浓度的对数在10-9-10-7M范围内呈线性关系.其线性回归方程:I(μA)=5.598+0.549lgCDNA,相关系数为0.9962,检测限是3.5×10-10M(S/N=3).此外,该传感器具有良好的选择性,它能识别单碱基错配序列的靶DNA.     

生物素-链霉亲和素系统压电传感实时响应特性研究

生物素与链霉亲和素之间具有高度亲合力和高度特异性,将其用于压电传感研究,反映出了生物素-链霉亲和素系统的压电传感实时响应特性.分别讨论了体系pH对生物素与链霉亲和素吸附行为的影响,链霉亲和素包被浓度、包被时间、结合反应时间等因素对生物素-链霉亲和素结合实验的影响以及结合反应的特征.结果表明,pH=7.4时以100 μg/mL链霉亲和素包被8 h后效果最好;结合反应中,生物素的浓度在0.11～1.65μg/mL范围内,传感器的响应频率值与溶液浓度成线性关系.     

磁性分离用于小分子物质生物素标记后的快速纯化

根据生物素标记反应的不可逆性，设计了一种基于磁性分离的快速纯化方法。该方法使用固定在磁性粒子上的牛血清白蛋白（BSA）与生物素标记甲状腺素（T4）反应后过量的活性生物素试剂继续反应，形成磁性粒子-BSA-生物素复合物，再通过磁性分离可快速除去复合物。实验中用酶免疫分析方法检测过量的活性生物素试剂和磁性粒子的反应程度，并用竞争抑制反应证明了经磁性分离得到的上清液为高纯度生物素标记的T4。该纯化方法解决了小分子物质生物素标记后难以用传统方法纯化的问题，操作快速、简单，特别适用于小分子生物物质进行生物素标记后的纯化。     

通过二（半胱氨酰）赖氨酸用^99mTc标记生物素

生物素和亲和素具有很强的亲和力，这一特性可以被用于改进放免显像的顶定位技术。本文阐述了利用一种新的含硫含氮配体Ｌ－Ｎ－Ｎ＇－二（半胱氨酰）赖氨酸作为联接剂，用＾９９ｍＴｃ标记生物素的方法，初步研究的结果表明，标记具有较好的体内外稳定性，可以进进一步用于抗肿瘤单抗预定位，再注射能与亲和素结合的放标生物素进行肿瘤显像。     

表面等离子体共振免疫传感的放大检测研究

表面等离子体共振免疫传感器是一类相对新型的免疫检测技术。将链霉亲和素-生物素系统用于表面等离子体共振免疫传感的信号放大,实时检测了人免疫球蛋白G(hIgG)的蛋白浓度。发生免疫反应的传感片和生物素化抗体反应后,传感片表面的一层生物素分子随后与链霉亲和素-生物素化抗体复合物中的链霉亲和素的活性位点发生亲和反应,从而使传感片表面特异健合的物质质量显著增加,大大提高了免疫检测的灵敏度和检测限。免疫反应经放大后,可检测0.005～10μg/mL浓度区间内的hIgG。     

基于G-四链体-氯血红素DNA酶的传感器对血清中甲胎蛋白的检测

建立了一种夹心式用于检测血清中甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)的新型传感器。利用微孔板表面羧基与抗体表面的氨基之间的相互作用,将AFP的单克隆抗体(monoclonal antibodies,McAbs)修饰到微孔板的表面;再利用抗体抗原的定向固定效应,将AFP键合到McAbs的表面,接着将生物素标记的AFP单克隆抗体(biotinylated McAbs)与AFP结合;最后,利用链霉亲和素(streptavidin,SA)与生物素的特异性结合作用,将G-四链体-氯血红素DNA酶键合到生物素标记的单克隆抗体上,从而制得高灵度、高特异性的AFP传感器。用2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)-H2O2体系检测AFP的浓度,信号值与AFP的浓度在0.05 ng·mL-1至20 ng·mL-1之间成线性关系,检测限为0.02 ng·mL-1。此传感器可应用于血清中AFP的检测。     

miR-34a靶向调控前列腺癌发生相关基因SIRT1的表达

前列腺癌在我国发达地区发病率迅速升高,化疗耐药是前列腺癌治疗最棘手的阶段,因此基于小RNA的无免疫原性的治疗具有广泛应用前景。研究表明miR-34a具有抑癌作用,而其靶标基因的鉴定鲜有报道。本研究结果显示SIRT1基因的表达存在着转录后基因表达调控机制。miRBase数据库预测显示SIRT1基因3’-UTR序列中存在着19个miRNA的靶标位点。通过系列截断实验及萤光素酶报告系统来鉴定到SIRT1基因3’-UTR区域中的功能miRNA为miR-34a。通过靶标位点的突变及三联体、miRNA的类似物及抑制剂来进一步验证了靶位点的有效性。在前列腺癌细胞DU145和CWR22RV1中存在miR-34a对靶标SIRT1基因的转录后抑制作用。本研究的结果可能为前列腺癌的miR-34a靶向基因治疗提供了理论依据。     

通过二（半胱氨酰）赖氨酸用￣（99m）Tc标记生物素

生物素（ｂｉｏｔｉｎ）和亲和素（ａｖｉｄｉｎ）具有很强的亲和力，这一特性可以被用于改进放免显像的预定位技术。本文阐述了利用一种新的含硫含氮配体Ｌ－Ｎ－Ｎ′－二（半胱氨酰）赖氨酸（ＢＣＬ）作为联接剂，用￣（９９ｍ）Ｔｃ标记生物素的方法。初步研究的结果表明，标记物具有较好的体内外稳定性，可以进一步用于抗肿瘤单抗预定位，再注射能与亲和素结合的放标生物素进行肿瘤显像。     

人骨肉瘤细胞适配体的早期筛选

目的体外随机合成单链寡核苷酸备选文库,以骨肉瘤U-2 OS完整细胞作为靶点,筛选出与其结合的高特异性、高亲和性单链DNA(ss DNA).方法将体外合成随机碱基序列的单链DNA文库与人骨肉瘤U-2 OS细胞相结合,收获与靶细胞结合的单链DNA,通过优化PCR条件进行大量扩增后,应用生物素-链霉亲和素亲和层析柱分离出正链DNA.结果以10,14以及18个循环时扩增ds DNA产物最理想;应用生物素-链霉亲和素磁珠分离法制备的正链ss DNA纯度高,可有效保证次级文库的筛选.结论应用Cell-SELEX技术可成功筛选早期ss DNA文库,为后续获得针对人骨肉瘤U-2 OS细胞的高特异性适配体奠定实验基础.     

免疫磁珠的制备及其在捕获乳腺癌患者白细胞中的应用

应用生物素-亲和素系统制备免疫磁珠,考察了不同条件对制备免疫磁珠的影响.结果表明:当反应温度为4℃、亲和素浓度为0.2mg/mL、PBS pH=5.8、反应时间为2h时,磁性微球的亲和素载量为25~55mg/g;BNHS与抗体质量比1∶7时,生物素与抗体的结合率最高;亲和素与生物素化抗体摩尔比在1∶3时,亲和素与生物素的偶联率最高.抗CD45免疫磁性微球的白细胞去除率高达78%,磁珠回收率达98%,可用于进一步捕获乳腺癌外周血循环肿瘤细胞.     

氟硼二吡咯类共轭聚合物均相检测miRNA研究

基于水溶性氟硼二吡咯类共轭聚合物PBF可与长波长区(> 600 nm)荧光染料产生荧光共振能量转移(FRET),结合引物延伸反应,发展了一种均相检测miRNA的新方法.方法首先通过引物延伸反应在目标miRNA分子上引入荧光染料Cy5,形成miRNA-Cy5. 然后,PBF与miRNA-Cy5/DNA杂合体通过静电力结合并发生从PBF到Cy5的有效FRET,实现了基于阳离子共轭聚合物(CCP)的长波长区miRNA的均相检测,方法灵敏度高、特异性好,测定miR-221的线性为15~6 000 pmol/L,检出限(3σ)为8.4 pmol/L.方法拓展了CCP的应用,为基于CCP的生物传感和生化分析提供了新的均相检测平台.     

A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion

MicroRNAs (miRNAs) constitute a growing class of non-coding RNAs that are thought to regulate gene expression by translational repression. Several miRNAs in animals exhibit tissue-specific or developmental-stage-specific expression, indicating that they could play important roles in many biological processes. To study the role of miRNAs in pancreatic endocrine cells we cloned and identified a novel, evolutionarily conserved and islet-specific miRNA (miR-375). Here we show that overexpression of miR-375 suppressed glucose-induced insulin secretion, and conversely, inhibition of endogenous miR-375 function enhanced insulin secretion. The mechanism by which secretion is modified by miR-375 is independent of changes in glucose metabolism or intracellular Ca2+-signalling but correlated with a direct effect on insulin exocytosis. Myotrophin (Mtpn) was predicted to be and validated as a target of miR-375. Inhibition of Mtpn by small interfering (si)RNA mimicked the effects of miR-375 on glucose-stimulated insulin secretion and exocytosis. Thus, miR-375 is a regulator of insulin secretion and may thereby constitute a novel pharmacological target for the treatment of diabetes.     

5-(5-甲酰基噻吩)- 10,20-苯基-15-萘基卟啉的合成研究

以吡咯和苯甲醛为原料合成了5-苯基-2,2′-二吡咯甲烷,利用[2+2]合成法合成了5-噻吩基-10,20-苯基-15-萘基卟啉,再利用Vilsmerier反应合成了目标化合物,目标化合物的结构经IR,MS和1 H NMR确证。考察了反应时间、物料比对目标化合物收率的影响,确定了最佳反应条件:物料比n(DMF)∶n(POCl3)∶n(化合物Ⅱ)=20∶20∶1,反应温度为以1,2-二氯乙烷为溶剂条件下的回流温度,反应时间为24h。     

血清miR-25、miR-223和miR-373作为食管鳞癌生物标志物的评价

为了探讨血清miRNA作为诊断标志物的可行性,利用茎环引物进行qRT-PCR,检测了miR-25、miR-223和miR-373在正常人血清、食管鳞癌患者术前和术后第7 d血清、癌组织和癌旁组织的相对表达量.实验结果表明:术前食管鳞癌病人的3种血清miRNA相对表达量高于正常人和手术后第7 d病人,AUC分别为0.794、0.839和0.873,癌组织的这3种miRNA相对表达量高于癌旁组织.这3种miRNA在食管癌患者癌组织的高表达导致血清的这3种miRNA含量增高,因此这3种血清miRNA可以作为候选诊断标志物.     

藻蓝色素蛋白通过调控miR-642a-5p抑制LTEP-a2细胞的增殖和迁移

研究藻蓝色素蛋白抑制非小细胞肺癌LTEP-a2体外增殖迁移的机制.以LTEP-a2细胞为模型,采用高通量miRNA转录组学对藻蓝蛋白处理后细胞中差异表达的miRNA进行了筛选;对筛选出的差异miRNA,利用体外转染mimics的方法对细胞的增殖、迁移能力进行验证.研究结果显示,藻蓝蛋白处理LTEP-a2细胞后能够显著增加细胞内miR-642a-5p的表达水平;过表达miR-642a-5p能够显著抑制细胞的体外增殖、迁移能力;此外,藻蓝蛋白可以通过上调miR-642a-5p表达抑制核受体NF-κB信号通路,降低蛋白磷酸化水平,进而抑制LTEP-a2细胞的增殖迁移能力.研究能够为藻蓝色素蛋白的应用以及非小细胞肺癌的治疗提供一定的理论基础.      

超声检查对早期诊断老年颈动脉硬化的应用研究

目的探讨超声检测对早发现、早诊断老年人颈动脉硬化的意义.方法采用HDI5000型彩色多普勒超声诊断仪探头L5-12MH2纵横切面法,对大同市第五人民医院住院和门诊高血压、冠心病、脑梗塞老年患者进行颈动脉结构和血流动力改变的检测.结果①该方法能准确明晰颈动脉不同部位的血流参数;②2/3患者有颈动脉1支或多支血管内膜-中层不同程度增厚,主要部位是颈总动脉分叉部和双侧颈总动脉;2/3以上患者有粥样硬化斑块形成,最易形成部位为颈总动脉分叉部,其次是颈内动脉.结论HDI5000型彩色多普勒超声诊断仪可为预示粥样硬化斑块形成提供确切依据,并能准确地给予定位和定性,评价其病变程度.故超声是早发现、早诊断老年人颈动脉硬化以及定位、定性的有效手段,将其应用于普查和筛查心脑血管疾病,具有不可估量的经济效益和社会意义.     

2-[1-(2-吡啶)乙氧基]乙酸-2-取代胺基乙酯的合成及其对小鼠学习记忆能力的影响

为探讨2-[1-(2-吡啶)乙氧基]乙酸2-取代胺基乙酯衍生物对小鼠学习记忆能力的影响,使用2-乙基吡啶为起始原料,经Whol-ziegler反应得到2-(1-溴乙基)吡啶(2),再与羟基乙酸乙酯的醇钠盐缩合得到2-[1-(2-吡啶)乙氧基]乙酸乙酯(3),化合物3与2-取代胺基乙醇在二丁基氧化锡催化下反应,得到目标产物2-[1-(2-吡啶)乙氧基]乙酸-2-取代胺基乙酯(4~12)。采用通道式水迷宫法测定了化合物(5,6,10)对小鼠学习记忆能力的影响。结果显示化合物6和10对400 mL/L乙醇所致小鼠学习记忆再现困难具有明显改善作用(P0.05)。     

室温/水相体系下纤维钯配合物催化Suzuki反应研究

以偕胺肟化的聚丙烯腈纤维为载体,制备了偕胺肟纤维-钯（Ⅱ）配合物[AOFs-Pd（Ⅱ）].考察了AOFsPd（Ⅱ）催化苯硼酸频哪醇酯与卤代芳烃Suzuki反应的催化性能.结果表明：在室温下,乙醇/水（V/V=2∶1,30mL）为溶剂,碳酸钾（10mmol）为碱,AOFs-Pd（Ⅱ）（0.1g）、苯硼酸频哪醇酯（6mmol）与碘苯（5mmol）反应时,产率能达到90%以上.而且本反应对于溴代苯及其衍生物和溴代杂环芳烃也具有良好的适应性.反应后催化剂易从反应体系中分离,并可以重复使用6次.